隋博文李明爽王 達(dá)許湘源翟平平李明虎王 浩

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

·研究報(bào)告·

IL-17A、TNF-α在哮喘小鼠模型氣道炎癥中的變化及射干麻黃湯的干預(yù)作用研究*

隋博文1李明爽2王 達(dá)2許湘源1翟平平2李明虎2王 浩2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

目的 觀察細(xì)胞因子白介素-17A（IL-17A）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在慢性哮喘小鼠模型氣道炎癥中的變化及射干麻黃湯的干預(yù)作用。方法 60只Balb/c小鼠小鼠隨機(jī)分為模型組（A組）、中藥湯劑組（B組）、對(duì)照組（C組）、地塞米松組（D組）4組。采用卵蛋白（OVA）、氫氧化鋁聯(lián)合霧化吸入的方法建立慢性哮喘小鼠模型，并通過不同方式對(duì)各組進(jìn)行干預(yù)。取離心后的支氣管肺泡灌洗液（BALF）中沉渣計(jì)細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，取上清液以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測細(xì)胞因子IL-17A、TNF-α的含量。觀察IL-17A、TNF-α在慢性哮喘小鼠模型氣道炎癥中的變化及射干麻黃湯的干預(yù)作用。結(jié)果 與C組相比，A、B、D組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間均出現(xiàn)被毛凌亂、少光澤、活動(dòng)及進(jìn)食減少、反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，在霧化激發(fā)時(shí)均出現(xiàn)不同程度的躁動(dòng)、騷鼻、呼吸急促、點(diǎn)頭樣呼吸、口唇青紫等癥狀，其中B、D組上述癥狀明顯較A組輕。實(shí)驗(yàn)過程中A、D組小鼠各死亡1例，B、C組無死亡。與C組比較，A組BALF中細(xì)胞總數(shù)及NEU、EOS、LYM百分率均顯著增多（均P＜0.01）；與A組比較，B、D組細(xì)胞數(shù)及NEU、EOS、LYM百分率均降低（均P＜0.05）。D組與B組比較差別不大P＞0.05）。與C組比較，A組細(xì)胞因子IL-17A、TNF-α含量增高（P＜0.05）。與A組比較，B、D組細(xì)胞因子IL-17A、TNF-α含量均減少（均P＜0.05）；D組與B組比較差別不大（P＞0.05）。提示細(xì)胞因子IL-17、TNF-α在介導(dǎo)哮喘氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。IL-17A、TNF-α與氣道炎癥均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 射干麻黃湯可能通過下調(diào)細(xì)胞因子IL-17A、TNF-α來抑制炎癥細(xì)胞在哮喘小鼠氣道內(nèi)的聚集，從而減輕氣道炎癥。

哮喘 IL-17A TNF-α 氣道炎癥 射干麻黃湯

支氣管哮喘簡稱哮喘，是由多種炎癥細(xì)胞（嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾?。?］。近些年隨著大氣環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)、社會(huì)環(huán)境等因素的改變，哮喘發(fā)病率呈逐年上升趨勢［2］。細(xì)胞因子白介素-17A（IL-17A）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）作為哮喘氣道炎癥的重要參與因子成為研究熱點(diǎn)。IL-17A是一種由Th17等多種效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可通過各種不同方式調(diào)節(jié)微環(huán)境中細(xì)胞因子、趨化因子、黏附性分子等表達(dá)，募集炎癥細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞而發(fā)揮炎癥效應(yīng)，參與炎癥性疾病［3］。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，適當(dāng)水平的TNF-α有利于組織修復(fù)、炎癥應(yīng)答，而高水平的TNF-α卻能使局部血管的通透性增強(qiáng)，從而促進(jìn)支氣管活性物質(zhì)釋放［4］。臨床研究表明［5-6］，射干麻黃湯能夠改善哮喘癥狀，減輕氣道炎癥細(xì)胞聚集，但其具體作用機(jī)制尚未完全清楚。本研究通過觀察射干麻黃湯干預(yù)哮喘模型小鼠后，觀察其IL-17A、TNF-α及各項(xiàng)炎癥指標(biāo)的變化，初步探討射干麻黃湯治療哮喘的作用及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，共60只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（黑）2013-004］，以小鼠專用飼料及飲用水喂養(yǎng)。按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組（A組）、中藥湯劑組（B組）、對(duì)照組（C組）、地塞米松組（D組）4組，每組15只。

1.2 藥物與試劑 射干麻黃湯（射干9 g，麻黃12 g，法半夏12 g，紫菀9 g，款冬花9 g，大棗12 g，細(xì)辛3 g，生姜12 g，五味子12 g）由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室提供。地塞米松針劑（5 mg/1 mL）由天津天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。雞卵清蛋白（OVA，Ⅴ級(jí)）：由美國Sigma公司生產(chǎn)。小鼠IL-17、TNF-α ELISA試劑盒，由美國R＆D公司生產(chǎn)。氫氧化鈉，由天津市巴斯夫化工有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器 超聲霧化吸入器BSW-2A，鞍山貝爾思科技有限公司生產(chǎn)；玻璃霧化箱（60 cm×50 cm×40 cm），自制；低溫高速離心機(jī)XR-22，美國BECKMAN COULTER公司；電熱恒溫干燥箱202-0A型，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.4 造模及藥物干預(yù) 依據(jù)喬明等人的方案［7］利用OVA被動(dòng)致敏并激發(fā)的方法建立哮喘小鼠模型。A、B、D組分別在實(shí)驗(yàn)第1日和實(shí)驗(yàn)第14日經(jīng)腹腔注射0.2 mL致敏混懸液 （含20 μg OVA和100 μg氫氧化鋁）致敏，C組經(jīng)腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。第21日起，A、B、D組小鼠放于玻璃霧化箱中給予2.5%OVA混懸液霧化激發(fā)，每次約30 min，隔日1次，C組給予等量0.9%氯化鈉注射液霧化。B組在每次霧化前給予射干麻黃湯（4.1 g/mL）灌胃，射干麻黃湯藥物劑量根據(jù)陳奇等［8］關(guān)于藥物劑量計(jì)算公式推算出，A、C組以等量0.9%氯化鈉注射液代替。共霧化8周。

1.5 支氣管肺泡灌洗液（BALF）收集與指標(biāo)檢測 各組小鼠最后一次霧化后24 h內(nèi)，以4%水合氯醛麻醉小鼠，打開胸腔，在左主支氣管處結(jié)扎左肺，以冰磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）灌洗右肺，反復(fù)共3次，每次入量為0.3 mL，灌洗時(shí)可適當(dāng)按摩胸部，以便灌洗充分。每只小鼠BALF回收率大于80%為合格標(biāo)本。計(jì)細(xì)胞總數(shù)，離心，沉淀重懸涂片，染色，行炎癥細(xì)胞分類［中性粒細(xì)胞（NEU）、嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）、淋巴細(xì)胞（LYM）］計(jì)數(shù)。BALF中的上清液用ELISA法檢測IL-17A及TNF-α水平，操作方法嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書上進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)資料以（±s）來表示，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠哮喘發(fā)作行為特點(diǎn) 與C組相比，A、B、D組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間均出現(xiàn)被毛凌亂、少光澤、活動(dòng)及進(jìn)食減少、反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，在霧化激發(fā)時(shí)均出現(xiàn)不同程度的躁動(dòng)、騷鼻、呼吸急促、點(diǎn)頭樣呼吸、口唇青紫等癥狀，其中B、D組上述癥狀明顯較A組輕。實(shí)驗(yàn)過程中A、D組小鼠各死亡1例，B、C組無死亡。

2.2 各組小鼠氣道炎癥細(xì)胞參數(shù)比較 見表1。結(jié)果示，與C組比較，A組BALF中細(xì)胞總數(shù)及NEU、EOS、LYM百分率均顯著增多（均P＜0.01）。與A組比較，B、D組細(xì)胞數(shù)及NEU、EOS、LYM百分率均降低 （均P＜0.05）。D組與B組比較差別不大（P＞0.05）。

2.3 各組小鼠IL-17A、TNF-α含量比較 見表2。與C組比較，A組細(xì)胞因子IL-17A、TNF-α含量增高（P＜0.05）。與A組比較，B、D組細(xì)胞因子IL-17A、TNF-α含量均減少（均P＜0.05）。D組與B組比較差別不大（P＞0.05）。

2.4 射干麻黃湯組IL-17A、TNF-α與氣道炎癥相關(guān)性分析 見表3。結(jié)果示，IL-17A、TNF-α與氣道炎癥均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

表1 各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞的數(shù)量（×105/L，，±s）

表1 各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞的數(shù)量（×105/L，，±s）

與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，△P＜0.01。下同。

組別 n 細(xì)胞總數(shù) NEU EOS IYM A組 14 B組 15 C組 15 4.55±0.26△27.97±9.62△35.65±7.58△38.14±2.43△1.63±0.22*10.26±1.80*12.26±2.54*11.14±4.29*0.88±0.35 9.01±1.34 4.95±3.11 2.24±8.41 D組 141.59±0.32 10.11±1.02 11.08±1.89 13.25±2.46

表2 各組小鼠BALF中細(xì)胞因子IL-17 A、TNF-α含量比較（±s）

表2 各組小鼠BALF中細(xì)胞因子IL-17 A、TNF-α含量比較（±s）

組 別 n IL-17A（pg/mL） TNF-α（μg/L）A組 14 293.73±20.20△2.68±0.03△B組 15 237.66±32.49*1.85±0.11*C組 15 220.32±19.22 1.15±0.08 D組 14 240.13±13.56 1.81±0.34

表3 射干麻黃湯組IL-17A、TNF-α與氣道炎癥相關(guān)性分析

3 討 論

氣道炎癥是哮喘發(fā)作期的主要病理特征之一，IL-17A作為Th17細(xì)胞的重要效應(yīng)因子，通過與大量1L-17A受體結(jié)合，在促炎反應(yīng)中發(fā)揮巨大作用。研究發(fā)現(xiàn)［9］1L-17A能通過誘導(dǎo)細(xì)胞分泌、釋放多種中性粒細(xì)胞趨化因子（1L-6、1L-8、粒細(xì)胞集落刺激因子、前列腺素等）及通過加速中性粒細(xì)胞發(fā)育成熟速度來誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［10］。吳紅梅等通過研究發(fā)現(xiàn)，哮喘發(fā)作期患者血清1L-17A明顯升高［11］。TNF-α是哮喘氣道中的前炎性細(xì)胞因子，又是哮喘炎癥過程中重要啟動(dòng)因子，可以刺激氣道引起IL-8、GM-CSF等分泌增加而加重氣道炎癥，并協(xié)同IL-4合成IgE促使哮喘發(fā)作［12］，其又能夠增強(qiáng)呼吸道血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，炎性細(xì)胞等包括中性粒細(xì)胞等黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，再從血循環(huán)滲入氣道黏膜組織，致使黏附分子異常表達(dá)，氣道炎癥反應(yīng)發(fā)生［13］。大量研究提示，無論何種類型的哮喘皆有TNF-α異常高表達(dá)［14］。以上實(shí)驗(yàn)及臨床觀察均表明1L-17A、TNF-α起到了聚集炎癥細(xì)胞的作用，二者的異常高表達(dá)可促進(jìn)氣道炎癥發(fā)生。

支氣管哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“哮病”范疇，本因宿有伏痰，每因感受外邪或內(nèi)傷七情而發(fā)［15］。射干麻黃湯出自《金匱要略》，是治療哮證（冷哮）的經(jīng)典方劑。方中麻黃、細(xì)辛、生姜、款冬花均能宣肺化飲，其中麻黃重于宣發(fā)，細(xì)辛重于化飲，生姜重于宣透，款冬花重于宣散；法半夏、射干、紫菀降肺化飲，法半夏又可醒脾燥濕，射干兼能利肺消痰，紫菀長于下氣消痰；五味子斂肺益氣；大棗益氣和中，調(diào)和諸藥。方中各藥相互為用，達(dá)“溫肺化飲，下氣祛痰”之效［16］。西醫(yī)藥理學(xué)研究證實(shí)，射干麻黃湯主要通過降低痰液黏稠度，增加呼吸道纖毛運(yùn)動(dòng)幅度，促進(jìn)氣道分泌物排出來發(fā)揮其祛痰、平喘、抗炎的治療作用［17］，同時(shí)還能減少哮喘豚鼠發(fā)作頻率，減輕發(fā)作程度，減少小鼠肺內(nèi)炎癥物質(zhì)滲出［18］。王永勝在臨床觀察中，發(fā)現(xiàn)射干麻黃湯在改善患者胸悶、氣短、咳嗽、咯痰、喘息癥狀等方面效果顯著，且能減少肺部病理性雜音［19］，表明射干麻黃湯的確能通過能減輕氣道炎癥，進(jìn)而改善哮喘患者（或小鼠）哮喘癥狀。朱璐卡等通過觀察射干麻黃湯治療后的支氣管哮喘患兒，發(fā)現(xiàn)患兒血清中TNF-α皆有降低，因此認(rèn)為射干麻黃湯能通過降低TNF-α來治療哮喘［20］。曹琿的研究也進(jìn)一步驗(yàn)證了射干麻黃湯減輕氣道炎癥是通過降低IL-17A、TNF-α水平來實(shí)現(xiàn)的［1］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，哮喘組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和NEU、EOS、LYM均明顯增高，BALF中細(xì)胞因子IL-17A、TNF-α的水平較對(duì)照組亦明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)IL-17A、TNF-α確實(shí)參與了哮喘的氣道炎癥過程。經(jīng)過射干麻黃湯治療后的小鼠，細(xì)胞總數(shù)和NEU、EOS、LYM均較模型組明顯降低，與地塞米松組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明射干麻黃湯能夠抑制氣道炎癥，并且這種作用可能是通過下調(diào)IL-17A、TNF-α來實(shí)現(xiàn)的。

綜合以上，射干麻黃湯可能通過下調(diào)IL-17A、TNF-α來抑制炎癥細(xì)胞在哮喘小鼠氣道內(nèi)的聚集，從而減輕氣道炎癥，減輕哮喘小鼠癥狀。但其具體作用機(jī)制仍不夠十分明確，有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Shegan Mahuang Decoction on Airway Inflammation and IL-17A，TNF-α in Asthmatic MiceModel

SUI Bowen，LI Mingshuang，WANG Da，et al. The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of TCM，Heilongjiang，Haerbin 150040，China.

Objective：To investigate the changes of IL-17A，TNF-α in airway inflammation exacerbation of chronic asthmatic mice model after Shegan Mahuang decoction treatment.Methods：Sixty mice were randomized into four groups：asthma group（group A），Shegan Mahuang decoction group（group B），blank group（group C），and dexamethasone group（group D）.Mice were sensitized and challenged with ovalbumin（OVA），aluminum hydroxide combined with aerosol inhalation to establish the asthmatic models.The mice models of asthma underwent different therapies after models of asthma were established.The changes in cellular proportions in the bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were observed，and the expression of IL-17 and TNF-α in BALF were detected by ELISA. Results：Compared with group C，messy and bleak hair，less movement and eating and slow response were observed during the experiment and during the aerosol inhalation，agitation，nose scratch，polypnea，nodding respiration and cyanotic lips at different degrees were observed in the mice in A，B，D groups.A group was more serious than B and D groups on the symptoms above.There was one death in group A and group D and no death in group B and group C.Compared with group C，The total cell number and the percentages of neutrophils（NEU）eosinophils（EOS）and lymphocytes（LYM）in BALF of the asthmatic mice were significantly higher in group A（P＜0.01），The changes in group B，D were less than group A（all P＜0.05），There was no significant difference between B and D（P＞0.05）.The level of IL-17A，TNF-α in BALF of group A was significantly higher than those ingroup C（P＜0.05），The changes in group B，D were less than group A（all P＜0.05）.There was no significant difference between B and D（P＞0.05）.It showed that IL-17A and TNF-α played an important part in asthma airway inflammation mediation.Conclusion：Shegan Mahuang decoction can regress airway inflammation exacerbation of chronic asthmatic mice model，its mechanism may be achieved through reducing the expression of IL-17A and TNF-α.

Asthma；IL-17A；TNF-α；Airway inflammation；Shegan Mahuang decoction

R285.5

A

1004-745X（2017）04-0581-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.04.005

2017-01-12）

黑龍江省博士后科研啟動(dòng)金項(xiàng)目（LBH-Q13167）