張玉峰，葉坤英，鐘丹

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州450002；2井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院 )

胃癌細(xì)胞來源的exosomes對Jurkat T細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制探討

張玉峰1，葉坤英1，鐘丹2

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州450002；2井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院 )

目的 觀察胃癌細(xì)胞來源的外來體exosomes對Jurkat T細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的機(jī)制。方法 將人低分化胃腺癌細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)、傳代等處理，分離獲得外來體exosomes。將消化后的Jurkat T細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組與對照組，觀察組分別加入50、100、200、400 μg/mL的exosomes，對照組不加exosomes，采用流式細(xì)胞儀測算培養(yǎng)12、24 h 時Jurkat T細(xì)胞凋亡率,免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測培養(yǎng)24 h時Jurkat T細(xì)胞中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspases-3)、Caspase-8。結(jié)果 與對照組比較，觀察組隨著exosomes濃度增加及作用時間的延長，Jurkat T細(xì)胞凋亡率均增加(P均<0.05)；與對照組比較，觀察組Jurkat T細(xì)胞中的Caspases-3、Caspase-8蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 胃癌細(xì)胞來源的外來體exosomes可誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡，該作用與其上調(diào)Caspases-3、Caspase-8蛋白表達(dá)有關(guān)。

胃癌；外來體exosomes；Jurkat T細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病，細(xì)胞凋亡異常是引發(fā)惡性腫瘤的主要原因之一[1,2]。細(xì)胞凋亡是一個生理性自我毀滅過程，在維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞防御等方面均起到非常重要的作用。在細(xì)胞凋亡過程中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)家族是介導(dǎo)者及執(zhí)行者[3～5]；其可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致機(jī)體免疫監(jiān)視能力下降，從而發(fā)生腫瘤免疫耐受[6～8]，但具體機(jī)制尚不十分清楚。exosomes來源于多囊體的膜被囊泡，可由多種活細(xì)胞分泌，具有獨(dú)特的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分，是近年來研究的熱點(diǎn)之一。Jurkat T細(xì)胞是人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株，屬于CD4+T 淋巴細(xì)胞；研究Jurkat T細(xì)胞能反映細(xì)胞免疫變化，如腫瘤中出現(xiàn)Jurkat T細(xì)胞凋亡則提示免疫耐受發(fā)生。2016年6～10月，我們觀察了胃癌細(xì)胞來源的exosomes對Jurkat T細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的機(jī)制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人低分化胃腺癌細(xì)胞株872-3及Jurkat T細(xì)胞購自上海艾研生物科技有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自天津血液病研究所；CyFlow?Cube8流式細(xì)胞儀購自Partec公司。兔抗人Caspase-3和Caspase-8抗體均購自Lab Vision公司，辣根過氧化物標(biāo)記的兔抗羊、羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；SIGMA 6K15冷凍離心機(jī)購自Sigma公司，722S分光光度儀購自上海精密科學(xué)儀器有限公司，HH-SH-1水浴箱購自北京長安科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胃癌細(xì)胞來源exosomes的獲取 將低分化胃腺癌細(xì)胞株872-3接種在加有胎牛血清及12 kU/L慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；以0.25%胰酶消化傳代，每2～3天傳代1次。收集培養(yǎng)細(xì)胞的上清液，去除細(xì)胞及碎片，經(jīng)離心、加MWCOAmicon等處理后，所得濃縮液即為exosomes。取部分exosomes進(jìn)行超速離心沉淀，加2%多聚甲醛和0.25%戊二醛固定；PBS液洗滌3次(15 min/次)，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂浸透過夜；經(jīng)包埋、切片、鉛鈾染色等處理后，電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。電鏡下細(xì)胞形態(tài)為圓球體，有盤狀脂質(zhì)膜包繞，形態(tài)大小不一，直徑在30～100 nm,成功制備exosomes。

1.2.2 Jurkat T細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 將Jurkat T細(xì)胞接種在加有胎牛血清及12 kU/L慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；以0.25%胰酶消化液消化傳代，每2～3天傳代1次。將消化后的Jurkat T細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種在96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液。將細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組與對照組，對照組不加exosomes，觀察組分別加入50、100、200、400 μg/mL濃度的exosomes，放入37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3 Jurkat T細(xì)胞凋亡率測算 采用流式細(xì)胞術(shù)。分別于培養(yǎng)12、24 h取兩組細(xì)胞，分離取得沉淀細(xì)胞，收集在流式細(xì)胞管中。用PBS洗滌2次，加冷70%的乙醇過夜；再用PBS洗滌2次，加20 mg/L的RNase A在37 ℃下孵育30 min；再加入20 mg/L的PI，避光孵育30 min。上流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞，DNA無法被染色或可染性降低為凋亡細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Jurkat T細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8蛋白檢測 采用Western blot法。取對照組及觀察組400 μg/mL exosomes培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，用0.1%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，以PBS沖洗2次(5 min/次)。加入蛋白裂解液，冰上放置15～20 min；在4 ℃下以1 200 r/min離心5 min，提取蛋白；進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將分離膠底部轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜上；硝酸纖維素膜上滴加Caspase-3與Caspase8抗體，4 ℃下過夜； PBS洗滌后，加二抗孵育過夜；PBS洗滌，DAB顯色、封片，以電泳條帶灰度值表示Caspase-3、Caspase-8的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組Jurkat T細(xì)胞凋亡率比較 與對照組比較，觀察組隨著exosomes濃度增加、作用時間的延長Jurkat T細(xì)胞凋亡率逐漸增加(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組Jurkat T細(xì)胞凋亡率比較

注：與對照組同時點(diǎn)比較，*P<0.05；與觀察組上一濃度比較，#P<0.05；與觀察組同濃度12 h時比較，△P<0.05。

2.2 兩組Jurkat T細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，觀察組Jurkat T細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)均增加(P均<0.05)。見表2。

表2兩組Jurkat T細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8蛋白表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

腫瘤的免疫治療已成為臨床研究的熱點(diǎn)，但仍有很多問題尚未研究清楚。免疫缺陷及免疫耐受等是影響免疫治療療效的主要原因，而研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞分泌的exosomes能誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生免疫耐受[6,7]，導(dǎo)致機(jī)體的免疫監(jiān)視功能下降，但具體機(jī)制尚不十分清楚。

細(xì)胞凋亡是一個生理性的細(xì)胞自我毀滅過程，在胚胎發(fā)育、生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞防御內(nèi)外傷害等方面起到非常重要的作用。exosomes最先是由Trams等在1981年被研究發(fā)現(xiàn)，是由活細(xì)胞分泌產(chǎn)生的，具有影響細(xì)胞凋亡的作用，與細(xì)胞壞死碎片和凋亡小體有明顯區(qū)別[11]。exosomes是細(xì)胞膜內(nèi)陷形成的早期內(nèi)體，內(nèi)體內(nèi)有多量的小泡多泡體，這種多泡體可與細(xì)胞膜融合，將小泡釋放在泡外空間，這種小泡即為exosomes。很多類型的細(xì)胞均能釋放exosomes，但主要由免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞釋放。腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞釋放的exosomes可表達(dá)熱休克蛋白、共刺激分子、腫瘤抗原等，因此可誘導(dǎo)機(jī)體的抗腫瘤效應(yīng)，具有抗腫瘤作用。近年來臨床大量研究顯示[12～15]，exosomes在體內(nèi)能直接表現(xiàn)為免疫抑制。曲晶磊等[14]研究顯示，胃細(xì)胞來源的exosomes有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖作用，其作用機(jī)制是通過激活PI3K和MAPK/ERK信號通路來實(shí)現(xiàn)的。有研究結(jié)果顯示，exosomes可通過抑制T細(xì)胞活化的信號分子JAK3來誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[8]，可下調(diào)NK細(xì)胞表面的NKG2D表達(dá)[9,10]，認(rèn)為可能是通過以上途徑來起到免疫抑制作用。楊林等[15]研究了腎癌細(xì)胞來源的exosomes介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的機(jī)制，結(jié)果顯示Jurat T細(xì)胞凋亡增加，在細(xì)胞凋亡過程中存在Caspase-3、8、9表達(dá)上調(diào)。

在細(xì)胞凋亡過程中，Caspases家族中一類為起始者、一類為執(zhí)行者。起始者Caspase可在外來蛋白信號的作用下被激活，然后激活執(zhí)行者Caspase并水解Caspase靶蛋白，啟動細(xì)胞的凋亡程序。Caspase-2、8、9、10屬于起始者，Caspase-3、6、7屬于執(zhí)行者，起始者可活化執(zhí)行者，兩者之間是上下游的關(guān)系。其中，Caspases-3、Caspase-8是在執(zhí)行與起始中處于核心地位的兩種蛋白酶，在凋亡的多途徑信號通路關(guān)鍵步驟中均有參與。研究[16～20]發(fā)現(xiàn)，Caspase-8活化時特異性識別Caspase-3抑制酶(DEVD)，能剪切多聚ADP-核糖聚合酶，經(jīng)“誘導(dǎo)接近模式”活化后可引發(fā)Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步水解激活下游的同源酶(如Caspase-6、3、7)；這種反應(yīng)是在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，可在細(xì)胞質(zhì)中裂解Bcl-2家庭成員Bid，裂解產(chǎn)物的羧基片段tBid可轉(zhuǎn)移在線粒體上，誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，促使死亡受體通路與線粒體通路聯(lián)系起來，最后發(fā)生凋亡激活生物效應(yīng)。Caspase-3屬于效應(yīng)性Caspase，是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵元件，其異常表達(dá)可引起細(xì)胞凋亡。Caspase-3在凋亡的級聯(lián)反應(yīng)下游，是凋亡的執(zhí)行者。其引起凋亡的機(jī)制主要是對某些蛋白質(zhì)進(jìn)行切割，通過阻滯細(xì)胞周期、促使細(xì)胞從周圍組織結(jié)構(gòu)中脫落、破壞細(xì)胞的自我修復(fù)機(jī)制、引起維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的物質(zhì)解體等途徑來誘發(fā)細(xì)胞凋亡[19～21]；另外，其可通過對Fas介導(dǎo)的死亡信號途徑來抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，催化參與DNA修復(fù)的聚合酶發(fā)生裂解；同時，其還可引起Caspase活化DNA酶(CAD)、DNA片段化因子(DFF)等核酸內(nèi)切酶活化，使DNA在核小體連接處被切割，產(chǎn)生DNA片段，進(jìn)而裂解細(xì)胞骨架蛋白、核蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白和看家蛋白，引起細(xì)胞形態(tài)發(fā)生異常，導(dǎo)致細(xì)胞與環(huán)境間的聯(lián)系被割斷，最終引起細(xì)胞凋亡。本研究對胃癌細(xì)胞來源的exosomes誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡時Caspases-3、Caspase-8表達(dá)變化進(jìn)行研究，結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞來源的exosomes能明顯誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡，且隨時間推移及濃度增加Jurkat T細(xì)胞凋亡率隨之增加，同時可引起Caspases-3、Caspase-8表達(dá)上調(diào)。

綜上所述，胃癌細(xì)胞來源的外來體exosomes可誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過上調(diào)Caspases-3、Caspase-8表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，但是具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步深入研究。進(jìn)一步深入研究胃癌細(xì)胞來源的exosomes誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡機(jī)制，可為胃癌的免疫靶向治療提供了一個新的思路。

[1] Weiss JM, Gregory Alvord W, Quiones OA, et al. CD40 expression in renal cell carcinoma is associated with tumor apoptosis, CD8(+) T cell frequency and patient survival[J]. Hum Immunol, 2014,75(7):614-620.

[2] Song T, Dou CW, Jia YL, et al. TIMP-1 activated carcinoma-associated fibroblasts inhibit tumor apoptosis by activating SDF1/CXCR4 signaling in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2015,6(14):12061-12079.

[3] Mcilwain DR, Berger T, Mak TW. Caspase functions in cell death and disease[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2013,5(4):a008656.

[4] Segawa K, Kurata S, Yanagihashi YA, et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure[J]. Science, 2014,344(6188):1164-1168.

[5] Mccallister CM, Rayavarapu R, Pagani N, et al. Ras-mediated regulation of cytochrome c-induced caspase activation is dependent on the status of extracellular matrix attachment[J]. Cancer Res, 2016,76(14 Supplement):3563-3563.

[6] Raposo G, Stoorvogel W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends[J]. J Cell Biol, 2013,200(4):373-383.

[7] Thakur BK, Zhang H, Becker A, et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection[J]. Cell Res, 2014,24(6):766-769.

[8] Candelario KM, Steindler DA. The role of extracellular vesicles in the progression of neurodegenerative disease and cancer[J]. Trends Mol Med, 2014,20(7):368-374.

[9] Labani-Motlagh A, Israelsson P, Ottander U, et al. Differential expression of ligands for NKG2D and DNAM-1 receptors by epithelial ovarian cancer-derived exosomes and its influence on NK cell cytotoxicity[J]. Tumor Biology, 2016,37(4):5455-5466.

[10] Chitadze G, Bhat J, Lettau M, et al. Generation of soluble NKG2D ligands: proteolytic cleavage, exosome secretion and functional implications[J]. Scand J Immunol, 2013,78(2):120-129.

[11] 楊云山,鐘海均,林能明.腫瘤細(xì)胞來源的Exosomes的研究進(jìn)展[J].中國腫瘤生物治療雜志,2014,21(4):477-481.

[12] 于慧杰,李峰生,何蕊,等.樹突狀細(xì)胞來源Exosomes治療腫瘤的研究進(jìn)展[J].中國免疫學(xué)雜志,2013,29(9):1007-1008.

[13] 郭杏丹,賀修勝,吳冬梅,等.Exosomes在腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)移中的研究進(jìn)展[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2013,29(12):1348-1350.

[14] 曲晶磊,張文,劉云鵬,等.PI3K/Akt 和 MAPK/ERK 信號通路在胃癌細(xì)胞來源的 Exosome 促進(jìn)同源腫瘤細(xì)胞增殖中的作用[J].世界華人消化雜志,2011,19(11):1109-1114.

[15] 楊林,吳小候,羅春麗,等.腎癌細(xì)胞來源的exosomes誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2013,35(5):426-430.

[16] Kang TB, Yang SH, Toth B, et al. Caspase-8 blocks kinase RIPK3-Mediated activation of the NLRP3 inflammasome[J]. Immunity, 2013,38(1):27-40.

[17] Gurung P, Anand PK, Malireddi R, et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes[J]. J Immunol, 2014,192(4):1835-1846.

[18] Weinlich R, Oberst A, Dillon CP, et al. Protective roles for caspase-8 and cFLIP in adult homeostasis[J]. Cell Rep, 2013,5(2):340-348.

[19] Nguyen QD, Lavdas I, Gubbins J, et al. Temporal and spatial evolution of therapy-induced tumor apoptosis detected by caspase-3-selective molecular imaging[J]. Clin Cancer Res, 2013,19(14):3914-3924.

[20] Jiang H, Zhang L, Liu J, et al. Knockdown of Zinc finger protein X-linked inhibits prostate cancer cell proliferation and induces apoptosis by activating caspase-3 and caspase-9[J]. Cancer Gene Ther, 2012,19(10):684-689.

[21] Chakraborty D, Bishayee K, Ghosh S, et al. 6-Gingerol induces caspase 3 dependent apoptosis and autophagy in cancer cells: Drug-DNA interaction and expression of certain signal genes in HeLa cells[J]. Eur J Pharmacol, 2012,694(1/3):20-29.

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[1] 杜賈軍,孟龍,陳景寒,等.手輔助電視胸腔鏡食管切除胃食管胸內(nèi)吻合術(shù)[J].山東醫(yī)藥,2004,44(27):1-3.

[2] Takano M, Mizuno K, Okamatsu K, et al. Mechanical and structural characteristics of vulnerable plaques: analysis by coronary angioscopy and intravascular ultrasound[J]. J Am Coll Cardiol, 2002,38(1):99-104.

[3] 葉任高,陸再英.內(nèi)科學(xué)[M].5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:277-280.

Effect of exosomes derived from gastric cancer cells on apoptosis of Jurkat T cells

ZHANGYufeng1,YEKunying,ZHONGDan

(1TheSecondClinicalMedicalCollegeofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450002,China)

Objective To observe the effect of exosomes derived from gastric cancer cells on apoptosis of Jurkat T cells and to discuss the possible mechanism. Methods Exosomes was separated by culturing low differentiated gastric cancer cell strains. The digested Jurkat T cells were divided into the observation group and control group (without esosomesexosomes), cells in the the observation group were respectively added with 50, 100, 200, and 400 μg/mL esosomesexosomes. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of Jurkat T cells at 12 and 24 h, and the expression of Aspartic proteinase Caspase-3 and Caspase-8 in Jurkat T cells was tested by immunocytochemistry.Results The apoptosis of Jurkat T cells in the observation group increased with the increasing concentrations of exosomes and the prolonged time as compared with that of the control group (allP<0.05). The expression of Caspases-3 and Caspase-8 in the Jurkat T cells increased in observation group as compared with that of the control group and the difference was statistically significant (allP<0.05).Conclusion Exosomes derived from gastric cancer cell strains induces the apoptosis of Jurkat T cells, and it may related to the up-regulated expression of Caspases-3 and Caspase-8.

gastric carcinoma; exosomes; Jurkat T cells; cell apoptosis; Caspase

河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題資助項(xiàng)目(2014ZY02027)。

張玉峰(1969-)，男，副教授，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治消化病。E-mail: zhouyihb@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.002

R735.2

A

1002-266X(2017)18-0005-04

2017-01-03)