肖小芹,舒圓月,鄧桂明，*,葛金文，楊立平，陳 鎮(zhèn)，歐陽林旗,向 彪

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；3.湖南省腫瘤醫(yī)院，湖南 長沙 410013)

烏藥水提液對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠Ghrelin、MTL、SP、Sec水平的影響

肖小芹1,舒圓月1,鄧桂明1，2*,葛金文1，楊立平3，陳 鎮(zhèn)2，歐陽林旗2,向 彪2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；3.湖南省腫瘤醫(yī)院，湖南 長沙 410013)

目的 探討烏藥水提液對腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea－predominant irritable bowel syndrome,IBS－D)大鼠血清生長激素釋放肽（Ghrelin）、胃動素（Motilin,MTL）、P物質(zhì)（P substance,SP）、促胰液素（Secretin,Sec）水平的影響。方法 將60只大鼠隨機分成6組，采用單只孤養(yǎng)1周+番瀉葉煎劑灌胃2周+慢性束縛應(yīng)激1周造模法建立IBS－D大鼠模型，分別給予烏藥水提液低、中、高劑量，匹維溴銨灌胃干預(yù)。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組大鼠血清Ghrelin、MTL、SP、Sec含量。結(jié)果 與空白對照組比較，模型對照組SP、Ghrelin、MTL水平顯著升高，Sec水平降低（P＜0.01），提示造模成功；與模型對照組比較，烏藥水提液低、中、高劑量組以及陽性對照組血清SP、MTL水平均明顯降低,Sec水平均顯著升高（P＜0.01）,烏藥水提液低、中、高劑量組以及陽性對照組對Ghrelin影響無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論 烏藥水提液可能通過降低大鼠血清SP、MTL水平來改善IBS－D大鼠腹痛、腹瀉癥狀。

腹瀉型腸易激綜合征；烏藥；生長激素釋放肽；胃動素；P物質(zhì)；促胰液素

烏藥為樟科山胡椒植物烏藥Lindera aggregata (Sims)Kosterm的膨大塊根，為傳統(tǒng)常用的溫胃理氣止痛藥，具有溫中散寒、理氣止痛的功效。其主要化學(xué)成分是揮發(fā)油、異喹啉生物堿、倍半萜及其內(nèi)酯類以及黃酮類，最新提取化合物有：烏藥雙查耳酮、球松素、赤芝酮、肉桂酸、薊黃素等[1]。近年研究表明，烏藥具有胃腸道雙向調(diào)節(jié)作用，既可以促進胃腸蠕動，又能緩解胃腸道平滑肌痙攣，改善功能性胃腸病患者泛酸、噯氣、食欲不振、腹脹、腹痛、腹瀉便秘等臨床癥狀[2]，臨床上廣泛應(yīng)用于功能性胃腸病。腹瀉性腸易激綜合征 (diarrhea-predominant irritable bowel syndrome,IBS-D)是一種以反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉等為主要癥狀的功能性胃腸疾病。目前已知胃腸動力異常、內(nèi)臟高敏性、腦腸肽異常以及精神心理壓力等都與腸易激綜合征（irritable bowel syndrome,IBS）發(fā)病有關(guān)，其中胃腸動力異常和內(nèi)臟高敏性被認為是IBS主要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。腦腸肽是一種存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道系統(tǒng)的小分子多肽，在內(nèi)臟感覺和胃腸動力的調(diào)節(jié)方面起著重要的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，腦腸肽的分泌和表達的異?？蓪?dǎo)致內(nèi)臟高敏和胃腸動力紊亂，從而產(chǎn)生IBS-D腹痛、腹瀉等癥狀[3]。本文從生長激素釋放肽（Ghrelin）、胃動素（Motilin,MTL）、P物質(zhì)（P substance,SP）、促胰液素（secretin,Sec）四種腦腸肽入手，研究烏藥水提液對IBS-D大鼠血漿Ghrelin、MTL、SP、Sec水平變化的影響，從而探討烏藥治療功能性胃腸疾病的可能療效機制與物質(zhì)基礎(chǔ)，為烏藥的進一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，雌性，實驗動物合格證號NO.43004700022217。許可證號SCXK（湘）2011-0003，購買自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2 藥物及試劑

烏藥：批號20150824；番瀉葉：批號2015112712，湖南三湘中藥飲片有限公司；匹維溴銨片：批號639288，Abbott Products SAS公司，50 mg/片；SP、MTL、SEC、Ghrelin Elisa試劑盒（凱諾生物科技有限公司）等。

1.3 儀器

AUE-210分析天平（長沙湘儀設(shè)備有限公司）；低溫離心機（湘儀實驗設(shè)備有限公司）；CYTATION3多功能酶標儀（美國Biotek公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

選用SD雌性大鼠60只按體質(zhì)量標號后隨機分為6組，每組10只，一籠5只，分別為空白組對照，模型對照組，烏藥水提液低、中、高劑量組及陽性對照組。造模方法參考番瀉葉灌胃+束縛應(yīng)激進行改良后如下[4-6]：所有動物單只單籠飼養(yǎng) 1周，開始實驗，各組動物以番瀉葉水煎劑5 g/kg灌胃，每日1次，持續(xù)2周。從第2周起，用粗制棉繩束縛大鼠的雙前肢，影響其正常行動，但不完全限制自由，被束大鼠可以拖后肢緩慢爬行。束縛持續(xù)1周，每天 30 min，空白對照組不予任何處理。造模過程中觀察并記錄各組大鼠一般情況、大便含水量、腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）評分，以各造模組大鼠糞便含水量高于空白對照組,痛覺閾值低于正常組（P＜0.05）為造模成功的標準。

2.2 藥物干預(yù)

造模成功后，給藥劑量按照實驗動物研究“等效劑量”的計算方法，即按70 kg/200 g人鼠轉(zhuǎn)換系數(shù)r=0.018計算等效劑量。對烏藥低、中、高劑量組于每天進行束縛30 min后，分別給予烏藥水提液低劑量0.94 g/kg、中劑量1.88 g/kg、高劑量3.76 g/kg灌胃。陽性對照組給予匹維溴銨水溶液灌胃1.5 g/kg。空白對照組和模型組束縛30 min后給予等量生理鹽水灌胃，持續(xù)灌胃14 d，每天1次。

2.3 模型評價方法

造模完成后，參考Al-Chaer ED等[7]具體評分標準：0分,在進行擴張時大鼠無反應(yīng)；1分，大鼠頭部短暫靜止不動；2分，大鼠腹部收縮，但為抬離桌面；3分，大鼠腹部收縮抬離桌面；4分，大鼠身體呈弓形,骨盆抬高。用8F雙腔導(dǎo)尿管與裝有生理鹽水的注射器相連后從肛門插入約5 cm，用棉線將鼠尾根部和導(dǎo)尿管綁在一起,固定導(dǎo)尿管。待其穩(wěn)定后，緩慢推入生理鹽水使導(dǎo)尿管頂端球囊擴張腸道,當引起大鼠腹部抬起（AWR評分3分）時停止推水，記錄注射器推進水量，作為痛覺閾值評價大鼠內(nèi)臟敏感性。大便含水量測定方法：造模后，將各只大鼠放入代謝籠內(nèi)正常喂養(yǎng)，收集各只大鼠大便，稱取濕便質(zhì)量，然后放入干燥箱內(nèi)烘干20 min后再稱取干便質(zhì)量，濕便質(zhì)量與干便質(zhì)量之差除以濕質(zhì)量即為大便含水量[8]。

2.4 取材方法與指標測定

實驗結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，每只取5 mL；室溫放置2 h后，3 000 r/min離心15 min,取上清液，放冰箱-20℃保存待測，采用ELISA檢測血清SP、Sec、MTL、Ghrelin含量。

2.5 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料采用“±s”表示。符合正態(tài)性和方差齊性的資料，采用單因素方差分析；不符合正態(tài)性和方差齊性的資料，采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

實驗過程中觀察模型組及各給藥組模型大鼠體質(zhì)量增長緩慢、神態(tài)倦怠、皮毛散亂、少動、易激惹、大便粒數(shù)增多且不成形等癥狀。與空白對照組比較，其余各組大便含水量均高于空白組，具有顯著差異（P＜0.01）；與空白對照組比較，模型組以及各給藥組疼痛閾值降低（P＜0.01），提示造模成功。見表1。

表1 造模完成后各組大鼠大便含水量以及痛覺閾值對比 （±s，n=10）

表1 造模完成后各組大鼠大便含水量以及痛覺閾值對比 （±s，n=10）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01。

組別空白對照組模型對照組烏藥低劑量組烏藥中劑量組烏藥高劑量組陽性對照組F P大便含水量（g）1.97±0.71 7.99±1.28* 8.16±0.70* 8.53±0.82* 8.52±0.79* 8.26±1.09* 62.82 0.000痛覺閾值（mmHg）38.77±4.06 26.45±1.88* 24.55±2.77* 28.89±5.05* 25.76±3.54* 27.28±5.36* 34.59 0.000

各組大鼠血清 SP、Sec、Ghrelin、MTL水平的比較：（1）與空白對照組比較，模型對照組SP高于空白對照組（P＜0.05），Sec低于空白對照組（P＜0.01），Ghrelin、MTL均高于空白對照組（P＜0.01）,提示模型成功；（2）與模型對照組比較，烏藥水提液低、中、高劑量組及陽性對照組血清SP水平均降低，有顯著性差異(P＜0.01)，Sec水平均顯著升高（P＜0.01）；烏藥水提液低劑量組血清MTL降低(P＜0.05)，中、高劑量組以及陽性對照組MTL水平降低 （P＜0.01）；（3）烏藥水提液低、中、高劑量組以及陽性對照組Ghrelin差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與中劑量組SP水平無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；（4）烏藥低劑量組與烏藥中劑量組、高劑量組、陽性對照組血清Sec、MTL水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；烏藥中劑量組與與烏藥高劑量組血清SP水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），烏藥中劑量組與烏藥高劑量組、陽性對照組血清Sec、MTL水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與陽性對照組比較，血清Sec、MTL差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清SP、Sec、Ghrelin、MTL水平的影響 （±s，n=10，pg/mL）

表2 各組大鼠血清SP、Sec、Ghrelin、MTL水平的影響 （±s，n=10，pg/mL）

注：與空白對照組比較*P＜0.05,**P＜0.01；與模型對照組比較▲P＜0.01，▲▲P＜0.05；與烏藥低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與烏藥中劑量組比較，##P＜0.01。

組別空白對照組模型對照組烏藥低劑量組烏藥中劑量組烏藥高劑量組陽性對照組F P劑量(g/kg) --0.94 1.88 3.76 3×10-3SP 84.6±3.31 116±2.68* 94.9±4.73▲90.5±2.83▲84.6±2.20▲△##85.9±7.97▲50.58 0.000 Sec 190±4.88 149±6.76** 164±3.54▲173±3.11▲△△184±5.02▲△△##191±2.42▲79.40 0.000 Ghrelin 1422±9.18 1964±25.5** 1981±37.9 1556±105.1 1987±49.6 1965±38.3 87.63 0.000 MTL 336±5.99 392±33.4** 354±1.52▲▲345±2.39▲△△331±11.1▲△△##305±14.3▲19.34 0.000

4 討論

腦腸肽可作為胃腸道肽能神經(jīng)釋放的調(diào)解遞質(zhì)或者神經(jīng)遞質(zhì)作用于胃腸道，也可以直接作用于胃腸道感覺神經(jīng)末梢或平滑肌細胞的相應(yīng)受體而調(diào)解胃腸功能。目前已知SP與IBS-D的發(fā)病有著密切的聯(lián)系，李寧寧等[9]研究發(fā)現(xiàn)腸神經(jīng)系統(tǒng)中的P物質(zhì)對消化道平滑肌有強烈的刺激作用，可增加胃腸蠕動，刺激小腸和結(jié)腸分泌水和電解質(zhì)，增加血管滲透性；脊髓背角釋放的SP可激活血小板釋放5-HT，誘發(fā)IBS，其中SP3能將腸道感覺信息傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與內(nèi)臟疼痛敏感的發(fā)生[10]；Keszthelyi D等[11]研究發(fā)現(xiàn)在IBS患者腸黏膜中，SP含量增多，與IBS患者疼痛癥狀相關(guān)。本實驗結(jié)果提示烏藥水提液對于改善IBS-D患者腹瀉、腹痛等癥狀具有明顯作用。促胰液素可增強縮膽囊素的作用和胰酶的分泌,抑制胃酸分泌以及胃腸道運動功能，本實驗中烏藥水提液低、中、高劑量以及陽性對照組均可以升高IBS-D大鼠血清Sec水平，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜

0.01 ），提示烏藥水提液可以有效抑制IBS-D大鼠胃腸運動。胃動素通過調(diào)節(jié)消化間期胃腸道移行復(fù)合運動并促進小腸分節(jié)運動促進胃腸運動及加速胃排空，大量研究發(fā)現(xiàn)胃排空與血清MTL水平密切相關(guān)，黃鶴飛等[12]研究發(fā)現(xiàn)MTL能夠作用于消化道平滑肌細胞上的受體，使細胞內(nèi)Ca2+濃度增高激發(fā)消化道的機械運動和電活動，從而調(diào)節(jié)胃腸、膽囊、食管運動，促進胃腸運動和胃腸道對水、電解質(zhì)的運輸。本實驗結(jié)果得出，烏藥水提液低、中、高劑量組以及陽性對照組均可抑制IBS-D大鼠血清MTL水平，提示烏藥水提液對抑制IBS-D大鼠胃腸運動，延緩胃排空，緩解胃腸痙攣具有顯著意義。Ghrelin是生長激素促分泌激素受體(GHS-R)的內(nèi)源性配體,具有保護胃腸黏膜、促進胃腸蠕動及胃酸分泌、改善胃腸動力障礙的作用。王燕等[13]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin可劑量依賴性地促進大鼠小腸轉(zhuǎn)運,其受體拮抗劑抑制小腸轉(zhuǎn)運；靜脈給予Ghrelin促進胃腸消化間期移行性復(fù)合肌電活動,此作用可能通過膽堿能通路起作用,與NO通路關(guān)系密切；Oka T等[14]研究發(fā)現(xiàn)一些傳統(tǒng)中草藥可以通過促進Ghrelin的分泌，改變胃腸動力異常。本實驗中烏藥水提液低、中、高劑量組以及陽性對照組對IBS-D大鼠血清Ghrelin水平影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：烏藥水提液可以降低IBS-D大鼠模型血清SP、MTL水平，升高血清Sec水平，對血清Ghrelin水平影響差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。提示烏藥水提液可能通過降低大鼠血清SP、MTL水平，升高血清Sec水平，來抑制IBS-D大鼠胃腸運動，延緩胃排空，從而一定程度上改善IBS-D大鼠腹痛、腹瀉癥狀。

[1]海 萍,高 原,李蓉濤,等.烏藥的化學(xué)成分研究[J].中草藥雜志, 2016,47(6):872-875.

[2]聶子文,郭建生,陳 君，等.烏藥不同提取部位對小腸推進、胃排空的影響[J].中藥藥理與臨床,2011,27(2):93-95.

[3]史瑞瑞,王 晶.腦腸肽與腸易激綜合征相關(guān)性研究進展[J].世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化專題討論:臨床常見病的動物模型建立及藥物干預(yù)研究,2013,8(15):12-14.

[4]李延青,郭玉婷.腸易激綜合征的動物模型研究[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2004,13(4):435-439.

[5]劉美榮,肖瑞飛,彭芝配,等.針刺“足三里”“太沖”穴對腹瀉型腸易激綜合征大鼠胃腸激素的影響[J].針刺研究,2012,37(5):363-368.

[6]鄧桂球,張 蓓,張 喆，等.六味順激膠囊對肝郁脾虛型腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟敏感性及五羥色胺水平的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(8)：46-48.

[7]Al-Chaer ED,Kawasaki M,Pasricha PJ.A new model of chronic visceral hyper-sensitivity in adult rats induced by colon irritation during postnatal development[J].Gastroenterology,2000, 119(5):1276-1285.

[8]許惠娟,劉慧慧,滕 超，等.痛瀉要方對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠結(jié)腸水通道蛋白8表達影響的機制研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(6):141-144.

[9]李寧寧,方秀才.腦-腸軸在腸易激綜合征發(fā)病中的作用[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2013,22(2):163-166.

[10]王艷杰,關(guān)洪全,柴紀嚴，等,眼針對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠結(jié)腸P物質(zhì)表達的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(10):2268-2271.

[11]KeszthelyiD,TroostFJ,Jonkers DM,etal.Alterations in mucosal neuropeptides in patients with irritable bowel syndrome and ulcerative colitis in remission:A role inpain symptom generation[J].Eur J Pain,2013,17(9):1299-1306.

[12]黃鶴飛,陳 穎,朱曉新，等.中藥干預(yù)腸易激綜合征的腦腸肽調(diào)節(jié)研究進展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2016,22(11):208-217.

[13]王 燕,董 蕾,趙 平，等.Ghrelin對大鼠小腸轉(zhuǎn)運及消化間期移行性復(fù)合肌電活動的作用及機制[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2008,28 (3):328-332.

[14]Oka T,Okumi H,Nishida S,et al.Effects of Kampo on functional gastrointestinaldisorders[J].Biopsychosoc Med,2014,8(1):5.

（本文編輯 楊 瑛）

Effect of Water Extract of Lindera Aggregata on Ghrelin,MTL,SP and Sec Levels in Rats With Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome

XIAO Xiaoqin1,SHU Yuanyue1,DENG Guiming1,2*,GE Jinwen1,YANG Liping3,CHEN Zhen2，OUYANG Linqi2,XIANG Biao2
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China；3.Hunan Cancer Hospital,Changsha,Hunan 410013,China)

Objective To investigate the water extracts of Lindera aggregata on Ghrelin,MTL,SP and Sec levels in rats with diarrhea－predominant irritable bowel syndrome.Methods 60 rats were randomly divided into 6 groups.Using a single solitary 1 weeks,gavage of sennoside for 2 weeks and chronic restraint 1 weeks to establish the rat model of IBS－D.The model rats were administrated with low,medium,high dose of water extracts of Lindera aggregata,and pinaverium bromide.The levels of SP,MTL,Sec and Ghrelin in serum of rats were measured by using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results Compared with the blank control group,SP,Ghrelin and MTL levels significantly increased in the model control group,Sec was lower than the control group (P＜0.01).Compared with the model group,the plasma levels of SP,MTL in the low,medium,high dose water extracts groups and pinaverium bromide group decreased,the Sec levels significantly increased,with statistical significance (P＜0.01),while Ghrelin in the above four groups had no statistical significance (P＞0.05).Conclusion The water extracts of Lindera aggregata could improve the abdominal pain and diarrhea of IBS－D model rats byreducing the plasma levels of SP and MTL.

diarrhea-predominant irritable bowel syndrome;Lindera aggregata;growth hormone releasing peptide;motilin; substance-p;secretin

R285.5；R574.4

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.05.004

2016－11－02

湖南省教育廳重點項目（14A107）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（201429、2013135）；湖南省教育廳項目（15C1041）；中國博士后基金項目（2016T90752、2014M550420）。

肖小芹,男，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師,研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

*鄧桂明，女，博士(后)，副主任藥師，E－mail:guimingd1004@163.com。

本文引用：肖小芹,舒圓月,鄧桂明,葛金文，楊立平，陳 鎮(zhèn)，歐陽林旗,向 彪.烏藥水提液對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠Ghrelin、MTL、SP、Sec水平的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017,37(5):477－480.