肖 敏, 屈小虎, 陳 慧, 蔡強軍, 謝克儉

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院與生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

口服活性AdipoRon對2型糖尿病小鼠肝臟氧化應(yīng)激的干預(yù)作用*

肖 敏, 屈小虎, 陳 慧, 蔡強軍, 謝克儉△

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院與生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

目的：研究口服活性AdipoRon對2型糖尿病小鼠肝臟氧化應(yīng)激是否有干預(yù)作用，為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。方法：將健康雄性C57BL/6小鼠分為正常組(n=8)，糖尿病組(n=8)，AdipoRon高劑量治療組(n=8)，AdipoRon低劑量治療組(n=8)，以高脂飼料喂養(yǎng)6周后腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)2型糖尿病模型，用高、低劑量的口服活性AdipoRon分別對治療組灌胃治療10 d 后，檢測相關(guān)生化指標(biāo)，Western-blot法檢測肝臟組織中IRS-1蛋白的表達；實時熒光定量PCR檢測胰腺組織中PDX-1 mRNA 的表達。結(jié)果：DM組小鼠血糖值明顯高于NC組(P<0.05)，DM+L組和DM+H組小鼠血糖值顯著低于DM組。DM組小鼠肝臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性顯著低于NC組(P<0.05)，丙二醛(MDA)及一氧化氮合酶(NOS)活性顯著高于NC組(P<0.05)；DM+L組和DM+H組SOD、CAT活性明顯高于DM組(P<0.05)，MDA及NOS活性顯著低于DM組(P<0.05)。肝臟組織中IRS-1的蛋白表達及胰腺PDX-1 mRNA 表達顯著升高，存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：口服活性AdipoRon對糖尿病小鼠肝臟組織氧化應(yīng)激有一定的干預(yù)作用，能降低小鼠的血糖水平。

AdipoRon；2型糖尿病小鼠；肝臟；氧化應(yīng)激

【DOI】 10.12047/j.cjap.5451.2017.032

2型糖尿病是臨床常見的因體內(nèi)胰島素分泌不足及或作用缺陷引起的慢性糖脂肪蛋白質(zhì)代謝紊

亂綜合征[1]。其主要特點是血葡萄糖水平的升高，長期代謝紊亂可引起多系統(tǒng)損害導(dǎo)致血管神經(jīng)、肝臟和胰腺等組織器官的慢性進行性病變，胰島素水平改變和胰島素敏感性降低是糖尿病的兩個重要標(biāo)志。多年研究表明[2，3]，氧化應(yīng)激是介導(dǎo)糖尿病發(fā)生發(fā)展的一個重要因素，同時也發(fā)現(xiàn)了一些藥物可以通過減少氧化應(yīng)激來治療糖尿病。但如何對糖尿病患者組織氧化應(yīng)激進行保護缺乏深入有意義的研究。AdipoRon 是近年來發(fā)現(xiàn)的由脂肪細(xì)胞分泌的一種特異性蛋白, 具有抗炎、抗糖尿病、抗動粥樣硬化和增敏胰島素的作用[4]。本實驗以高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合STZ腹腔注射構(gòu)建2型糖尿病動物模型，然后用高、低劑量的口服活性 AdipoRon進行灌胃，以探索口服活性AdipoRon是否對2型糖尿病小鼠肝組織氧化應(yīng)激具有干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠32只，稱重18～22 g(由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供)

1.2 主要儀器

博士醫(yī)生TD-4252血糖測試儀(日本京都)，血糖儀專用試紙型號TD-4252 (日本京都)，全自動生化分析儀(日本日立公司)，紫外分光光度計(廠家)，ECTIPSE50I顯微圖像處理系統(tǒng)(Nikon)，KD-2508輪轉(zhuǎn)式切片機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 主要試劑

鏈脲佐菌素(STZ)(購于Sigma公司)，MDA、SOD、CAT 以及NOS測定試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)，口服活性AdipoRon(購于上海恩美生物科技有限公司)，高糖高脂飼料(蛋白質(zhì)19.2/20脂肪4.30/10碳水化合物67.3/70微量元素9.20/0)。 STZ配制液需先配制檸檬酸緩沖液。檸檬酸(FW：210.14)2.1 g加入去高壓水100 ml中配成A液。檸檬酸鈉(FW：294.10)2.94 g加入雙蒸水100 ml中配成B液。用時將A、B液按一定比例混合(按1：1的)，pH計測定pH值，調(diào)節(jié)pH范圍為4.2～4.5。

1.4 2型糖尿病小鼠模型的構(gòu)建

將32只健康雄性C57BL/6小鼠隨機分成正常組(NC組)和糖尿病組(DM組)，NC組喂食普通飼料(8只)；DM組喂食高脂飼料(24只)6周，禁食12 h后，按體質(zhì)量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，注射劑量為40 mg/kg，連續(xù)注射2 d，72 h后禁食6 h測量血糖，斷尾取血測空腹血糖濃度，血糖濃度>11 mmol/L的小鼠為2型糖尿病構(gòu)建成功的模型。

1.5 2型糖尿病小鼠分組及給藥情況

將DM組小鼠隨機分為3組，每組8只：2型糖尿病模型對照組 (DM組)、低劑量AdipoRon治療組(DM+L組)、高劑量AdipoRon治療組(DM+H組)。按照體質(zhì)量灌胃治療，低劑量治療組每天灌胃劑量為20 mg/kg，高劑量治療組每天灌胃劑量為50 mg/kg，DM組給予等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃10 d。

1.6 觀察指標(biāo)及測定方法

頸椎脫臼法處死小鼠后，解剖取肝臟稱重，清洗血液置于凍存管中液氮速凍后保存于-80℃冰箱。實驗時，剪取適量肝組織，加入預(yù)冷生理鹽水，在冰浴條件下，制成 10%的組織勻漿，低溫600×g離心，取上清液，采用羥胺法測定SOD 含量、采用紫外分光光度法測定CAT含量、采用可見光分光光度法測定NOS含量、采用硫代巴比妥酸縮合法(TBA)測定MDA含量。

1.7 組織學(xué)檢查

解剖時，每只小鼠取部分新鮮肝臟組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。每個標(biāo)本制作2張切片，每張切片隨機取4個視野(×400)，用ECTIPSE 50I顯微圖像處理系統(tǒng)觀察并采集圖像，比較各組肝臟組織學(xué)形態(tài)變化。

1.8 肝臟組織p-IRS-1蛋白和胰腺組織PDX-1 mRNA表達檢測

分別取肝臟和胰腺的部分組織，參照說明書步驟，采用Western-blot法檢測肝臟組織中p-IRS-1蛋白表達變化，實時熒光定量PCR法檢測胰腺組織PDX-1 mRNA的表達水平變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 口服活性AdipoRon對動物一般情況及血糖水平的影響

研究結(jié)果表明，注射STZ后，成模動物整體表現(xiàn)為進食、飲水、尿量明顯增加，活動減少，皮毛光澤差。口服活性AdipoRon干預(yù)后動物進食、飲水、尿量均減少，體質(zhì)量有所增加，活動增多，皮毛光澤漸好。

喂養(yǎng)初期各組小鼠體質(zhì)量無顯著差異(P>0.05)，實驗?zāi)┢贒M組小鼠體質(zhì)量顯著低于正常對照組(P<0.05)。實驗?zāi)┢?，DM組小鼠血糖濃度顯著高于NC組 (P<0.01)，DM+L組和DM+H組顯著低于DM組(P<0.05，表1)。

2.2 口服活性AdipoRon對2型糖尿病小鼠肝臟氧化應(yīng)激的干預(yù)作用

結(jié)果表明，DM組小鼠肝臟組織中SOD、CAT活性顯著低于NC組(P<0.01)，MDA及 NOS活性顯著高于NC組(P<0.05)；DM+L組和DM+H組SOD、CAT活性顯著高于DM組(P<0.05)，MDA及 NOS 活性顯著低于DM組(P<0.05，表2)。

Tab. 1 Comparision of biochemical indices among four ±s, n=8)

NC: Normal control; DM: Diabetes model; DM+L: Diabetes model with low AdipoRon; DM+H: Diabetes model with high AdipoRon

*P<0.05vsDM group

Tab. 2 Comparision of biochemical indices among four ±s, n=8)

MDA: Malondialdehyde; SOD: Superoxide dismutase; CAT: Catalase; NOS: Nitric oxide synthase

*P<0.05vsDM group

2.3 口服活性AdipoRon對2型糖尿病小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響

結(jié)果表明，NC組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，肝竇規(guī)則，肝細(xì)胞無糖原積蓄，無空泡變性。DM組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞的胞漿內(nèi)可見大量小空泡，有的肝細(xì)胞內(nèi)見多個小空泡融合成大空泡，空泡變性，肝細(xì)胞核被擠于一邊，有大量脂肪變性，肝血竇變窄。DM+L組小鼠部分肝小葉細(xì)胞水腫，空泡變性，輕度脂肪變性。DM+H組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)空泡明顯減少，僅肝小葉周邊少數(shù)肝細(xì)胞呈脂肪變性改變。只有個別細(xì)胞水腫，空泡變性(圖1)。

Fig. 1 Comparison of hematoxylin-eosin (HE) staining on kidney tissue among four groups (400×) A: NC group; B: DM group; C: DM+L group; D: DM+H group; NC: Normal control; DM: Diabetes model; DM+L: Diabetes model with low AdipoRon; DM+H: Diabetes model with high AdipoRon

2.4 口服活性AdipoRon對2型糖尿病小鼠肝臟組織中p-IRS-1蛋白表達水平的影響

與NC組(1.196±0.025)比較，DM組(0.632±0.005)、DM+H組(0.827±0.0076)、DM+L組(0.776±0.01)小鼠肝臟組織中p-IRS-1的蛋白表達水平有所降低(P<0.05)；與DM組比較，DM+H組小鼠肝臟組織中p-IRS-1的蛋白表達水平顯著升高(P<0.05, 圖2)。

2.5 口服活性AdipoRon對2型糖尿病小鼠胰腺組織中PDX-1mRNA 表達水平影響

與NC組比較，DM組、DM+H組、DM+L組小鼠胰腺PDX-1 mRNA表達水平有所降低(P<0.05)；與DM組比較，DM+H組、DM+L組小鼠胰腺PDX-1 mRNA 表達水平顯著升高(P<0.05, 圖3)。

3 討論

AdipoRon[5]是近年發(fā)現(xiàn)的由脂肪細(xì)胞分泌的一種特異性蛋白，東京大學(xué)藥物研究所的教授等對大量能夠結(jié)合并激動脂聯(lián)素受體的小分子化合物進行了篩選，他們根據(jù)這些小分子化合物是否具有激活A(yù)MPK的能力，選擇出與脂聯(lián)素作用相似的小分子化合物，并將其中一種命名為AdipoRon，能減輕高脂飲食小鼠和遺傳肥胖小鼠的胰島素抗性，以及葡萄糖耐受不良。AdipoRon還能延長高脂飲食db/db小鼠被縮短的壽命[6]。

本實驗采用鏈脲佐菌素(STZ)構(gòu)建2型糖尿病模型，注射STZ后, 成模動物整體表現(xiàn)為進食、飲水、尿量明顯增加，體質(zhì)量減少，說明成功構(gòu)建2型糖尿病模型。有文獻報道：SOD，CAT 對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，SOD,CAT能夠反映機體的抗氧化水平；MDA,NOS是最常見的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，MDA,NOS 的含量可以衡量脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞受損傷程度[7,8]。糖尿病組小鼠肝臟組織中SOD、CAT活性明顯低于正常對照組，MDA及 NOS活性顯著高于正常對照組；高劑量AdipoRon治療組SOD、CAT活性明顯高于糖尿病組，MDA及 NOS 活性顯著低于糖尿病組，說明口服活性AdipoRon對糖尿病小鼠肝臟組織氧化應(yīng)激有一定的保護作用。文獻報道[9]，胰島β細(xì)胞凋亡與胰島素抵抗有密切關(guān)系，相比較于正常組，糖尿病模型組PDX -1是降低的，具有統(tǒng)計學(xué)意義，其原因可能為胰島β細(xì)胞凋亡增多，分泌的胰島素減少，從而出現(xiàn)胰島素抵抗。而與糖尿病模型組小鼠相比，給藥組小鼠PDX -1是上升的，具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明胰島β細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，分泌的胰島素增多，胰島素情況得到改善。有研究報道：胰島β細(xì)胞分泌胰島素后，經(jīng)血液循環(huán)到達外周靶細(xì)胞，與胰島素受體結(jié)合，經(jīng)磷酸化和去磷酸化，激活多種酶，然后活化p-IRS-1，完成下游信號蛋白的級聯(lián)反應(yīng)，促進GLUT4轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)機體內(nèi)的葡萄糖代謝，從而改善胰島素抵抗[10]。本實驗通過對小鼠肝臟p-IRS-1的測定，發(fā)現(xiàn)高劑量組小鼠肝臟p-IRS-1表達較之DM組有了明顯的上升，提示了AdipoRon可以通過提高p-IRS-1的表達而改善2型糖尿病的癥狀。研究報道[11]：氧化應(yīng)激會導(dǎo)致胰島素抵抗，本課題成功構(gòu)建2型糖尿病模型后，通過給小鼠灌胃AdipoRon治療后，能夠增強機體的抗氧化能力，從而改善胰島素抵抗。

綜上所述，本研究表明，AdipoRon對2型糖尿病小鼠肝臟組織氧化應(yīng)激有一定的干預(yù)作用，能夠降低小鼠的血糖水平，這對其臨床應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

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Intervention effects of oral active AdipoRon on liver oxidative stress in type 2 diabetic mice

XIAO Min， QU Xiao-hu， CHEN Hui， CAI Qiang-jun， XIE Ke-jian△

(Department of Biology, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

Objective: To explore the intervention effects of oral active AdipoRon on liver oxidative stress in type 2 diabetic mice, which provides basic data for clinical application. Methods: Thirty-two healthy male C57BL/6 mice were divided into 4 groups:normal group (NC,n=8), diabetes mellitus group (DM,n=8), high dose AdipoRon treatment group (DM+H,n=8) and low dose AdipoRon treatment group (DM+L,n=8). Following six weeks high fat feed, mice of DM, DM+H and DM+L were intraperitoneally injected with 40 mg/kg streptozocin (STZ), leading to type 2 diabetes. Afterwards, DM+H group and DM+L group were continuously treated with high dose and low doses of oral AdipoRon respectively for 10 days, following which, related biochemical indicators were detected. Western blot method was used to detect the p-IRS-1 protein expression in liver tissue and RT- PCR method to detect PDX-1 mRNA expression in the pancreas. Results: The blood glucose of DM group was obviously higher than that of NC group (P<0.05). Compared to that of DM group, blood glucose of DM+H group as well as DM+L group was significantly lower. Activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) in liver tissue of DM mice was significantly lower than that of NC group (P<0.05); activity of malondialdehyde (MDA) and nitric oxide synthase (NOS) in DM group significantly higher than that of NC group (P<0.05); activity of SOD and CAT in DM+L group and DM+H group obviously higher than DM group (P<0.05); activity of MDA and NOS in DM+L group and DM+H group significantly lower than DM group (P<0.05). And the p-IRS-1 protein expression in liver tissue and PDX-1 mRNA level in pancreas increased significantly (P<0.05). Conclusion: Oral active AdipoRon which reduced the blood glucose levels of mice had a certain intervention effect on liver tissue oxidative stress in type 2 diabetes mice.

AdipoRon; type 2 diabetes in mice; liver; oxidative stress

2015年度浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究計劃(實驗動物)項目 (2015C37099)

2016-05-03

2017-02-22

R587.1

A

1000-6834(2017)02-124-05

△【通訊作者】Tel： 13705883181； E-mail： xkj@wmu.edu.cn