申奏秦旋，申可佳*，熊 桀，王 肖，王宇航，吳華英，鄧 文

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖中心，河南 鄭州 450052）

護卵湯對多周期促排卵小鼠子宮內膜ER/PR蛋白表達的影響

申奏秦旋1，申可佳1*，熊 桀1，王 肖2，王宇航1，吳華英1，鄧 文1

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖中心，河南 鄭州 450052）

目的 觀察中藥護卵湯對反復多周期促排卵小鼠子宮內膜容受性的干預作用，為中醫(yī)藥輔治體外受精-胚胎移植(IVF-ET)提供更多的實驗依據(jù)。方法 建立反復多周期促排卵小鼠模型（模型組），部分給予中藥護卵湯治療（中藥組），以及未使用藥物的自然周期小鼠為正常對照（空白組）。比較各組在孕2 d、孕5 d兩個時間段的子宮形態(tài)及雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)的蛋白表達。結果 子宮內膜光學形態(tài)：與空白組和中藥組相比，孕5 d模型組小鼠子宮內膜發(fā)育明顯不良。子宮內膜ER蛋白表達：與模型組相比，孕2 d和孕5 d中藥組小鼠子宮內膜ER蛋白表達均增加，差異有統(tǒng)計學意義 （P<

護卵湯;雌激素受體;孕激素受體;子宮內膜容受性;小鼠

雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）是雌孕激素（E2和P）作用于子宮內膜，實現(xiàn)子宮內膜和胚胎發(fā)育的同步化，從而保證胚胎成功植入的受體分子，也被證實是IVF-ET技術中與子宮內膜容受性密切相關的分子[1-3]。課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)護卵湯可以協(xié)調單次長方案超排卵大鼠E2、P、P/E2及Th1/ Th2細胞因子比值，改善子宮內膜容受性，促進胚胎著床，提高妊娠率[4-6]。為了進一步結合臨床闡明護卵湯參與IVF-ET的作用機制，本實驗觀察護卵湯對多周期促排卵小鼠子宮內膜形態(tài)及ER和PR蛋白表達的影響，現(xiàn)將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SPF級昆明雌性小鼠60只，體質量為19～25 g。第4周購入性成熟雄性小鼠30只。以上動物均由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(湘)2009-0001。

1.1.2 藥物 中藥煎劑：護卵湯的組方為熟地黃10 g，生地黃10 g，沙參10 g，石斛10 g，山藥10 g，蓮子10 g，桑椹子10 g，覆盆子10 g，菟絲子10 g，月季花10 g，蓮子心3 g，肉蓯蓉10 g，甘草3 g。以上飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房，購回后加水浸泡2 h，火上煎煮3次，將3次煎液混合濃縮成1 g/mL的藥液，滅菌，4℃保存供實驗使用。西藥：注射用尿促性腺激素(HMG)由中國麗珠集團麗寶生物化學制藥有限公司生產(chǎn)，批號1007234；注射用絨毛膜促性腺激素（HCG）由中國麗珠集團麗寶生物化學制藥有限公司生產(chǎn)，批號1006137。

1.1.3 試劑 HE染色：10%甲醛固定，二甲苯脫蠟，70%、80%、95%酒精，蘇木素，1%鹽酸酒精，1%稀氨水，伊紅，二甲苯透明標本；ER、PR測定：SP免疫組化染色檢測。以上試劑均購自湖南麗欣生物有限公司或自己配制。

1.1.4 儀器 光學顯微鏡(日本Olympus CX21)；石蠟切片機(英國Shandon 325)；超薄切片機（瑞典LKB-Ⅲ）；顯微圖像攝像系統(tǒng) (麥克奧迪實業(yè)集團公司Motic B5)；圖像分析軟件(美國Image-Pro Plus 6.0)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方法[4-7]將60只SPF級雌性小鼠隨機分為3組：中藥組、模型組、空白組。各組正常喂養(yǎng)，且在固定時間段進行藥物灌胃及腹腔注射。小鼠的用藥劑量參照徐淑云等[8]方法,按60 kg成人體表面積換算。每天下午5時給予中藥組小鼠中藥煎劑0.84 g/kg灌胃，模型組和空白組等劑量生理鹽水灌胃。每個促排卵周期的第一天下午6時中藥組和模型組小鼠腹腔注射HMG 0.55 U/kg，48 h后即第三天下午6時腹腔注射HCG0.72 U/kg，空白組在同時間段腹腔注射同劑量生理鹽水安慰，此為一個促排卵周期。間隔3 d，重復該過程，連續(xù)5個周期。所有雌鼠在末次周期注射HCG當日與雄鼠按2∶1同籠過夜,于次日晨6時觀察陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓記為孕1 d。

1.2.2 標本采集 發(fā)現(xiàn)有陰栓的雌鼠立即腹腔注射HCG，每組在HCG注射后48 h（孕2 d）和孕5 d這兩個時間段，分別脫頸處死10只雌性小鼠，解剖板固定，腹中線剪開，沿雙側子宮角上行，鈍性分離周圍軟組織，獲取卵巢和子宮。

1.2.3 子宮內膜光學形態(tài)檢測 將子宮組織放入10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，間斷連續(xù)切片，切片厚4 μm，HE染色，光鏡下觀察。

1.2.4 子宮ER和PR蛋白表達檢測 10%甲醛固定子宮組織，常規(guī)脫水，包埋、切片，SP免疫組化染色法使之出現(xiàn)免疫陽性反應產(chǎn)物 （代表ER和PR蛋白表達）并于顯微鏡下觀察。細胞核有棕色顆粒為陽性細胞，400倍鏡下每張切片隨機選取5個不重復視野，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分別測定子宮ER和PR蛋白表達的光密度（OD）值，然后分別求得平均OD（IOD），IOD越大表示所測蛋白的含量越多。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0進行統(tǒng)計處理，所得數(shù)據(jù)為計量資料用“±s”表示。多組計量資料間比較時，方差齊性采用單因素方差分析的LSD檢驗方法，方差不齊采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠子宮外觀特點

中藥組、西藥組和模型組小鼠子宮外觀色澤多紅潤，各組均可見子宮蒼白、積水情況，肉眼觀察下外觀差異無明顯區(qū)別。

2.2 各組小鼠子宮內膜光學形態(tài)比較

孕2 d（見圖1）：空白組內膜少數(shù)腺體發(fā)育，間質內少量基質細胞增生，無蛻膜樣改變。模型組內膜腺體發(fā)育不良，間質疏松水腫，部分基質細胞發(fā)育成前蛻膜細胞。中藥組內膜少量腺體發(fā)育，部分腺體形態(tài)不規(guī)則，間質少量血管增生，基質細胞增多。孕5 d（見圖2）：空白組內膜腺體數(shù)目多，腺腔內大量分泌物，間質內血管明顯增多，基質細胞增生明顯并呈蛻膜樣改變。模型組內膜腺體數(shù)目少，腺腔狹窄分泌物少，間質血管較少，大量基質細胞聚集。中藥組內膜腺體發(fā)育且數(shù)目增多，間質內血管增生。

圖1 孕2 d各組小鼠子宮內膜組織形態(tài)光鏡圖（HE，×400）

圖2 孕5 d各組小鼠子宮內膜組織形態(tài)光鏡圖（HE，×400）

2.3 各組小鼠子宮內膜ER蛋白表達

孕2 d（見表1及圖3）：與空白組相比，中藥組、模型組子宮內膜ER蛋白表達無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，中藥組子宮內膜ER蛋白表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。孕5 d（見表1及圖4）：與空白組相比，中藥組子宮內膜ER蛋白表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，中藥組子宮內膜ER蛋白表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 各組小鼠子宮內膜PR蛋白表達

孕2 d（見表1及圖5）：與空白組相比，中藥組子宮內膜PR蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），模型組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，中藥組子宮內膜PR蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。孕5 d（見表1及圖6）：與空白組相比，中藥組子宮內膜PR蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），模型組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，中藥組子宮內膜PR蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表1 各組小鼠子宮內膜蛋白表達IOD值 (±s，n=10)

表1 各組小鼠子宮內膜蛋白表達IOD值 (±s，n=10)

注：與空白組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與中藥組比較△P＜0.05，△△P＜0.05。

組別中藥組模型組空白組ER蛋白平均光密度 PR蛋白平均光密度孕2 d 孕5 d 孕2 d 孕5 d 0.242±0.028 0.150±0.049△0.190±0.068 0.396±0.059▲0.276±0.046△0.190±0.096△0.296±0.055▲▲0.170±0.016△△0.178±0.047△△0.318±0.047▲▲0.178±0.031△△0.186±0.028△△

圖3 孕2 d各組小鼠子宮內膜ER蛋白表達（免疫組化，×400）

圖4 孕5 d各組小鼠子宮內膜ER蛋白表達（免疫組化，×400）

圖5 孕2 d各組小鼠子宮內膜PR蛋白表達（免疫組化，×400）

圖6 孕5 d各組小鼠子宮內膜PR蛋白表達（免疫組化，×400）

3 討論

促排卵治療是IVF－ET獲取卵子的常用方法，子宮內膜容受性是IVF－ET成功妊娠的關鍵因素。已有研究證實促排卵藥物對子宮內膜容受性有不利影響，中醫(yī)藥輔助IVF-ET能改善子宮內膜容受性[4，9-14]。本實驗在課題組前期研究基礎上，進一步探討中藥護卵湯對子宮內膜容受性的作用機制。選擇雌孕激素的細胞內受體ER和PR為觀察指標，結合臨床IVF-ET中大多數(shù)患者需要多個促排卵治療的實際情況，選擇多周期促排卵小鼠為模型，觀察中藥護卵湯對多周期促排卵小鼠著床期子宮內膜光學形態(tài)及ER/PR的影響。實驗結果顯示孕2 d和孕5 d兩個時間段模型組的子宮內膜基質細胞及腺體均發(fā)育不良，且在孕5 d明顯滯后于中藥組及空白組。促排卵藥物對著床期子宮內膜有不利影響，會導致子宮內膜成熟度降低，模型組和中藥組是反復使用促排卵藥物的小鼠，使用中藥護卵湯的小鼠子宮內膜發(fā)育情況優(yōu)于模型組，提示護卵湯對促排卵小鼠著床期子宮內膜有保護作用，與前期實驗相符。

子宮內膜在著床期受雌孕激素作用發(fā)生一系列與胚泡發(fā)育同步的、有利于胚泡著床的形態(tài)結構變化,從而使胚泡順利著床，雌孕激素這種生物學作用的強弱不但取決于自身含量的變化，同時也取決于其受體分子ER和PR的含量變化。課題組前期實驗已發(fā)現(xiàn)護卵湯能改變促排卵大鼠E2、P、P/E2及Th1/Th2細胞因子含量，改善子宮內膜容受性，促進胚胎著床，提高妊娠率[4-6]。本次實驗結果發(fā)現(xiàn)中藥組小鼠孕2 d和孕5 d子宮內膜ER和PR蛋白表達均高于模型組，證實了護卵湯對著床期子宮內膜的有利影響，并進一步揭示護卵湯輔助IVF-ET的作用機制還表現(xiàn)在其能提高促排卵小鼠著床期子宮內膜ER和PR蛋白表達。綜上所述，在西醫(yī)多周期促排卵過程中輔以中藥護卵湯治療，能減輕小鼠子宮內膜炎癥，增加子宮內膜ER/PR蛋白表達，改善多周期促排卵小鼠的子宮內膜容受性。

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（本文編輯 李 杰）

Effects of Huluan Decoction on Expression of ER and PR in Endometrium of Multi-Period Ovulation Induction Mice

SHEN Zouqinxuan1,SHEN Kejia1*,XIONG Jie1,WANG Xiao2,WANG Yuhang1,WU Huaying1,DENG Wen1
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,China)

Objective To observe the effects of Huluan decoction on expression of ER and PR in endometrium of multi-period ovulation induction mice,and to provide more related basis for the effectiveness of Huluantang assisting in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET).Methods The multi-period ovulation induction mice models were built.The Chinese medicine group was administrated with Huluan decoction,the normal group was given no drugs.The morphology of endometrium and expression of ER and PR in endometrium were observed on the 2nd day and the 5th day of pregnant(P2 and P5).Results Compared with those in normal group and Chinese medicine group,the growth and development of the P5 endometrium in the model group was unhealthy.Compared with those in the model group,the expression of ER in the P2 and P5 endometriumin of Chinese medicine group increased significantly (P＜0.05).Compared with those in the normal group, the expression of ER in the P5 endometrium of the Chinese medicine group increased significantly(P＜0.05).The expression of PR in the P2 and P5 endometrium in the Chinese medicine group increased more obviously than those in model group and normal group(P＜0.01).Conclusion The Chinese medicine of Huluan decoction could promote the growth and development of endometrium and increase the expression of ER and PR in endometrium,which may improve the endometrial receptivity in multi-period ovulation induction mice.

Huluan decoction;ER;PR;endometrial receptivity;mice

R271.41;R711

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.05.003

2016-11-03

國家自然科學基金項目資助（81303003，81403427）；湖南省大學生研究性學習和創(chuàng)新性實驗計劃項目資助（181）。

申奏秦旋，女，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)婦科。

*申可佳，女，醫(yī)學博士，副教授，E-mail:shen_kejia@163.com。本文引用：申奏秦旋，申可佳，熊 桀，王 肖，王宇航，吳華英，鄧 文.護卵湯對多周期促排卵小鼠子宮內膜ER/PR蛋白表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017,37(5):473-476.

0.05 ）；與空白組相比，孕5 d中藥組小鼠子宮內膜ER蛋白表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。子宮內膜PR蛋白表達：孕2 d和孕5 d中藥組小鼠子宮內膜PR蛋白表達均較模型組和空白組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結論 在西醫(yī)多周期促排卵過程中輔以中藥護卵湯，能促進子宮內膜生長發(fā)育，增加子宮內膜ER/PR蛋白表達，改善多周期促排卵小鼠的子宮內膜容受性。