傅榕賡，楊辰枝子，嚴(yán)建業(yè)，翁 臻，周 鑫，李林和，熊廣華，廖端芳*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)人文社科學(xué)院，湖南 長沙 410208；3.國家重點(diǎn)學(xué)科國家中醫(yī)藥管理局病理生理實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208）

水楊酰苯胺類mglu5拮抗劑的設(shè)計(jì)、合成及活性研究

傅榕賡1，楊辰枝子2，嚴(yán)建業(yè)1，翁 臻1，周 鑫1，李林和1，熊廣華3，廖端芳1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)人文社科學(xué)院，湖南 長沙 410208；3.國家重點(diǎn)學(xué)科國家中醫(yī)藥管理局病理生理實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208）

目的 利用骨架躍遷思想設(shè)計(jì)并合成新型水楊酰苯胺類代謝型谷氨酸受體5(metabotropic glutamate receptor 5,mglu5)拮抗劑。方法 將取代水楊酸與二取代苯胺縮合得目標(biāo)化合物I-IV，用核磁共振和質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，熒光測鈣流法進(jìn)行拮抗mglu5活性測定。結(jié)果 設(shè)計(jì)的目標(biāo)化合物對(duì)mglu5具有明顯的拮抗活性，其中化合物I拮抗活性最好，IC50為0.079 μmol/L。結(jié)論 水楊酰苯胺類化合物為潛在的新型mglu5拮抗劑，值得進(jìn)一步研究。

水楊酰苯胺；代謝型谷氨酸受體5拮抗劑；骨架躍遷

代謝型谷氨酸受體 5(metabotropic glutamate receptor5,mglu5)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛存在，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突出功能發(fā)揮、神經(jīng)系統(tǒng)疾病如Alzheimer’s disease等方面均發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，mglu5不僅存在于腦組織，在許多外周器官和組織中也有表達(dá)，mglu5其表達(dá)及活性的異常還與惡性腫瘤（如肝癌）的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2]。因此，mglu5已成為相關(guān)疾病新藥研究的熱門靶點(diǎn)。

1 水楊酰苯胺類mglu5 拮抗劑的設(shè)計(jì)

目前 mglu5拮抗劑代表骨架主要有二芳基類直線型分子，如圖1所示，二芳基乙烯 （SIB-1893）、二芳基乙炔（MPEP）以及二芳基偶氮化合物（SIB-1757）[3-4]。其中MPEP為目前最常用的工具藥之一。除了直線型骨架外，近年來還報(bào)道了一類以4-苯胺基喹唑啉為骨架的 mglu5拮抗劑如化合物1[5]。

圖1 代表性mglu5受體拮抗劑

基于骨架躍遷的藥物設(shè)計(jì)是近年來迅速發(fā)展的尋找新結(jié)構(gòu)先導(dǎo)化合物的有效方法。為了尋找新型mglu5拮抗劑，本課題組發(fā)現(xiàn)水楊酰苯胺類化合物結(jié)構(gòu)中的2位羥基與酰胺羰基通過分子內(nèi)氫鍵形成一個(gè)六元環(huán)構(gòu)型，該構(gòu)型與母核為4-苯胺基喹唑啉的mglu5拮抗劑空間構(gòu)型具有相似性 (如圖2所示)。此外，水楊酰苯胺結(jié)構(gòu)與SIB-1757結(jié)構(gòu)中兩個(gè)疏水芳環(huán)在化學(xué)空間上具有一定的重疊，水楊酰苯胺中的羥基與SIB-1757結(jié)構(gòu)中的羥基能都重疊。因此，本文將水楊酰苯胺這一分子骨架與4-苯胺基喹唑啉分子骨架進(jìn)行骨架躍遷，考慮到水楊酰苯胺的分子柔性度較4-苯胺基喹唑啉高，采用二取代的苯胺作為取代基，以期望提高mglu5的結(jié)合，設(shè)計(jì)并合成了4個(gè)水楊酰苯胺類新型的mglu5拮抗劑。以MPEP為陽性對(duì)照，采用熒光測鈣流法篩選化合物對(duì)mglu5的體外拮抗活性。

圖2 水楊酰苯胺mglu5拮抗劑的設(shè)計(jì)

如圖3所示，4個(gè)目標(biāo)化合物均以5-氯水楊酸或5-溴水楊酸為原料，經(jīng)酚羥基乙酰化后與二取代苯胺縮合制備目標(biāo)化合物。

圖3 目標(biāo)化合物的合成路線

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

X-4數(shù)字顯示微熔點(diǎn)測定儀 （上海精科儀器有限公司）；Varian inova-400型核磁共振譜儀 （美國Varian公司）；TMS為內(nèi)標(biāo)，DMSO-d6為溶劑；Agilent 1946B ESI-MS型質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）5-氯水楊酸、5-溴水楊酸、2-氯-4-三氟甲基苯胺、2-氯-4-氰基苯胺、3,5-二氯苯胺、3-氯-5-三氟甲基苯胺為化學(xué)純，購自元素商城；其他試劑均為分析純。

2.2 化合物的合成步驟

2.2.1 5-溴乙酰水楊酸的合成 將2 g 5-溴水楊酸、7 mL Ac2O、3滴吡啶加入100 mL圓底燒瓶，升溫?cái)嚢柚粱亓?，回流反?yīng)1 h，將反應(yīng)液緩慢傾倒至冰水中，攪拌2 h，抽濾，干燥得白色固體（2.4 g，收率100%）即為5-溴乙酰水楊酸。無需純化即可投入下一步反應(yīng)。

2.2.2 5-氯乙酰水楊酸的合成 參照“2.2.1”方法制備，得白色粉末固體5-氯乙酰水楊酸。無需純化即可投入下一步反應(yīng)。

2.2.3 目標(biāo)化合物I的合成 將0.5 g 5-氯乙酰水楊酸和5 mL氯化亞砜滴加入圓底燒瓶，升溫至80℃，攪拌反應(yīng)2 h。將所得溶液濃縮至干，濃縮液溶于5 mL二氯甲烷，冰浴下緩慢滴加入含有吡啶、3,5-二氯苯胺的二氯甲烷溶液，攪拌反應(yīng)1 h。TLC確定反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)液濃縮后溶于THF，并加入NaOH調(diào)至pH為10，攪拌10 min，后將溶液調(diào)至pH為 7抽濾得固體即為目標(biāo)化合物 I。收率：15%，mp：245～246℃。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ：11.44(s,1H,OH),10.56(s,1H,NH), 7.83(d,J=2.4 Hz,3H,Ar-H),7.47(dd,J=2.4,2.4 Hz,1H,Ar-H),7.36 (s,1H,Ar-H),7.03 (d,J= 8.8,1H,Ar-H)。ESI-MS(m/z):314.9610(M-H)-。

2.2.4 目標(biāo)化合物II的合成 將5-氯乙酰水楊酸和3-氯-5-三氟甲基苯胺作為反應(yīng)物。制備方法同“2.2.3”，得白色固體，收率：17%，mp：203～205℃。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:11.41 (s,1H, OH),10.71 (s,1H,NH),8.13 (d,J=7.2 Hz,2H, Ar-H),7.84(d,J=2.4 Hz,1H,Ar-H),7.61(s,1H, Ar-H),7.48 (dd,J=2.8,2.4 Hz,1H,Ar-H),7.03 (d,J=8.6 Hz,1H,Ar-H)。ESI-MS (m/z):348.986 0(M-H)-。

2.2.5 目標(biāo)化合物III的合成 將5-溴乙酰水楊酸和2-氯-4-三氟甲基苯胺作為反應(yīng)物。制備方法同“2.2.3”，得白色固體，收率：23%，mp：201～203℃。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:11.47 (s,1H, NH),8.59(s,1H,OH),8.59(s,1H,Ar-H),7.74 (d,J=2.4 Hz,1H,Ar-H),7.65(d,J=2.4 Hz,1H, Ar-H),7.62 (dd,J=8.2,2.4 Hz,1H,Ar-H),7.59 (dd,J=8.6,2.4 Hz,1H,Ar-H),6.97(d,J=4.0 Hz, 1H,Ar-H)。ESI-MS(m/z):392.9451(M-H)-。

2.2.6 目標(biāo)化合物IV的合成 將5-氯乙酰水楊酸和 2-氯-4-氰基苯胺作為反應(yīng)物。制備方法同“2.2.3”，得白色固體，收率：25%，mp：263～265℃。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:12.45 (s,1H, OH),11.25 (s,1H,NH),8.71 (d,J=8.8 Hz,1H, Ar-H),8.19(d,J=1.6 Hz,1H,Ar-H),7.96(d,J= 2.8 Hz,1H,Ar-H),7.88 (dd,J=1.6,1.6Hz,1H, Ar-H),7.53 (dd,J=2.8,2.8 Hz,1H,Ar-H)，7.09（d，J=8.8 Hz,1H,Ar-H）。ESI-MS(m/z):306.992 1(M-H)-。

2.3 目標(biāo)化合物I-IV的mglu5拮抗活性測定[6]

檢測拮抗劑活性時(shí)，將激動(dòng)劑L-Glu和拮抗劑分別配制成10×測試濃度，并將其等體積混合成5×測試濃度，以25 μL/s的速度將25 μL的化合物加入到表達(dá)mglu5的HEK-293細(xì)胞中，在加入化合物16 s之后，采集熒光染料Fluo-3/AM標(biāo)記的鈣流變化數(shù)據(jù)直至120 s。

化合物的IC50值使用軟件GraphPad Prism 5進(jìn)行非線性曲線擬合計(jì)算得到。

3 結(jié)果與討論

目標(biāo)化合物經(jīng)核磁共振和質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。目標(biāo)化合物I-IV對(duì)mglu5具不同程度的mglu5拮抗活性，IC50值分別為0.079、0.23、0.19和11.5 μmol/L。陽性對(duì)照化合物MPEP的IC50值為0.015 μmol/L。結(jié)果如圖4所示：化合物I的活性最強(qiáng)，化合物II與III活性相當(dāng)，化合物IV活性最弱?；衔颕、II、III活性達(dá)到nM級(jí)。初步構(gòu)效關(guān)系為：（1）3,5二取代苯胺的活性強(qiáng)于2,4-二取代苯胺；（2）雙鹵素取代苯胺活性強(qiáng)于鹵素與三氟甲基取代的苯胺，如化合物I與II。出現(xiàn)上述活性差異的原因推測與取代基和mglu5結(jié)合口袋的空間相互作用有關(guān)。從活性結(jié)果看，水楊酰苯胺類化合物是潛在的mglu5拮抗劑。本研究利用骨架躍遷這一新藥設(shè)計(jì)思想，設(shè)計(jì)了四個(gè)水楊酰苯胺類mglu5拮抗劑，首次報(bào)道了四個(gè)化合物對(duì)mglu5的拮抗活性，為發(fā)現(xiàn)新型mglu5拮抗劑提供新的研究方向。

圖4 化合物I-IV對(duì)mglu5的拮抗活性

[1]Wijetunge LS,Till SM,Gillingwater TH,et al.mGluR5 regulates glutamate-dependent development of the mouse somatosensory cortex[J].J Neurosci,2008,28(49):13028-13037.

[2]Wu YL,WangNN,Gu L,etal.Thesuppressiveeffect of metabotropic glutamate receptor 5(mGlu5)inhibition on hepa tocarcinogenesis[J].Biochimie,2012,94(11):2366-2375.

[3]Varney MA,Cosford ND,Jachec C,et al.SIB-1757 and SIB-1893:selective,noncompetitive antagonists ofmetabotropic glutamate receptor type 5[J].J Pharmacol Exp Ther,1999,290(1): 170-181.

[4]Cosford ND,Tehrani L,Roppe J,et al.3-[(2-Methyl-1,3-thiazol-4-yl)ethynyl]-pyridine:a potentand highly selec tive metabotropic glutamate subtype 5 receptor antagonist with anxiolytic activity[J].J Med Chem,2003,46(2):204-206.

[5]Felts AS,Saleh SA,Le U,et al.Discovery and SAR of 6-substituted-4-anilinoquinazolinesasnon-competitiveantagonistsof mGlu5 [J].Bioorg Med Chem Lett,2009,19(23):6623-6626.

[6]石 榴,蔣亞琴,白艷秋.代謝型谷氨酸受體5亞型高通量篩選模型的建立[J].中國生物工程雜志,2010,30(5):81-86.

（本文編輯 蘇 維）

Design,Synthesis,and Activity Screening of New Potent Mglu5 Receptor Antagonists Based on the Salicylanilide Structure

FU Ronggeng1,YANG Chenzhizi2,YAN Jianye1,WENG Zhen1,ZHOU Xin1,LI Linhe1, XIONG Guanghua3,LIAO Duanfang1*
(1.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.School of Humanities, Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;3.Hunan Provincial Key Laboratory of Diagnostics of Traditional Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To design,synthesis and activity screening of salicylanilides as new mglu5 receptor antagonist. Methods A scaffold hopping approach has been exploited to design a novel class of mglu5 receptor antagonists I-IV. The design compounds were synthesized by using salicylic acids and anilines.The structures of target compounds were identified by NMR and MS.The activity of mglu 5 was screened by Ca2+mobilization assay.Results The designed salicylanilides show potent antagonistic activity to mglu5 receptor in vitro.Among them,compound I was the best,and IC50of compound I was 0.079 μmol/L.Conclusion The salicylanilides were new potent mglu5 receptor antagonist and worth to be further studied.

salicylanilide;mglu5 receptor antagonist;scaffold hopping

R284.3；R914.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.05.007

2016-09-23

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015JJ6085）；湖南省教育廳資助科研項(xiàng)目（13B080）；2015藥學(xué)湖南省重點(diǎn)學(xué)科開放基金項(xiàng)目；2015中醫(yī)藥國際合作專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（ZYGZ201502）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)本科教學(xué)質(zhì)量工程項(xiàng)目（ZY-005）。

傅榕賡，男，博士，講師，研究方向：藥物化學(xué)研究。

*廖端芳，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：dfliao@hnctcm.edu.cn。

本文引用：傅榕賡，楊辰枝子，嚴(yán)建業(yè)，翁 臻，周 鑫，李林和，熊廣華，廖端芳.水楊酰苯胺類mglu5拮抗劑的設(shè)計(jì)、合成及活性研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,37(5):489-492.