龍 杰， 王 羽+, 劉曉翠, 于 淼, 王伊林, 黃 俠, 趙 明

(1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué), 通遼 028000； 2. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院, 通遼 028000)

氧化應(yīng)激對(duì)原代培養(yǎng)乳鼠心房肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡因子的影響*

龍 杰1， 王 羽1+, 劉曉翠1, 于 淼1, 王伊林1, 黃 俠1, 趙 明2△

(1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué), 通遼 028000； 2. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院, 通遼 028000)

目的：研究氧化應(yīng)激對(duì)原代培養(yǎng)乳鼠心房肌細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡因子的影響。方法：實(shí)驗(yàn)分2組：對(duì)照組、氧化應(yīng)激組。原代培養(yǎng)乳鼠心房肌細(xì)胞，氧化應(yīng)激組在培養(yǎng)的原代心房肌細(xì)胞中加入終濃度為100 μmol /L 的H2O2培養(yǎng)2 h，檢測(cè)氧化和抗氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD) 活力、丙二醛(MDA)及還原型谷胱甘肽(GSH) 含量；檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞GRP78、GRP94及chop、bax、bcl-2 mRNA表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組相比較，氧化應(yīng)激組心房肌細(xì)胞SOD活力和 GSH 含量下降、MDA含量增加(P<0.01)，細(xì)胞凋亡增加(P<0.01)，細(xì)胞GRP78、GRP94、chop、bax mRNA表達(dá)增加、bcl-2 mRNA表達(dá)減少(P<0.01)。結(jié)論：氧化應(yīng)激反應(yīng)可能介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)并激活促凋亡因子表達(dá)，抑制抗凋亡因子表達(dá)，引起心房肌細(xì)胞凋亡增加。這可能與心房纖顫的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)性。

氧化應(yīng)激；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；凋亡；心房纖顫

【DOI】 10.12047/j.cjap.5381.2017.047

心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫) 是臨床上最常見的持續(xù)性心律失常，房顫可以增加血栓栓塞風(fēng)險(xiǎn)，增加總死亡率[1]。心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)具有自身進(jìn)展性, 主要由于房顫時(shí)心房發(fā)生電、結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu), 而心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)又在促進(jìn)房顫發(fā)作并持續(xù)中發(fā)揮更重要作用。研究證實(shí), 房顫時(shí)心房肌的氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加、氧化還原基因表達(dá)失衡以及線粒體DNA 存在氧化損傷, 表明了房顫時(shí)心房肌存在氧化應(yīng)激[2]。氧化應(yīng)激可能在房顫時(shí)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用[3]。心肌細(xì)胞凋亡是心肌重構(gòu)的重要機(jī)制,Aimé-Sempé等[4]研究發(fā)現(xiàn)心房肌細(xì)胞凋亡與心房組織重構(gòu)有明確的聯(lián)系。凋亡的產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜,近年發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一條新的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[5]。 然而，氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及心房肌細(xì)胞凋亡是否關(guān)聯(lián)還未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬觀察氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及心房肌細(xì)胞凋亡是否具有關(guān)聯(lián)性，以探討心房纖顫的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物藥品與儀器

1～3 d,Balb/c新生乳鼠購(gòu)置吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心,許可證號(hào)：scxk(吉)2011-0004; cTnI，α-SCA抗體購(gòu)于santa公司，Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(BioTeke)公司, RNA simple Total RNA Kit試劑盒(TIANGEN)公司,引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。SOD、MDA、GSH 試劑盒(Sigma 公司)。

1.2 乳鼠心房肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

經(jīng)下列實(shí)驗(yàn)步驟：(1)將實(shí)驗(yàn)室提供的無菌乳鼠心臟10個(gè)放于工作臺(tái)內(nèi)，準(zhǔn)備分離細(xì)胞。(2)將乳鼠心臟放入培養(yǎng)皿中，用PBS反復(fù)清洗。(3)將清洗后的心臟組織剪碎至1～3 mm3小塊。(4)加入0.1%Ⅱ型膠原酶以及0.1%胰蛋白酶混合液，37℃消化25 min。消化好后將其移入15 ml離心管1500 r/min離心7 min去上清。(5)用PBS重懸沉淀，用吸管反復(fù)吹打1 000 r/min離心5 min，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，過200目篩網(wǎng)去除大塊組織。(6)PBS清洗細(xì)胞兩次，1 000 r/min離心10 min，去上清，留沉淀。(7)加入1 ml的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后放置到培養(yǎng)板中。(8)成纖維細(xì)胞貼壁較快，2 h差速貼壁法可去除大量的成纖維細(xì)胞，上清懸液中為較純的心房肌細(xì)胞。細(xì)胞放置在培養(yǎng)板后24 h不用動(dòng)，隨后每?jī)商鞊Q一次液。

1.3 免疫組織化學(xué)方法鑒定乳鼠培養(yǎng)心房肌細(xì)胞

為明確培養(yǎng)細(xì)胞為心房肌細(xì)胞，對(duì)各組乳鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定。按常規(guī)方法，將細(xì)胞用0.1%TritonX-100孵育，然后加入3%過氧化氫以破壞內(nèi)源性過氧化物酶，室溫作用5 min。經(jīng)PBS洗滌后，加入血清封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)。用1∶1 000的抗體ɑ-SCA作用，4℃作用過夜，經(jīng)PBS洗滌后二抗室溫孵育1 h。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，最后封片觀察。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及氧化應(yīng)激模型制備

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組及氧化應(yīng)激模型組，乳鼠心肌細(xì)胞按照細(xì)胞濃度為5×104/ml接種于6孔板，并將其置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，次日，對(duì)照組不做任何處理，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。氧化應(yīng)激組在培養(yǎng)的原代心房肌細(xì)胞中加入終濃度為100 μmol /L 的H2O2培養(yǎng)2 h，檢測(cè)氧化和抗氧化指標(biāo)的變化。

采用ELISA法檢測(cè)兩組心房肌細(xì)胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD) 活力、丙二醛(malondialdehyde，MDA)及還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH) 含量。具體按照試劑盒說明書進(jìn)行。SOD 活性單位定義：每毫克組織蛋白在1 ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的 SOD量為一個(gè)SOD活性單位(U)。GSH 活性單位定義：每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個(gè)活力單位(U)。MDA含量定義：每毫克組織蛋白丙二醛的含量。所有指標(biāo)吸光值均用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定

1.5 TUNEL檢測(cè)兩組心房肌細(xì)胞凋亡

兩組心房肌細(xì)胞應(yīng)用Tunel法，經(jīng)過下列步驟檢測(cè)凋亡(1)透化: 滴加0.1 % Triton X-100(0.1 %檸檬酸鈉鹽配置) 50 μl，室溫放置8 min。(2)PBS漂洗，3×5 min。(3)封閉：滴加3 % H2O2以覆蓋爬片，室溫放置10 min。(4)PBS漂洗，3×5 min。(5)Labeling：配制TUNEL reaction mixture：Enzyme solution與Label Solution按1∶9配制(即用即配，冰上操作)。(6)滴加TUNEL反應(yīng)液至完全覆蓋玻片。(7)保濕、避光、37℃孵育60 min。(8)PBS漂洗，3×5 min。(9)滴加Converter-POD 至完全覆蓋玻片，37℃孵育30 min。(10) PBS漂洗，3×5 min。(11) 加DAB底物直至完全覆蓋玻片，待顏色剛剛變深時(shí)迅速置于水中終止反應(yīng)。(12) PBS漂洗，3×5 min。(13) 滴加蘇木素，復(fù)染3 min后，用蒸餾水清洗，滴加1%鹽酸乙醇中分化3 s，立即用自來水清洗，流水反藍(lán)20 min。(14) 滴加甘油乙醇封片。最后進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)。

1.6 real time PCR 檢測(cè)兩組心房肌細(xì)胞GRP78、GRP94及chop、bax、bcl-2 mRNA表達(dá)

引物信息：GRP78-F CAGCCAACTGTAACAATC AA；GRP78-R CTGTCACTCGGAGAATACCA；GRP94-F GGTGTTGTGGATTCCGATGA；GRP94-R AAGTTTAGCAAGCCGTGT；Bcl-2-F CTCTGGTTGGGATTCCT ACGG；Bcl-2-R CGGCATGATCTTCTGTCAAGTTTA；Bax-F CCAGGATGCGTCCACCAAGAA；Bax-R AGCAAAGTAGAAGAGGGCAACCAC；Chop-F CAGCGACAGAGCCAGAATAAC；Chop-R TGTTGCAGATGATGAGAGCC；β-actin-F CTGTGCCCATCTACGAGGG CTAT；β-actin-R TTTGATGTCACGCACGATTTCC

經(jīng)下列實(shí)驗(yàn)步驟：(1)樣本總RNA提取(2)RNA濃度檢測(cè)(3)反轉(zhuǎn)錄(4)熒光定量PCR檢測(cè)。每種樣本每個(gè)基因進(jìn)行4個(gè)復(fù)孔平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(n=3)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的選取，是舍去誤差較大的數(shù)值，取剩余數(shù)值的平均值作為最終實(shí)驗(yàn)保留數(shù)據(jù)，利用2-△△CT方法分析數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組乳鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞免疫組化

各組乳鼠培養(yǎng)心肌細(xì)胞經(jīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)出心肌細(xì)胞特有的ɑ-SCA蛋白，確定為心房肌細(xì)胞(圖1)。

Fig. 1 Atrial myocytes were analyzed by immunocytochemistry (bar=75 μm) A: Culturing atrial myocytes cell (×400)； B: Immunocytochemistry of culturing atrial myocytes cell α-SCA (×400)

2.2 ELISA法檢測(cè)兩組心房肌細(xì)胞 SOD活力、 MDA及GSH含量

與對(duì)照組心房肌細(xì)胞SOD活力相比較，氧化應(yīng)激組心房肌細(xì)胞SOD活力下降；與對(duì)照組心房肌細(xì)胞 GSH 含量相比較，氧化應(yīng)激組心房肌細(xì)胞GSH 含量下降(P<0.01)；與對(duì)照組心房肌細(xì)胞MDA含量相比較， 氧化應(yīng)激組心房肌細(xì)胞MDA含量增加(P<0.01，表1)。

Tab. 1 SOD, MDA and GSH were analyzed by ELISA

SOD: Superoxide dismutase; GSH: Glutathione; MDA: Malondialdehyde

**P<0.01vscontrol group

2.3 TUNEL檢測(cè)兩組心房肌細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組相比較，氧化應(yīng)激組心房肌細(xì)胞凋亡率增加(P<0.01，圖2)。

Fig. 2 The apoptosis of cultured atrial myocytes (bar=75 μm) A: Control group; B: Oxidative stress group

2.4 real time PCR 檢測(cè)兩組心房肌細(xì)胞GRP78、GRP94及chop、bax、bcl-2 mRNA表達(dá)

與對(duì)照組相比較，氧化應(yīng)激組心房肌細(xì)胞GRP78、GRP94、chop、bax mRNA表達(dá)增加(P<0.01)，bcl-2 mRNA表達(dá)減少(P<0.01, 表2)。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊蛋白質(zhì)功能異常，可能致誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常聚集及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性蛋白分泌增加，并且識(shí)別錯(cuò)誤折疊蛋白，并通過蛋白酶體將其降解，上述一系列反應(yīng)過程即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)[6]。ERS發(fā)生后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過上調(diào)分子伴侶蛋白GRP78及GRP94 表達(dá)[7]、抑制蛋白質(zhì)合成、加速錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白質(zhì)降解等方式緩解ERS。然而持續(xù)或較嚴(yán)重的ERS 則觸發(fā)凋亡信號(hào)，誘導(dǎo)CHOP、caspase-12、bax 等促凋亡因子的表達(dá)及活化[8]，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9-11]。大量文獻(xiàn)報(bào)道氧化應(yīng)激與心房重構(gòu)及心房纖顫發(fā)生密切相關(guān)，并且無論是AF動(dòng)物模型還是AF患者均發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白GRP94 表達(dá)增高[12]，新近研究發(fā)現(xiàn)起搏誘導(dǎo)AF細(xì)胞模型可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)HL-1細(xì)胞凋亡[13]。眾所周知，心房肌細(xì)胞凋亡可以引起心房發(fā)生結(jié)構(gòu)重構(gòu)及產(chǎn)生房顫，但氧化應(yīng)激是否引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及心房肌細(xì)胞凋亡，還不得而知[14]。本研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激組心房肌細(xì)胞凋亡率明顯增加，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78，GRP94 mRNA表達(dá)均

Tab. 2 The expressions of GRP78, GRP94, chop, bax, bcl-2 mRNA in the cultured atrial myocytes

GRP78: Glucose-regulated protein 78; GRP94: Glucose-regulated protein 94; CHOP: C/EBP homologous protein; Bax: Bcl-2 associated x protein; Bcl-2: B-cell leukemia 2 protein

**P<0.01vscontrol group

明顯高于對(duì)照組心房肌細(xì)胞,并且伴隨著促凋亡因子chop, bax mRNA表達(dá)增高，抗凋亡因子bcl-2 mRNA表達(dá)減少。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以得出結(jié)論：氧化應(yīng)激反應(yīng)可能介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)并激活促凋亡因子表達(dá)，抑制抗凋亡因子表達(dá)，引起心房肌細(xì)胞凋亡增加。這一結(jié)果可能引起心房發(fā)生重構(gòu)并與心房纖顫的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)性。但是氧化應(yīng)激是如何介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生，以及通過哪一條內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路引起心房肌細(xì)胞凋亡的，還需在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步闡明。

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Effect of oxidative stress on myocardial apoptosis, endoplasmic reticulum stress and apoptosis factor in suckling mouse atria myocardium

LONG Jie1， WANG Yu1+， LIU Xiao-cui1， YU Miao1， WANG Yi-lin1， HUANG Xia1， ZHAO Ming2△

(1. The Inner-Mongolia National University, Tongliao 028000； . The Inner-Mongolia National University Affiliated Hospital, Tongliao 028000, China)

Objective: To investigate the relationship between oxidative stress and myocardial apoptosis, endoplasmic reticulum stress, apoptosis-inducing factors in the process of by researching the effect of oxidative stress on myocardial apoptosis, endoplasmic reticulum stress and apoptosis factor--chop, bax, bcl-2 in suckling mouse atria myocardium. Methods: The primary cultured suckling mouse myocardium were randomly divided into control group and oxidative stress group. Firstly, the suckling mouse atria cardiomyocytes were treated with H2O2at the concentration of 100 mμmol/L for 2 hours. Then, the index of oxidative stress and anti-oxidative stress superoxide dismutase (SOD), the contents of malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) of this two groups were detected by ELISA. Myocardial apoptosis of the two groups was detected by TUNEL. The expressions of glucose-regulated protein 78 (GRP78), glucose-regulated protein 94 (GRP94), C/EBP homologous protein (chop), Bcl-2 associated X protein (bax), B-cell leukemia 2 protein (bcl-2) mRNA were detected by real time PCR. Results: Compared with the control group, the viability of SOD and the contents of MDA in oxidative stress group were reduced, the contents of MDA was increased (P<0.01). Compared with the control group, the expression of myocardial apoptosis in oxidative stress group was increased(P<0.01); the expressions of GRP78, GRP94, chop and bax mRNA were increased, while the expression of bcl-2 mRNA was reduced in oxidative stress group. Conclusion: Oxidative stress may induce the endoplasmic reticulum stress, activate the expressions of apoptosis factors, and finally increase the myocardial apoptosis of atria cardiomyocytes. This may connected to the incident of atrial fibrillation.

oxidative stress; endoplasmic reticulum stress; apoptosis； atrial fibrillation

2015-11-19

2016-11-22

R331.3；R-332

A

1000-6834(2017)02-185-04

△【通訊作者】Tel: 13474859991; E-mail: langzhe73@163.com;+: 為共同第一作者