鄧玉潔，劉慧，羅友紅，史文杰，龐偉毅

(桂林醫(yī)學(xué)院,廣西桂林 541004)

·基礎(chǔ)研究·

苯并芘和4-溴聯(lián)苯醚聯(lián)合暴露對(duì)大鼠卵巢功能的影響及機(jī)制探討

鄧玉潔，劉慧，羅友紅，史文杰，龐偉毅

(桂林醫(yī)學(xué)院,廣西桂林 541004)

目的 觀察苯并芘和4-溴聯(lián)苯醚(BDE-3)單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)雌性大鼠卵巢功能的影響，并探討其可能的損傷機(jī)制。方法 將60只大鼠隨機(jī)分為4組，于動(dòng)情期A、B、C、組分別給予溶于玉米油的苯并芘、BDE-3、苯并芘聯(lián)合BDE-3 5 mg/(kg·d)等容灌胃法染毒暴露，D組給予玉米油5 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃28 d。于動(dòng)情間期眼球取血，脫椎處死并獲取卵巢組織。采用ELISA 法檢測(cè)血清孕酮，分別采用熒光定量PCR、Western blot法檢測(cè)卵巢組織中的芳香烴受體(AhR)mRNA、細(xì)胞色素P450家族成員1A1(CYP1A1)蛋白。結(jié)果 A、B、C組血清孕酮水平及卵巢組織AhR mRNA、CYP1A1蛋白相對(duì)表達(dá)量均較D組增高，且C組各指標(biāo)均高于A、B組(P均<0.05)；A、B組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 苯并芘和BDE-3暴露對(duì)卵巢功能產(chǎn)生損傷效應(yīng)，且聯(lián)合暴露可產(chǎn)生協(xié)同作用；其損傷機(jī)制可能是通過(guò)AhR調(diào)控CYP1A1表達(dá)，從而增強(qiáng)對(duì)卵巢組織的毒性效應(yīng)。

苯并芘；4-溴聯(lián)苯醚；孕酮；芳香烴受體；細(xì)胞色素P450；大鼠

苯并芘是多環(huán)芳烴類(lèi)(PAHs)中具有典型代表性的一種環(huán)境污染物，可刺激芳香烴受體(AhR)使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與芳香族化合物受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ARNT)結(jié)合并激活DNA上特定基因，如細(xì)胞色素P450家族成員1A1(CYP1A1)等，使DNA構(gòu)象發(fā)生改變，引起相應(yīng)靶基因的表達(dá)異常，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)[1,2]。多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是公認(rèn)的持久性有機(jī)物污染物，4-溴聯(lián)苯醚(BDE-3)是PBDEs脫溴最終降解的產(chǎn)物之一，具有生殖毒性、胚胎毒性、神經(jīng)發(fā)育毒性以及內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[3～5]。由于PAHs和PBDEs共存于大氣、水體和土壤環(huán)境中，毒效應(yīng)譜有較大重疊，易在生物體內(nèi)蓄積，影響人類(lèi)健康。因此，研究二者的聯(lián)合作用具有重要意義。2015年11月～2016年6月，我們觀察了苯并芘和BDE-3單獨(dú)及聯(lián)合暴露前后雌性大鼠血清孕酮水平變化，探討其對(duì)卵巢功能的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，8周齡，購(gòu)自桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK桂2007-0001，飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 主要試劑 玉米油(Acros公司)，苯并芘、二甲基亞砜(DMSO)、BDE-3(Sigma公司)；大鼠孕酮試劑盒(北京華英技術(shù)研究所)，Allprep組織/細(xì)胞RNA/DNA/Protein 分提試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)；Fast Quant RT Kit、SuperReal PreMix Plus(北京天根生化科技有限公司)，引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成；蛋白質(zhì)定量試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，兔抗鼠CYP1A1多克隆抗體(Millipore公司)，兔抗鼠β-actin多克隆抗體(Novusbio公司)。

1.1.3 主要儀器 微量核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo公司)，Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)(Protein Simple公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與染毒處理 將大鼠隨機(jī)分為4組，每組15只。于動(dòng)情期A、B、C、組分別給予溶于玉米油的苯并芘、BDE-3、苯并芘聯(lián)合BDE-3 5 mg/(kg·d)等容灌胃法染毒暴露，D組給予玉米油5 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃28 d。染毒結(jié)束后，于動(dòng)情間期眼球取血，脫椎處死并獲取卵巢組織。

1.2.2 血清孕酮檢測(cè) 將全血以3 000 r/min離心5 min，取上層血清，用ELISA法檢測(cè)血清孕酮。

1.2.3 卵巢組織AhR mRNA檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。采用Allprep劑盒提取卵巢組織的總RNA，按Fast Quant RT Kit合成cDNA，再用SuperReal PreMix Plus以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。AhR上游引物5′-GGCCAAGAGCTTCTTTGATG-3′，下游引物5′-TGCCAGTCTCTGATTTGTGC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度93 bp；β-actin上游引物5′-CTACAATGAGCTGCGTGTG-3′，下游引物5′-TGGGGTGTTGAAGGTCTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度121 bp。反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μL，正反向引物各0.75 μL，cDNA模板1 μL，50×ROX Reference Dye 0.05 μL，RNase-free ddH2O 9.95 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min； 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相對(duì)定量，以2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.4 卵巢組織CYP1A1蛋白檢測(cè) 采用Western blot法。用Allprep試劑盒提取卵巢組織的蛋白并溶于1% SDS溶液中，按BCA法測(cè)定蛋白濃度。按Wes配套試劑盒操作步驟制備樣品(終濃度為0.2 μg/μL)，再按說(shuō)明將樣品、生物素、封閉液、一抗、HRP標(biāo)記的二抗及化學(xué)發(fā)光液抗體等試劑加入上樣板，室溫離心5 min(2 500 r/min)后上機(jī)進(jìn)行全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析。Compass軟件將采集的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為蛋白分子量數(shù)據(jù)及相應(yīng)的表達(dá)圖譜，以樣本蛋白與內(nèi)參蛋白的峰值面積比值表示該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

各組大鼠血清孕酮水平及卵巢組織中AhR mRNA、CYP1A1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較。見(jiàn)表1。

表1各組大鼠血清孕酮水平及卵巢組織AhR mRNA、 CYP1A1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05；與B組比較，△P<0.05。

3 討論

大量研究[6～8]顯示，PAHs和PBDEs已成為多種腫瘤的危險(xiǎn)因素，與乳腺癌、卵巢癌等的發(fā)生密切相關(guān)。孕酮由卵巢和腎上腺產(chǎn)生，在應(yīng)激反應(yīng)和下丘腦-垂體-腎上腺/性腺軸的調(diào)節(jié)方面具有重要作用。研究顯示，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物具有非單調(diào)劑量-效應(yīng)性，表現(xiàn)為低劑量促進(jìn)而高劑量抑制。研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠出生前暴露于己烯雌酚(DES) 中，DES對(duì)前列腺發(fā)育產(chǎn)生低劑量增殖、高劑量抑制的倒U形劑量-效應(yīng)關(guān)系。Tian等[9]研究發(fā)現(xiàn),苯并芘染毒第3天櫛孔扇貝孕酮水平下降，而在第10天孕酮水平上升。表明苯并芘嚴(yán)重干擾了孕酮的正常波動(dòng)，導(dǎo)致卵巢功能障礙。本研究結(jié)果顯示，苯并芘和BDE-3暴露大鼠血清孕酮水平增加，可能是低劑量暴露呈現(xiàn)的激活效應(yīng)。

AhR是一類(lèi)配體激活轉(zhuǎn)錄子，參與數(shù)種基因的調(diào)控，如外源性代謝酶CYP450中CYP1A1的形成，可在卵巢中分泌類(lèi)固醇的間質(zhì)細(xì)胞、卵泡顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞中表達(dá)；被激活的CYP1A1能將環(huán)境中的多種有機(jī)物質(zhì)如PAHs轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒素或其他致癌物質(zhì)，從而增加癌癥發(fā)生危險(xiǎn)。有研究[10,11]顯示，苯并芘能激活A(yù)hR誘導(dǎo)CYP450轉(zhuǎn)錄表達(dá)，將苯并芘代謝為活性化合物7，8-二氫二醇-9，10-環(huán)氧苯并(a)芘，與DNA形成加合物，導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞中活性氧的形成，從而損傷卵巢功能。Sobinoff等[7]發(fā)現(xiàn)，在卵巢中苯并芘通過(guò)激活A(yù)hR誘導(dǎo)CYP450代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)，使基因表達(dá)、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)等受影響，可激活未成熟的原始卵泡、損傷卵母細(xì)胞并使生長(zhǎng)卵泡發(fā)生閉鎖，導(dǎo)致組織發(fā)生損傷效應(yīng)。有研究[12,13]顯示，PBDEs可能通過(guò)激活A(yù)hR或誘導(dǎo)CYP450高表達(dá)等發(fā)揮致癌、致突變功能。Talsness等[14]研究發(fā)現(xiàn)，孕期雌性大鼠暴露于PBDEs，可導(dǎo)致卵巢細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，影響生殖功能。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于苯并芘的研究較多，BDE-3的研究較少，而同時(shí)探討兩者在哺乳動(dòng)物體內(nèi)聯(lián)合效應(yīng)的研究更少。本研究結(jié)果顯示，苯并芘、BDE-3染毒的大鼠血清孕酮及卵巢組織中AhR和CYP1A1表達(dá)水平均較未染毒大鼠明顯增高，且聯(lián)合暴露較于苯并芘和BDE-3的單獨(dú)作用各指標(biāo)增高更明顯。因此，我們認(rèn)為苯并芘和BDE-3暴露對(duì)卵巢功能產(chǎn)生損傷效應(yīng)，且聯(lián)合暴露可產(chǎn)生協(xié)同作用；其損傷機(jī)制可能是通過(guò)AhR調(diào)控CYP1A1表達(dá)，從而增強(qiáng)對(duì)卵巢組織的毒性效應(yīng)。然而，關(guān)于兩者協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1] Barouki R, Coumoul X, Fernandez-Salguero PM. The aryl hydrocarbon receptor, more than a xenobiotic-interacting protein[J]. FEBS Lett, 2007,581(19):3608-3615.

[2] Stejskalova L, Dvorak Z, Pavek P. Endogenous and exogenous ligands of aryl hydrocarbon receptor: current state of art[J]. Curr Drug Metab, 2011,12(2):198-212.

[3] Birnbaum LS, Staskal DF. Brominated flame retardants: cause for concern[J]. Environ Health Perspect, 2004,112(1):9-17.

[4] 萬(wàn)斌,郭良宏.多溴聯(lián)苯醚的環(huán)境毒理學(xué)研究進(jìn)展[J].環(huán)境化學(xué),2011,30(1):143-152.

[5] Darnerud PO, Risberg S. Tissue localisation of tetra- and pentabromodiphenyl ether congeners (BDE-47, -85 and -99) in perinatal and adult C57BL mice[J]. Chemosphere, 2006,62(3):485-493.

[6] Guo J, Xu Y, Ji W, et al. Effects of exposure to benzo[a]pyrene on metastasis of breast cancer are mediated through ROS-ERK-MMP9 axis signaling[J]. Toxicol Lett, 2015,234(3):201-210.

[7] Sobinoff AP, Pye V, Nixon B, et al. Jumping the gun: smoking constituent BaP causes premature primordial follicle activation and impairs oocyte fusibility through oxidative stress[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2012,260(1):70-80.

[8] Aschebrook-Kilfoy B, Dellavalle CT, Purdue M, et al. Polybrominated diphenyl ethers and thyroid cancer risk in the Prostate, Colorectal, Lung, and Ovarian Cancer Screening Trial cohort[J]. Am J Epidemiol, 2015,181(11):883-888.

[9] Tian S, Pan L, Sun X. An investigation of endocrine disrupting effects and toxic mechanisms modulated by benzo pyrene in female scallop chlamys farreri[J]. Aquat Toxicol, 2013，144-145:162-171.

[10] Ramesh A, Archibong AE, Niaz MS. Ovarian susceptibility to benzo(a)pyrene: tissue burden of metabolites and DNA adducts in F-344 rats[J]. J Toxicol Environ Health A, 2010,73(23):1611-1625.

[11] Safe S, McDougal A. Mechanism of action and development of selective aryl hydrocarbon receptor modulators for treatment of hormone-dependent cancers[J]. Int J Oncol, 2002,20(6):1123-1128.

[12] 王若希,劉曉暉,邵靜,等.多溴聯(lián)苯醚致癌效應(yīng)研究進(jìn)展[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2012,13(12):947-950.

[13] Courter LA, Musafia-Jeknic T, Fischer K, et al. Urban dust particulate matter alters PAH-induced carcinogenesis by inhibition of CYP1A1 and CYP1B1[J]. Toxicol Sci, 2007,95(1):63-73.

[14] Talsness CE, Shakibaei M, Kuriyama SN, et al. Ultrastructural changes observed in rat ovaries following in utero and lactational exposure to low doses of a polybrominated flame retardant[J]. Toxicol Lett, 2005,157(3):189-202.

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013GXNSFBA019190)；廣西高校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2013ZD044)。

龐偉毅(E-mail： p.weiyi@live.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.008

R114

A

1002-266X(2017)18-0026-03

2017-02-23)