廖俞強(qiáng)，鄧奕輝，顏佳博，李鈺佳，李定祥*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

滋陰活血解毒方對(duì)AGEs誘導(dǎo)VEC損傷黏附分子及凝血相關(guān)因子表達(dá)的影響

廖俞強(qiáng)，鄧奕輝，顏佳博，李鈺佳，李定祥*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 觀察滋陰活血解毒方對(duì)糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end-producs，AGEs）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）損傷的影響及其黏附分子、凝血相關(guān)因子表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討該方對(duì)AGEs誘導(dǎo)VEC損傷的保護(hù)作用。方法 以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以終濃度（100 mg/L）的AGEs誘導(dǎo)HUVEC損傷。各模型組及給藥組細(xì)胞分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h。在顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，并以Western-blot法檢測(cè)各組黏附分子VCAM-1、ICAM-1的表達(dá)；以RT-PCR方法檢測(cè)TF、TM mRNA表達(dá)。結(jié)果 相對(duì)于空白組細(xì)胞，模型組細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，多數(shù)細(xì)胞變形皺縮，胞膜輪廓模糊，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)粗糙樣顆粒變化，VCAM-1、ICAM-1、TF表達(dá)明顯上調(diào)，TM表達(dá)下調(diào)，且在作用24 h后差異有顯著性意義（P<0.01）；相同時(shí)間點(diǎn)，給藥組較模型組圓縮形細(xì)胞減少，能下調(diào)VCAM-1、ICAM-1、TF表達(dá)，上調(diào)TM表達(dá)，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)更明顯（P<0.01）。結(jié)論 滋陰活血解毒方能抑制AGEs對(duì)VEC的損傷，降低黏附分子的表達(dá)，下調(diào)表達(dá)組織因子mRNA轉(zhuǎn)錄，上調(diào)血栓調(diào)節(jié)素mRNA轉(zhuǎn)錄。

滋陰活血解毒方；糖基化終末產(chǎn)物；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；VCAM-1；ICAM-1；TF；TM

隨著生活水平的提高和生活方式的改變，糖尿病的患病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅身體健康。其中，糖尿病合并腦梗死是糖尿病致死致殘的重要原因，早期防治非常重要[1-2]。研究表明，長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end-producs，AGEs）增加，進(jìn)而促進(jìn)糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[3-4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，滋陰活血解毒方有抗糖尿病合并缺血性腦損傷的作用[5]。本實(shí)驗(yàn)以血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1）、表達(dá)組織因子-1（tissuefactor，TF）、血栓調(diào)節(jié)素（thrombomodulin，TM）及細(xì)胞形態(tài)變化為觀察目標(biāo)，研究滋陰活血解毒方對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）損傷的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑及儀器

人血清白蛋白（Sigma，批號(hào)：A8230-500），D-葡萄糖（Amresco，批號(hào)：0188），青霉素（Amresco，批號(hào)：A8180-1），慶大霉素（Amresco，批號(hào)：G8170-500），吩嗪硫酸二甲酯（Sigma，批號(hào)：P8110-1），胰蛋白酶-EDTA消化液（solarbio，批號(hào)：T1320），磷酸緩沖液 （phosphate buffer saline，PBS）（Hyclone，批號(hào)：SH30256.01），兔抗ICAM-1第一抗體（abcam，批號(hào)：Ab53013），兔抗VCAM-1（abcam，批號(hào)：Ab134047），TF及TM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)公司，批號(hào)：A150311）。FA-N精密天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)、Motic BA210T顯微鏡 (杭州明凱科技有限公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥劑配制

滋陰活血解毒方（熟地黃20 g，枸杞子12 g，山茱萸12 g，黃芪 30 g，黃連 10 g，川芎 12 g，地龍12 g，丹參20 g，水蛭8 g，石菖蒲 8 g），購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。煎煮并濃縮成每1毫升含生藥量50 mg，冷卻備用。

糖基化終末產(chǎn)物修飾人血清白蛋(advanced gly cosylation end products-modified human serum albnmin，AGEs-HSA)，用糖孵育法[6]，在總?cè)萘? L磷酸緩沖液中加入終濃度1.75 g/L的人血清白蛋白1.75g，終濃度100 mmol/L的D-葡萄糖18 g，終濃度為 200 mg/L的青霉素 200 mg、終濃度為70 μg/L慶大霉素70 μg和終濃度為1.5 mmol/L吩嗪硫酸二甲酯459 mg，37℃恒溫箱中孵育5周。以其他條件相同但不使用濃糖的緩沖液孵育的蛋白作為比對(duì)。5周后用無菌PBS(酸堿值為7.4)過濾游離的葡萄糖并消除雜菌，完成后4～5℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）（吉滿生物科技上海有限公司貨號(hào)GM-070036H）復(fù)蘇后，用0.25%胰蛋白酶聯(lián)合0.02%EDTA溶解附壁細(xì)胞，待圓形細(xì)胞逐漸縮小，立即將消化液撤出，把細(xì)胞轉(zhuǎn)至含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中，輕輕吹打內(nèi)皮細(xì)胞，并以PBS洗滌后離心去除EDTA，傳代至培養(yǎng)板中，放入37℃、5%二氧化碳無菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h換液1次，72 h傳代1次，連續(xù)傳4代后，選擇80%融合度、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)

參考本課題組前期研究結(jié)果及文獻(xiàn)資料[7]，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為7組（A組為空白組，即正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的 HUVEC細(xì)胞；B、C、D組為模型組；E、F、G組為給藥組），每組設(shè)置5個(gè)孔，B、C、D組加入終濃度（100 mg/L）的AGEs-HSA，于37℃、5%二氧化碳無菌培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)孵育（B組12 h、C組24 h、D組 48 h）；E、F、G組加入終濃度 （100 mg/L）的AGEs-HSA于37℃、5%二氧化碳無菌培養(yǎng)箱中孵育，同時(shí)用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞收縮變圓，胞體變小，立即加入終濃度為50 mg/mL（此藥物濃度參照本課題組前期研究結(jié)果）滋陰活血解毒方藥液[7]，三組分別于37℃、5%二氧化碳無菌培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育12、24、48 h。

2.3 指標(biāo)測(cè)定

顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，提取各組樣品，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育、顯色曝光后，以Western blot法檢測(cè)HUVEC培養(yǎng)液中VCAM-1、ICAM-1蛋白質(zhì)的表達(dá)，并用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析；分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，提取各組細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書操作步驟，經(jīng)電泳、RNA反轉(zhuǎn)錄、RT-qPCR等程序，以熒光定量RT-PCR法檢測(cè)HUVEC培養(yǎng)液中TF、TM mRNA的表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的觀察

鏡下觀察，空白組細(xì)胞梭形單層生長(zhǎng)，鑲嵌排列，彼此不重疊，胞膜明顯，細(xì)胞明亮，融合后的細(xì)胞為單層鵝卵石狀排列；模型組細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞變形皺縮，胞膜輪廓模糊，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)粗糙樣顆粒變化；與模型組比較，給藥組都有不同程度的逆轉(zhuǎn)這種損傷的作用，特別是48h后有較明顯的形態(tài)變化，見梭形正常細(xì)胞較多，圓縮形細(xì)胞減少。見圖1。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)光鏡圖（×400倍）

3.2 VCAM-1、ICAM-1蛋白表達(dá)比較

與空白組比較，模型組 12 h及模型組 48 h VCAM-1、ICAM-1表達(dá)上調(diào)（P<0.05），且模型組24 h差異有顯著性意義（P<0.01）；而在相同作用時(shí)間點(diǎn)，與模型組比較，給藥組12 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），給藥組24 h ICAM-1、VCAM-1表達(dá)下調(diào)（P<0.05），且給藥組48 h差異有顯著性意義（P<0.01）。見表1，圖2-3。

3.3 TF、TM mRNA表達(dá)比較

與空白組比較，模型組TF表達(dá)上調(diào)，TM表達(dá)下調(diào)（P<0.05），且模型組24 h差異有顯著性意義（P<0.01）；而在相同作用時(shí)間點(diǎn)，與模型組比較，給藥組12 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），給藥組24 h TF表達(dá)下調(diào)，TM表達(dá)上調(diào)（P<0.05），且給藥組48 h差異有顯著性意義（P<0.01）。見表2。

表1 各組HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中VCAM-1和ICAM-1灰度值 （±s，n=5）

表1 各組HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中VCAM-1和ICAM-1灰度值 （±s，n=5）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別空白組模型組12 h模型組24 h模型組48 h給藥組12 h給藥組24 h給藥組48 h F值P值VCAM-1 15.75±1.39 42.93±1.91* 47.66±1.50** 40.68±1.30* 42.06±1.50 21.92±1.03#9.31±0.65##15.34 0.00 ICAM-1 9.89±0.86 48.45±1.71* 50.99±1.79** 45.08±1.43* 44.53±1.37 23.82±1.05#12.83±0.96##19.56 0.00

圖2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液VCAM-1的蛋白表達(dá)

圖3 .各組細(xì)胞培養(yǎng)液ICAM-1的蛋白表達(dá)電泳圖

表2 各組HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中TF、TM mRNA相對(duì)表達(dá)量 （±s，n=5）

表2 各組HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液中TF、TM mRNA相對(duì)表達(dá)量 （±s，n=5）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別空白組模型組12 h模型組24 h模型組48 h給藥組12 h給藥組24 h給藥組48 h F值P值TF 1.0±0.00 2.41±0.08* 2.49±0.05** 2.11±0.03* 2.37±0.11 1.06±0.05#0.64±0.01##26.63 0.00 TM 1.0±0.00 0.44±0.01* 0.37±0.02** 0.57±0.04* 0.44±0.02 0.97±0.05#1.17±0.05##34.57 0.00

4 討論

糖尿病合并腦梗死屬于中醫(yī)學(xué)“消渴合并中風(fēng)”，其病機(jī)特點(diǎn)為虛（氣陰兩虛）、瘀（瘀血）、毒（熱毒），益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、清熱解毒為其基本治法。滋陰活血解毒方由熟地黃、黃芪、枸杞子、山茱萸、黃連、地龍、丹參、川芎、水蛭、石菖蒲組成，方中熟地黃、山茱萸、枸杞子滋補(bǔ)腎陰，黃芪健脾益氣，丹參、川芎、水蛭、地龍活血通絡(luò)，黃連、石菖蒲解毒化痰，諸藥合用，共奏滋陰益氣活血解毒之功，是祛邪而不傷正，扶正而不留滯。本課題組基于上述基本病機(jī)和治法，既往研究發(fā)現(xiàn)，滋陰活血解毒方能顯著改善糖尿病并發(fā)腦梗死患者的臨床癥狀，改善神經(jīng)功能缺損程度。

研究認(rèn)為，高血糖可導(dǎo)致體內(nèi)糖基化蛋白的大量堆積,形成的AGEs是造成糖尿病血管病變的重要因素。糖尿病血管并發(fā)癥的共同病理機(jī)制是細(xì)胞變形，基底膜增厚，細(xì)胞異常增殖。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入100 mg/L AGEs-HSA后，VEC細(xì)胞數(shù)量明顯增加，變形收縮，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)粗糙樣顆粒變化，細(xì)胞異常增殖。細(xì)胞增生導(dǎo)致血管壁增厚，血管彈性降低，導(dǎo)致血管損傷。當(dāng)加入終濃度50 mg/mL滋陰活血解毒方藥液后，VEC細(xì)胞異常增殖有顯著的改善。

AGEs引起VEC結(jié)構(gòu)改變甚至發(fā)生自噬或凋亡，使ICAM-1、VCAM-1和TF表達(dá)上調(diào)，TM下調(diào)，導(dǎo)致炎性反應(yīng)和內(nèi)皮源性局部血栓形成，在血管損傷中發(fā)揮著重要作用[8]。ICAM-1和VCAM-1作為免疫球蛋白基因超家族成員，在介導(dǎo)炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附過程中有著重要的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)下高糖可促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，這也是受內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子 ICAM-1和VCAM-1調(diào)節(jié)的[10]。TF是一種跨膜糖蛋白，為凝血因子Ⅶa在細(xì)胞表面的受體和輔助因子。在生理?xiàng)l件下血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)或極微量表達(dá)TF，且大部分血管內(nèi)皮細(xì)胞表面TF是以無活性成簇狀態(tài)存在的，TF與因子Ⅶ結(jié)合并活化之，形成TF-Ⅶa復(fù)合物，進(jìn)而激活因子Ⅹ和因子Ⅸ，同時(shí)啟動(dòng)外、內(nèi)源性兩條凝血途徑，在體內(nèi)導(dǎo)致凝血酶及纖維蛋白的產(chǎn)生，最終形成血栓[11]。研究表明，急性期血清TF與糖尿病腦梗死患者的病情嚴(yán)重程度相關(guān)[12]。TM的作用與TF相反，它是一種抗凝蛋白，是血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并位于細(xì)胞表面的凝血酶受體，血漿可溶性TM可作為反映血管內(nèi)皮損傷的敏感指標(biāo)[13]。TM能有效與凝血酶結(jié)合，使之不能活化纖維蛋白原，從而抑制血栓形成，防止凝血；同時(shí)TM結(jié)合凝血酶后可使蛋白C活化而發(fā)揮抗凝作用，進(jìn)而有效地防止血栓形成，維持血液的非凝狀態(tài)[14]。本實(shí)驗(yàn)表明，加入100 mg/LAGEs-HSA后模型組VCAM-1、ICAM-1、TF表達(dá)明顯上調(diào)，TM表達(dá)下調(diào)，且在作用24 h后最顯著（P<0.01）；而相同時(shí)間點(diǎn)，給藥組與模型組比較，則有抑制ICAM-1、VCAM-1和TF表達(dá)，上調(diào)TM表達(dá)的作用，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)更明顯（P<0.01）。

綜上所述，滋陰活血解毒方能有效地抑制糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減少回縮變形的細(xì)胞，具有保護(hù)細(xì)胞的作用，這種保護(hù)作用可能與降低ICAM-1、VCAM-1表達(dá)，以及下調(diào)TF mRNA轉(zhuǎn)錄，上調(diào)TM mRNA轉(zhuǎn)錄，從而抑制與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞黏附過程和內(nèi)皮源性局部血栓形成有關(guān)。同時(shí)也證明了滋陰活血解毒方具有改善糖尿病并發(fā)腦梗死血管損傷的作用。VEC的體外培養(yǎng)，為進(jìn)一步探討AGEs誘導(dǎo)VEC損傷提供了一個(gè)良好的體外細(xì)胞模型，為今后進(jìn)一步從細(xì)胞分子水平研究中醫(yī)藥防治糖尿病血管病變提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯 楊 瑛）

Influence of Ziyin Huoxue Jiedu Decoction on Expression of Adhesion Molecules and Blood Coagulation Related Factors in Vascular Endothelial Cells Induced by Advanced

Glycation End-Products

LIAO Yuqiang,DENG Yihui,YAN Jiabo,LI Yujia,LI Dingxiang*（Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

Objective To investigate the influence of Ziyin Huoxue Jiedu decoction on the expression of adhesion molecules and blood coagulation related factors in the vascular endothelial cells (VEC)induced by advanced glycation end-products(AGEs).Methods The human umbilical vein endothelial cell as the subjects,the human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)damage were induced by AGEs with the final concentration (100 mg/L),and the cells were continually cultured for 12,24,48 h.The cell morphological changes were observed,the dhesion molecule VCAM-1 and ICAM-1 expression were determined by western-blot.The TF and TM mRNA expression were detected by RT-PCR method.Results Compared with the blank group,the model group cell was abnormal proliferation,cell number increased obviously,most of the cell deformation shrinkage,cell membrane hazy outline,a rough sample are observed in the cell.The VCAM 1,ICAM-1,TF expression significantly raised,TM expression reduced.There was significant diffrence after 24 h （P<0.01）.Compared with the model group,the VCAM-1,ICAM-1,TF expression in medicine group down-regulated,TM expression up-regulated,the effect was stronger along with time（P<0.01）.Conclusion Ziyin Huoxue Jiedu decocotion could inhibit the damage of VEC in-duced by AGEs,reduce the expression of adhesion molecules,down-regulate the expression of tissue factor mRNA transcription,up-regulate thrombomodulin mRNA transcription.

Ziyin Huoxue Jiedu decocotion；advanced glycation end-products；human umbilical vein endothelial cells；VCAM-1；ICAM-1；TF；TM

R285.5；R393

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.05.006

2016-12-18

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(14JJ2113)；湖南省中醫(yī)藥科研基金資助項(xiàng)目（201606）；湖南省教育廳資助項(xiàng)目（16K063）資助；中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)湖南省重點(diǎn)學(xué)科資助。

廖俞強(qiáng)，男，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學(xué)。

*李定祥，男，副教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：ldxlzy@hotmail.com。

本文引用：廖俞強(qiáng)，鄧奕輝，顏佳博，李鈺佳，李定祥.滋陰活血解毒方對(duì)AGEs誘導(dǎo)VEC損傷黏附分子及凝血相關(guān)因子表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,37(5):485-488.