韓 雪， 黃 欣， 朱玲玲△， 范 明,△

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系， 北京 100069； 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所認(rèn)知科學(xué)研究室， 北京 100850)

氧糖剝奪對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響*

韓 雪1， 黃 欣2， 朱玲玲2△， 范 明1,2△

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系， 北京 100069； 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所認(rèn)知科學(xué)研究室， 北京 100850)

目的：建立體外氧糖剝奪模型模擬腦缺血缺氧損傷, 探討氧糖剝奪對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECS)屏障功能的影響。方法：細(xì)胞培養(yǎng)至完全融合后換成無(wú)糖培養(yǎng)基置于低氧手套箱(0.3% O2)分別處理0.5 h、1 h、2 h和4 h后, 利用CCk-8法檢測(cè)細(xì)胞存活，利用跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻 (trans-endothelial electrical resistant, TEER)方法檢測(cè)HUVECs細(xì)胞通透性的變化，以及Western blot檢測(cè)緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：氧糖剝奪處理0.5 h、1 h、2 h和4 h后, HUVECs細(xì)胞存活率逐漸下降，TEER值逐漸降低，緊密連接蛋白Occludin、VE-cadherin的表達(dá)明顯降低。結(jié)論：氧糖剝奪破壞內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接功能，增加HUVECs細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞的存活率明顯降低。

氧糖剝奪；緊密連接；通透性；HUVEC

【DOI】 10.12047/j.cjap.5407.2017.027

腦缺血發(fā)病率高，輕則影響患者的生活質(zhì)量，重則威脅患者的生命健康[1]。目前對(duì)于腦缺血損傷的預(yù)防和治療仍然缺少有效的手段和措施。以往的研究策略大多集中在保護(hù)神經(jīng)元，近年來(lái)“神經(jīng)-血管單元(neurovascular unit, NVU)”概念的提出，成為腦保護(hù)和可塑性研究的新關(guān)注點(diǎn)，靶向調(diào)節(jié)神經(jīng)-血管單元也是腦損傷修復(fù)的新策略[2]。NVU是指由神經(jīng)元、血腦屏障(blood brain barrier, BBB)、小膠質(zhì)細(xì)胞以及維持腦和神經(jīng)組織完整性的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)共同構(gòu)成的一個(gè)動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)復(fù)合體，它也是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞-細(xì)胞間

信號(hào)傳遞和細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用的框架, 是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。研究發(fā)現(xiàn)：腦缺血損傷破壞血腦屏障，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織內(nèi)環(huán)境紊亂，引起神經(jīng)元功能障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的壞死[3]。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞是神經(jīng)血管單元重要的組成細(xì)胞，在腦缺血損傷過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，成為該過(guò)程中神經(jīng)保護(hù)的新靶點(diǎn)[4]。而腦血管內(nèi)皮細(xì)胞主要通過(guò)限制細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)和跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，其中由緊密連接蛋白限制的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)尤為重要。研究表明，缺血缺氧可激活VEGF、MMP2等導(dǎo)致緊密連接蛋白磷酸化，使其表達(dá)下調(diào)或重組[5,6,7]，可激活MMP9降解內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)[8]，最終使其通透性降低。

目前常用于血腦屏障功能研究的內(nèi)皮細(xì)胞模型大多為大、小鼠來(lái)源的原代細(xì)胞或者細(xì)胞系[9,10]，缺少人源腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)是具有完整的內(nèi)皮屏障功能的一種人源內(nèi)皮細(xì)胞，可以較好地模擬人源內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，是一種理想的用于屏障功能研究的細(xì)胞模型。本研究旨在觀察體外模擬腦缺血損傷的氧糖剝奪模型中對(duì)HUVECs細(xì)胞內(nèi)皮屏障功能及細(xì)胞存活的影響，為研究血腦屏障在腦缺血的預(yù)防治療中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清、青鏈霉素購(gòu)自Hyclone公司，無(wú)糖培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自Gibco公司，CCK-8購(gòu)自Dojindo公司，anti-VE-cadherin購(gòu)自eBioscience公司，anti-Occludin購(gòu)自invitrogen公司，anti-β-actin購(gòu)自Sigma公司，其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 HUVECs的培養(yǎng)

HUVEC細(xì)胞系為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院施明老師惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，1%青鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基。細(xì)胞在37℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，平均3 d傳代。

1.3 氧糖剝奪細(xì)胞模型的建立

細(xì)胞隨機(jī)分成常氧對(duì)照組，氧糖剝奪組(低氧1 h組，低氧2 h組，低氧4 h組，總計(jì)4組)。培養(yǎng)3 d后細(xì)胞匯合約100%，低氧實(shí)驗(yàn)組換成無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基放入低氧手套箱(COY laboratory products公司)，即在37℃、0.3%O2、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

細(xì)胞隨機(jī)分成常氧對(duì)照組，氧糖剝奪組(按1.3分組)。將細(xì)胞接種于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，終密度為1×104cells/孔。氧糖剝奪處理后，每孔培養(yǎng)基100 μl，加入10 μl CCK-8，孵育4 h,于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Thermo公司)450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(OD) 值。

1.5 跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(TEER值)的測(cè)定

細(xì)胞接種入insert小室(1 μm，6孔板，millipore公司)中，以未接種細(xì)胞僅在小室內(nèi)加入等量相同培養(yǎng)基的樣品為空白對(duì)照,培養(yǎng)3 d后細(xì)胞完全匯合，利用Millicell-ESR電阻儀(millipore公司)測(cè)TEER值，每個(gè)insert均取不同方向的3個(gè)點(diǎn),每點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3次,方法嚴(yán)格參照儀器說(shuō)明書(shū)。TEER值是公認(rèn)的測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞物理屏障功能最精確的工具。TEER值下降表明內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，屏障功能受損。TEER值(Ω·cm2)=(實(shí)驗(yàn)組-空白組)×4.5 。

1.6 Western blot檢測(cè)緊密連接蛋白Occludin和介導(dǎo)細(xì)胞粘附連接的VE-cadherin蛋白表達(dá)

氧糖剝奪處理完畢的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗2遍，再刮下來(lái)移到1.5 ml EP管中，3 000 r/min 4℃離心5 min，棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入含Cocktail(1∶50，Roche公司)的RIPA裂解液(普利萊公司)在冰上裂解30 min，再加入5×loading buffer，100℃煮10 min。SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。PBST 漂洗PVDF膜3次，每次10 min。二抗室溫孵育2 h，然后用PBST充分洗膜，漂洗3次，每次10 min。將顯影液ECL加于PVDF 膜上，用保鮮膜將膜包好。暗室中在X 光膠片曝光，調(diào)整曝光時(shí)間，直至出現(xiàn)最佳條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 氧糖剝奪對(duì)HUVECs細(xì)胞存活的影響

隨著氧糖剝奪處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞邊界模糊，折光度較差, 細(xì)胞密度明顯減少，部分細(xì)胞發(fā)生皺縮。利用CCK-8法檢測(cè)氧糖剝奪后HUVECs細(xì)胞的存活率，結(jié)果顯示：與正常培養(yǎng)組比較，氧糖剝奪各處理組細(xì)胞存活率明顯降低，且隨著氧糖剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞存活率逐漸降低，氧糖剝奪處理30 min，60 min和120 min的細(xì)胞存活率依次為85.2%±4.67%，80.88%±4.08%，71.20%±3.27%，較正常組均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖1)。上述結(jié)果表明：氧糖剝奪對(duì)HUVECs細(xì)胞的損傷呈時(shí)間依賴(lài)性，隨著氧糖剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，HUVECs細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。

2.2 氧糖剝奪對(duì)HUVECs細(xì)胞通透性的影響

HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，TEER值穩(wěn)定至(93.5±2.78)Ω·cm2進(jìn)行氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示:氧糖剝奪可導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞TEER值以時(shí)間依賴(lài)性方式下降。與0 h(93.5±2.78Ω·cm2)相比, 氧糖剝奪0.5 h后, TEER值開(kāi)始下降至(46.5±2.60)Ω·cm2, 氧糖剝奪4 h時(shí)降至最低水平(10.5±3.97)Ω·cm2, 氧糖剝奪各組較正常培養(yǎng)組細(xì)胞通透性均明顯減低, 具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01, 圖2)。以上結(jié)果表明：隨著氧糖剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，HUVECs細(xì)胞TEER值逐漸降低；氧糖剝奪導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞通透性升高，屏障功能受損。

Fig. 2 The effects of oxygen-glucose deprivation on transendothelial electrical resistance (TEER) of HUVECs (n=3) The permeability of HUVECs was assessed by TEER measurements**P<0.01vs0 h

2.3 氧糖剝奪后HUVECs細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)降低

Western blot結(jié)果顯示，緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)在OGD處理1 h后開(kāi)始減弱，4 h下降最為明顯，較正常組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。此外介導(dǎo)細(xì)胞粘附連接的VE-cadherin也隨著氧糖剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)下降，OGD處理4 h后下降最為明顯，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05, 圖3)。上述結(jié)果表明：氧糖剝奪破壞HUVECs細(xì)胞間的緊密連接和粘附連接，增加細(xì)胞的通透性，破壞內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能。

3 討論

HUVECs細(xì)胞是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。我們通過(guò)檢測(cè)其TEER值在100 Ω·cm2左右，與大多數(shù)目前發(fā)表的各種屬腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的TEER值相當(dāng)，這說(shuō)明該HUVECs細(xì)胞具有良好的屏障功能，并且HUVECs細(xì)胞具有純度高、穩(wěn)定性好、傳代快等諸多優(yōu)點(diǎn)。

血管通透性增加是腦血管病的重要病理變化, 研究表明：緊密連接蛋白Occludin連接細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架，維持內(nèi)皮細(xì)胞間通透性，缺氧可激活VEGF等使Occludin磷酸化導(dǎo)致其功能受損，下調(diào)Occludin

Fig. 3 The effects of oxygen-glucose deprivation on protein expressions of HUVECs (n=3) A: The protein expressions of VE-cadherin and Occludin detected by Western blot. β-actin was used as an internal control; B: The quantitative analysis of VE-cadherin and Occludin*P<0.05vs0 h

表達(dá)，增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性[11]。而緊密連接的形成同時(shí)也依賴(lài)粘附連接的存在。粘附連接蛋白VE-cadherin通過(guò)和胞內(nèi)β-catenin相互作用維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)[12]，VEGFR2的激活介導(dǎo)VE-cadherin內(nèi)吞和降解，下調(diào)其表達(dá)影響正常功能[13]，最終降低內(nèi)皮細(xì)胞通透性。本研究發(fā)現(xiàn)氧糖剝奪影響HUVECs的存活及屏障功能，其通透性的變化尤為明顯，Western blot結(jié)果表明緊密連接蛋白Occludin及粘附連接蛋白VE-cadherin在氧糖剝奪后均表達(dá)下調(diào)，尤其在4 h后最明顯，說(shuō)明Occludin和VE-cadherin的下調(diào)破壞內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能。同時(shí)研究表明緊密連接相關(guān)蛋白可通過(guò)重排及表達(dá)下調(diào)影響內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及其存活[14,15,16]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HUVECs的TEER值變化與細(xì)胞存活趨勢(shì)相似，且蛋白表達(dá)的顯著下調(diào)發(fā)生在氧糖剝奪4 h后，推測(cè)該緊密連接相關(guān)蛋白的重排在這其中也發(fā)揮重要作用。因此，探討氧糖剝奪模型下內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的變化及其作用機(jī)制對(duì)于腦缺血損傷屏障功能的通透性研究具有重要的意義。

綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)證明氧糖剝奪可以引起HUVECs細(xì)胞通透性升高, 細(xì)胞存活率降低，其機(jī)制為緊密連接蛋白Occludin和粘附連接蛋白VE-cadherin表達(dá)下調(diào); 這些提示氧糖剝奪抑制內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)，增加其細(xì)胞通透性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。本研究為腦缺血損傷后血腦屏障通透性的研究提供理想的細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)方法，為深入探討腦缺血損傷后細(xì)胞緊密連接及其對(duì)通透性的研究提供依據(jù)。

[1] Donnan GA, Fisher M, Macleod M,etal. Stroke[J].Lancet, 2008, 371(9624): 1612-1623.

[2] del Zoppo GJ. The neurovascular unit in the setting of stroke[J].JInternMed, 2010, 267(2): 156-171.

[3] Bickler PE, Donohoe PH. Adaptive responses of vertebrate neurons to hypoxia[J].JExpBiol, 2002, 205(23): 3579-3586.

[4] Gursoy-Ozdemir Y, Yemisci M, Dalkara T. Microvascular protection is essential for successful neuroprotection in stroke[J].JNeurochem, 2012, 123 (Suppl 2): 2-11.

[5] Fischer S, Clauss M, Wiesnet M,etal. Hypoxia induces permeability in brain microvessel endothelial cellsviaVEGF and NO[J].AmJPhysiol, 1999, 276(4 Pt 1): C812-820.

[6] Luissint A C, Artus C, Glacial F,etal. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation[J].FluidsBarriersCNS, 2012, 9(1): 23.

[7] Liu J, Jin X, Liu KJ,etal. Matrix metalloproteinase-2-mediated occludin degradation and caveolin-1-mediated claudin-5 redistribution contribute to blood-brain barrier damage in early ischemic stroke stage[J].JNeurosci, 2012, 32(9): 3044-3057.

[8] Rosenberg GA, Yang Y. Vasogenic edema due to tight junction disruption by matrix metalloproteinases in cerebral ischemia[J].NeurosurgFocus, 2007, 22(5): E4.

[9] Bauer AT, Bürgers HF, Rabie T,etal. Matrix metalloproteinase-9 mediates hypoxia-induced vascular leakage in the brain via tight junction rearrangement[J].JCerebBloodFlowMetab, 2010, 30(4): 837-848.

[10]Wang LW, Tu YF, Huang CC,etal. JNK signaling is the shared pathway linking neuroinflammation, blood-brain barrier disruption, and oligodendroglial apoptosis in the white matter injury of the immature brain[J].JNeuroinflammation, 2012, 9(1): 175.

[11]Hirase T, Kawashima S, Wong EY,etal. Regulation of tight junction permeability and occludin phosphorylation by Rhoa-p160ROCK-dependent and -independent mechanisms[J].JBiolChem, 2001, 276(13): 10423-10431.

[12]Dejana E, Vestweber D. The role of VE-Cadherin in vascular morphogenesis and permeability control[J].ProgMolBiolTranslSci, 2013, 116: 119-144.

[13]Nottebaum AF, Cagna G, Winderlich M,etal. VE-PTP maintains the endothelial barrierviaplakoglobin and becomes dissociated from VE-cadherin by leukocytes and by VEGF.[J].JExpMed, 2008, 205(12): 2929-2945.

[14]Dejana E, Tournier-Lasserve E, Weinstein BM. The control of vascular integrity by endothelial cell junctions: molecular basis and pathological implications[J].DevCell, 2009, 16(2): 209-221.

[15]薛鳳麟, 張 旋, 賀國(guó)洋, 等. 核因子-κB在HUVEC細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中的作用[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2009, 25(3): 383-386.

[16]于 航, 賈慶波, 薛一雪. rhAng-1對(duì)局灶性腦缺血/再灌注大鼠血腦屏障血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接的影響[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2013, 29(2): 147-152.

Effects of oxygen-glucose deprivation on the permeability of human umbilical vein endothelial cells

HAN Xue1, HUANG Xin2, ZHU Ling-ling2△, FAN Ming1,2△

(1. Department of Neurobiology， Capital Medical University, Beijing 100069;2. Department of Cognitive Science, Beijing Institute of Basic Medical Science， Beijing 100850, China)

Objective: To investigate the effects of oxygen-glucose deprivation (OGD) on the functions of blood-brain barrierinvitro, we established an OGD model to mimic cerebral ischemic injury in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods: Cells were cultured in DMEM without glucose under hypoxic conditions (0.3% O2) for different time point. The survival rate of HUVECs was detected by CCK-8 assay. The permeability of HUVECs was measured by epithelial volt-ohm meter. The expression of tight junction protein was detected by Western blot analysis. Results: In OGD group, the survival rate of HUVECs was obviously decreased. The permeability of HUVECs also decreased in OGD-treated cells. And the expression of tight junction protein was reduced after OGD treatment. Conclusion: Our data indicate that OGD treatment disrupt the barrier function of tight junctions and increase permeability of HUVECs and finally accelerated cell death.

oxygen-glucose deprivation; tight junction; permeability; HUVEC

2016-03-29

2016-11-25

R743.31；R364.4

A

1000-6834(2017)02-105-04

△【通訊作者】Tel: 010-66931315; E-mail: fanmingchina@126.com; linglingzhu@hotmail.com