趙永烈王永麗胡 坤岳廣欣王玉來

（1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029；3.中國中醫(yī)科學院，北京 100053）

·研究報告·

芎芷地龍湯不同時間預防給藥對偏頭痛動物模型iNOS mRNA、c-fos mRNA表達的影響*

趙永烈1，2王永麗2胡 坤2岳廣欣3王玉來1

（1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029；3.中國中醫(yī)科學院，北京 100053）

目的 觀察芎芷地龍湯不同時間預給藥對偏頭痛動物模型iNOS mRNA、c-fos mRNA表達的影響。方法 將健康雄性SD大鼠36只，隨機分為0.9%氯化鈉注射液組（6只）、模型組（6只）、舒馬普坦組（6只）、中藥1 d預給藥組（6只），中藥3 d預給藥組（6只）、中藥7 d預給藥組（6只），按照預定給藥，造模結束后2 h取材，real-time PCR法測定三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核丘腦、硬腦膜c-fos mRNA、iNOS mRNA表達情況。結果 與0.9%氯化鈉注射液組比較，模型組iNOS mRNA在三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核、硬腦膜表達水平明顯升高，在丘腦表達水平明顯降低（P＜0.01），給藥干預后，三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核、硬腦膜iNOS mRNA表達水平均降低，其中以預防給藥7日組和舒馬普坦組明顯降低（P＜0.01）；丘腦iNOS mRNA表達水平有所升高，但各組與模型組差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與0.9%氯化鈉注射液組比較，模型組c-fos mRNA在三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核表達水平明顯升高，在丘腦、硬腦膜表達水平降低；給藥干預后，c-fos mRNA在三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核表達水平降低，以預防給藥7 d組和舒馬普坦組降低明顯（P＜0.05或P＜0.01）；c-fos mRNA在丘腦、硬腦膜表達水平升高，其中以預防給藥7 d組和舒馬普坦組升高幅度顯著（P＜0.05）。結論 芎芷地龍湯預防給藥可以減少NTG誘發(fā)的三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核c-fos mRNA、i-NOS mRNA表達，可以減少硬腦膜iNOS mRNA表達，而以預防給藥7 d效果好于預防給藥3 d、1 d。

偏頭痛 芎芷地龍湯 預防給藥 iNOS mRNA c-fosmRNA

偏頭痛是一種反復發(fā)作的神經功能障礙性疾病，為具有多種神經系統(tǒng)和非神經系統(tǒng)表現(xiàn)的綜合征。世界衛(wèi)生組織把嚴重的偏頭痛、癱瘓、精神障礙、癡呆列為最嚴重的慢性神經功能障礙性疾病。有關偏頭痛的治療根據其發(fā)作的過程，可分為發(fā)作期治療和預防性治療，對于患者本身來說，偏頭痛的預防性治療是十分重要的治療方法。早在《黃帝內經》中就提出治未病的思想，如《素問·四氣調神大論》所言“圣人不治已病治未病；不治已亂治未亂……夫病已成而后藥之，亂已成而后治之，譬如渴而穿井，斗而鑄錐，不亦晚乎”。因此對于偏頭痛的預防性治療的研究是我們應重點研究的問題。

前期我們觀察了應用芎芷地龍湯1 d、3 d、7 d預防給藥對偏頭痛模型痛閾及血管活性物質的影響［1］。為進一步明確芎芷地龍湯對偏頭痛的預防治療機理，本實驗擬研究芎芷地龍湯不同時間點預防給藥后，三叉神經血管系統(tǒng)中三級神經元中iNOS；c-fos mRNA表達情況。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年雄性SD大鼠，體質量（200±20）g；由維通利華實驗動物技術有限公司提供。動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥劑與儀器 芎芷地龍湯（川芎、白芷、生石膏、地龍、延胡索）由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院制劑室提?。亢辽?.0 g）；硝酸甘油注射液，5 mg/mL，北京益民藥業(yè)有限公司生產；琥珀酸舒馬普坦片，25 mg/片，海南先聲藥業(yè)有限公司生產；DEPC（焦碳酸二乙酯），購于北京欣經科生物技術有限公司；氯仿（三氯甲烷），購于北京化工廠；異丙醇，購于無錫縣化學試劑廠；TRIZOL Reagent（Invitrogen）；High Pure RNA Tissue Kit（Roche REF12033674001）；Go Taq 2-Step RT-qPCRsystem（Promega A6010）；Go TaqqPCR Master Mix（Promega A6002）。手持電動勻漿器（KONTES）；高速低溫離心機（SIGMA 3K15）；分光光度計（Nano Vue plus）；三用電子恒溫水箱（SHH.W21北京中興偉業(yè)器儀有限公司）；恒溫震蕩金屬?。˙ioer，MB-102）；PCR儀（Bio-RAD CFX96 Real-Time System）。

1.3. 分組 SD大鼠隨機分為6組：0.9%氯化鈉注射液對照組（Saline）、偏頭痛模型組（Migraine）、舒馬普坦組（Sumatriptan）、芎芷地龍湯1 d預給藥組（1 d XZDLT）、芎芷地龍湯3 d預給藥組（3 d XZDLT）、芎芷地龍湯7 d預給藥組（7 d XZDLT）。

1.4 造模及給藥 Saline組：給予10 mL/kg 0.9%氯化鈉注射液灌胃（1 d，3 d，7 d），普通飼養(yǎng)，灌胃30 min后頸背部皮下注射2 mL/kg 0.9%氯化鈉注射液。Migraine組：給予10 mL/kg 0.9%氯化鈉注射液灌胃，末次灌胃30 min后頸背部皮下注射10 mg/kg（5 mg/mL）硝酸甘油。芎芷地龍湯組：其他處理同偏頭痛模型組，給予10.8 mL/kg芎芷地龍湯灌胃（1 d，3 d，7 d），末次灌胃30 min后頸背部皮下注射10 mg/kg（5 mg/mL）硝酸甘油。Sumatriptan組：其他處理同偏頭痛模型組，給予琥珀酸舒馬普坦6 mg/kg灌胃，灌胃30 min后頸背部皮下注射10 mg/kg（5 mg/mL）硝酸甘油。

1.5 取材 于實驗結束后2 h，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射進行深度麻醉（40 mg/kg），迅速斷頭，在超凈臺內冰上取腦，分別剝離出丘腦，三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核、硬腦膜分別放入1.5 mL滅菌的離心管中，埋入液氮中迅速冷凍，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀察指標 檢測各組iNOS和c-fos的mRNA表達，方法如下。1）總RNA的提取，按試劑盒（High Pure RNA Tissue Kit）說明書嚴格操作：盛有標本組織的離心管中各加400 μL Trizol裂解細胞，之后依次加入適量氯仿、異丙醇、75%的預冷乙醇、DEPC水，分別純化、沉淀、洗滌、溶解總RNA。微量分光光度計測定RNA的濃度和純度。根據A260的值計算RNA濃度（單位：μg/μL），并根據A260/A280比值計算其純度，要求為1.8～2.0，比值低于1.6者棄去。2）逆轉錄反應（RT）步驟。按試劑盒說明書嚴格操作，20 μL反應體系，步驟如下，取1.5 mL離心管配制模板，加入RNA 11 μL，引物（Random Primer）1 μL，加入總RNA量1.1 μg；放入震蕩型恒溫金屬浴，70℃，5 min，迅速轉至冰上至少1 min；離心使液體收集于管底，加入5×Reaction buffer 4 μL，Mgcl225 mM 2 μL，PCR，Nucleotide Mix 10 mM 1 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，GoScrpt RT 0.5 μL；RNA引物混合液12 μL與逆轉錄混合液8 μL充分混合，放入震蕩型恒溫金屬浴，25℃ 5 min，放入三用恒溫電子水箱，42℃1 h，放入震蕩型恒溫金屬浴，70℃15 min，冷卻；立即PCR反應，放入-20℃冰箱保存。3）PCR引物設計。根據Genebank的序列和文獻參考，設計c-fos、iNOS、GAPDH的引物序列。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下。c-fos-F：5′-GGGAGCTGACAGATACGCTC-3′。c-fos-R：5′-TCAAGTCCAGGGAGGTCACA-3′。擴增長度：195 bp。iNOS-F：5′-AACCCAAGGTCTACGTTCAAG-3′，iNOS-R：5′-AAAGTGGTAGCCACATCCCG-3′。擴增長度：133 bp。GAPDH-F：5′-GTTACCAGGGCT GCCTTCTC-3′。GAPDH-R：5′-GATGGTGATGGGTTT CCCGT-3′。擴增長度：177 bp。4）實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time PCR）。取等量的RT反應產物，分別擴增c-fos、iNOS、GAPDH基因。5倍稀釋RT反應產物 cDNA：Nuclease-Free Water 40 μL，cDNA原液10 μL。real-time PCR體系：（20 μL反應體系）：cDNA稀釋液，4 μL，primer F（20 pmol/μL），0.5 μL，primer R（20 pmol/μL），0.5 μL，Mix，10 μL，加Nuclease-Free Water至20 μL；輕輕混勻，2000 r/min離心20 s后進行PCR擴增；在95℃30 s，95℃10 s，60℃30 s，15℃30 s下擴增共40個循環(huán)。反應結束后，讀取每份樣品中的相應目的基因的Ct值，減去GAPDH的Ct值，得出相對Ct值作為n值，再作1/2^n運算，得到每份樣品中目的基因的相對表達量即 Qμantity（目的基因/ GAPDH），校正后得到每份樣品中目的基因c-fos、iNOS的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示。采用單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計處理，組間比較采用LSD-t檢驗。運用SigmaPlot 13.0繪制統(tǒng)計圖。P＜0.05為差異存在統(tǒng)計學意義的界限。

2 結 果

2.1 應用real-time PCR方法檢測大各組大鼠鼠三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核、丘腦、硬腦膜的iNOS mRNA的表達 見表1。注射硝酸甘油后Migraine組iNOS mRNA在三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核、硬腦膜表達水平明顯升高，在丘腦表達水平明顯降低，與Saline組比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），給藥干預后三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核、硬腦膜iNOS mRNA表達水平均降低，其中以預防給藥7 d組和舒馬普坦組降低明顯（P＜0.01）；給藥干預后，丘腦iNOS mRNA表達水平有所升高，但各組與Migraine組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 應用real-time PCR方法檢測各組大鼠三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核、丘腦、硬腦膜的c-fos mRNA的表達 見表2。注射硝酸甘油后Migraine組c-fos mRNA在三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核表達水平明顯升高，與Saline組比較 （P＜0.01，三叉神經節(jié)），（P＜0.05，三叉神經脊束核）；在丘腦、硬腦膜表達水平降低，與Saline組比較（P＜0.05，丘腦），（P＜0.01，硬腦膜）；給藥干預后，c-fos mRNA在三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核表達水平降低，以7 d XZSGT組和Sumatriptan組降低明顯（P＜0.01）；給藥干預后，c-fos mRNA在丘腦、硬腦膜表達水平升高，其中以7 d XZSGT組和Sumatriptan組升高水平有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同組織中iNOS mRNA表達情況（±s）

表1 各組大鼠不同組織中iNOS mRNA表達情況（±s）

與Migraine組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與Saline組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n Saline 6 Migraine 6 1 d XZSGT 6三叉神經節(jié) 三叉頸復合體 丘腦 硬腦膜0.9167±0.06059**0.8267±0.06576**1.1067±0.04185**0.8917±0.07587**1.5433±0.14205△△1.3583±0.09148△△0.7383±0.04729△△1.3517±0.09810△△1.3750±0.12044△1.2167±0.10822△△0.9167±0.07706 1.1367±0.04417**3 d XZSGT 6 1.2333±0.10938 1.0450±0.08314**0.7433±0.34556 0.8733±0.03955**7 d XZSGT 6 1.0167±0.13478**0.5383±0.06789**△1.0617±0.07337 0.7200±0.14000**Sumatriptan 6 0.9583±0.13295**0.4483±0.02442**1.1383±0.09235 0.7050±0.10158**

表2 各組大鼠不同組織中c-fos mRNA表達情況（±s）

表2 各組大鼠不同組織中c-fos mRNA表達情況（±s）

組別 n Saline 6 Migraine 6 1 d XZSGT 6三叉神經節(jié) 三叉頸復合體 丘腦 硬腦膜0.9117±0.12240**0.9800±0.04195**1.0417±0.04571*1.0300±0.17043**1.4900±0.11978△△1.3983±0.13016△0.6917±0.07670△0.5533±0.09922△△1.3150±0.17318△1.1133±0.10484 0.8117±0.09192 0.7900±0.07465 3 d XZSGT 6 1.2200±0.14189 1.1050±0.17291 0.8933±0.15132 0.8350±0.07693 7 d XZSGT 6 0.8433±0.04410**1.0067±0.08019**0.9983±0.10403*0.8767±0.08114**Sumatriptan 6 0.9167±0.07614**0.9500±0.13051**1.0550±0.09226*0.9250±0.11523**

3 討 論

偏頭痛的病理生理機制復雜，近年研究認為，偏頭痛發(fā)生相關的解剖結構是三叉神經血管系［2-4］。三叉神經血管系統(tǒng)包括三級神經元：一級神經元是接受源自硬腦膜血管傳入沖動的三叉神經節(jié)（TG），它將沖動繼續(xù)傳至二級神經元——三叉神經尾核（TNC）及Cl，C2節(jié)段的脊髓后角表淺層，兩者共同構成三叉頸復合體（TCC）。二級神經元再將沖動傳導至丘腦的三級神經元。因此研究三叉神經血管系統(tǒng)中三級神經元的激活狀態(tài)在偏頭痛發(fā)病的研究中具有重要的意義。

NO被認為是在偏頭痛發(fā)病過程中起至關重要作用的一種活性分子，它既可以通過擴張硬腦膜等部位的血管激活三叉神經血管系統(tǒng)，又可以作為信號轉導分子傳導痛覺，還可以促使腦干中的TNC神經元出現(xiàn)痛覺過敏［5］。同時，一些研究者證實給予偏頭痛患者NO合酶（NOS）抑制劑可緩解偏頭痛的發(fā)作［6］。NO體內供體包括鈣/鈣調蛋白依賴的結構型NOS（eNOS，nNOS）以及不依賴Ca的誘導型NOS（iNOS）［7-8］，iNOS只有當受到一定程度的刺激時才發(fā)揮作用，也是內源性NO的主要來源。在體內NO釋放可擴張腦膜血管［9］并激活神經元［10］，進而增加痛覺的傳導，導致中樞敏化［11-12］。NO信號傳導激活可溶性鳥苷環(huán)化酶（sGC）產生環(huán)鳥苷酸（cGMP），進而引起蛋白激酶的磷酸化。而蛋白激酶是重要的細胞內信號傳導分子，是作為第二信使通路與c-fos（即早基因蛋白表達）偶聯(lián)，被廣泛應用作為神經元和痛覺激活的標志，在調節(jié)疼痛中發(fā)揮著重要的作用［13］。c-fos蛋白的表達已被廣泛用于識別神經元激活區(qū)域，并研究傷害性刺激與神經的相關性［14］，三叉神經脊束核尾側亞核（TNC）c-fos蛋白表達的增加，可以作為三叉神經血管系統(tǒng)激活的標志［15］。最近相關研究報道，由硝酸甘油誘發(fā)的小鼠偏頭痛模型表現(xiàn)為對熱和機械刺激敏化［16-17］，同時三叉神經脊束核尾側亞核c-fos達增加［16，18］。

本實驗研究觀察到，注射硝酸甘油后，c-fos mRNA在三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核表達水平明顯升高，與既往研究結果相一致［19-21］；給藥干預后，c-fos mRNA在三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核表達水平降低，以7 d XZSGT組和Sumatriptan組降低明顯。注射硝酸甘油后iNOS mRNA在三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核、硬腦膜表達水平明顯升高，與既往研究結果［21-22］及相關研究相一致［23-24］，給藥干預后三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核、硬腦膜iNOS mRNA表達水平均降低，其中以預7 d XZSGT組和Sumatriptan組降低明顯。而在丘腦，c-fos mRNA和iNOS mRNA的表達與三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核中表達不一致，可能與丘腦復雜的功能有關，因丘腦是感覺傳導的接替站，偏頭痛反復發(fā)作的過程中，頭痛的感覺傳導通路需要更為頻繁地通過丘腦完成中繼，并投射到大腦皮層中，丘腦在偏頭痛患者的疼痛處理中的重要性反映在復雜網絡的拓撲結構上就是較大的介數中心度［25］，可能在偏頭痛復雜感覺傳遞過程中，丘腦起著調節(jié)作用。

綜上所述，芎芷地龍湯預防給藥可以減少NTG誘發(fā)的三叉神經節(jié)、三叉神經脊束核c-fos mRNA、iNOS mRNA表達，可以減少硬腦膜iNOS mRNA表達，而以預防給藥7 d效果好于預防給藥3 d、1 d。

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Effect of Xiongzhi Dilong Decoction Preadministration at Different Time on iNOS mRNA，c-fos mRNA Expression in Migraine Animal

ZHAO Yonglie，WANG Yongli，HU Kun，et al. Dongfang Hospital，BeijingUniversity of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100078，China.

Objective：To study the effect of Xiongzhi Dilong decoction preadministration at different time on i-NOS mRNA，c-fos mRNA expression in migraine animal.Methods：36 healthy male SD rats were randomly divided into six groups：saline group（n＝6），migraine model group（n＝6），sumatriptan group（n＝6），1 day preadministration group（n＝6），3 day preadministration group（n＝6），7 day preadministration group（n＝6）.The drug was administered according to different groups，tissues were collected after subcutaneous injection of corresponding drug given 2h later.The c-fos mRNA，iNOS mRNA expression in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus，thalamus，dura mater was assayed by real-time PCR method.Results：Compared with saline group，the iNOS mRNA expression in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus，dura mater increased significantly，and the iNOS mRNA expression in thalamus decreased significantly in the model group（P＜0.01）；after the drug intervention，the iNOS mRNA expression in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus，dura mater was decreased，and the preadministration of 7days group and sumatriptan group decreased significantly（P＜0.01）.The iNOS mRNA expression in thalamus was increased，but there were no statistical significance compared with the model group（P＞0.05）.Compared with saline group，the c-fos mRNA expression increased significantly in trigeminal ganglion（P＜0.01），and spinal trigeminal nucleus（P＜0.05），and the c-fos mRNA expression decreased significantly in thalamus（P＜0.05）and dura mater（P＜0.01）；after the drug intervention，the c-fos mRNA expression in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus was decreased，and the preadministration of 7days group and sumatriptan group decreased significantly（P＜0.01）.The c-fos mRNA expression in thalamus and dura mater was increased，and theresults in the preadministration of 7days group and sumatriptan group were statistically significant（P＜0.05）. Conclusion：Preadministration of Xiongzhi Dilong decoction can reduce the c-fos mRNA，iNOS mRNA expression in trigeminal ganglion，spinal trigeminal nucleus which were induced by NTG，and can reduce the iNOS mRNA expression in dura mater.The prevention of preadministration of 7 days is better than the prevention of preadministration of 3 days and 1 day.

Migraine animal model；Xiongzhi Dilong decoction；Preadministration；iNOS mRNA；c-fos mRNA

R285.5

A

1004-745X（2017）04-0568-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.04.002

2016-12-29）

國家自然科學基金資助項目（81373591）