張?jiān)丛? 郭涵 袁紅章 王祥軍 黃肖 李媛 李維國(guó)

摘 要 以通過流式細(xì)胞倍性檢測(cè)鑒定出的橡膠樹二倍體、三倍體、四倍體植株為研究對(duì)象，對(duì)不同倍性植株的氣孔性狀進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明：不同倍性間的橡膠樹葉片的氣孔長(zhǎng)度、氣孔寬度、氣孔密度均存在極顯著差異。隨著橡膠樹倍性的提高，氣孔的長(zhǎng)度和寬度均增大，而氣孔密度減小。二倍體、三倍體和四倍體的氣孔長(zhǎng)度范圍分別為10.65～15.29、14.04～18.89 、15.15～19.37 μm，氣孔寬度范圍分別為7.13～10.65、8.58～11.83、10.38～13.83 μm，氣孔密度范圍分別為520.62～867.69、402.53～764.80、381.79～555.32個(gè)/mm2。以氣孔長(zhǎng)度15.15 μm、氣孔寬度10.38 μm和氣孔密度555.32個(gè)/mm2為臨界值，可以鑒定二、四倍體混合群體中的四倍體。三倍體和二倍體、四倍體在氣孔長(zhǎng)度值、寬度值和密度值在分布區(qū)間上均存在較大的重復(fù)，但以氣孔長(zhǎng)度14.04 μm，氣孔寬度8.58 μm和氣孔密度764.80個(gè)/mm2為臨界值，可以篩除二、三、四倍體混合群體中的部分二倍體，提高多倍體鑒定的效率。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；多倍體；氣孔性狀；倍性鑒定

中圖分類號(hào) S722.3+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The differences of stomatal characters among diploid， triploid and tetraploid were investigated in rubber tree[Hevea brasiliensis Muell. Arg.]. Results showed that there were significant differences in the stomatal length， stomatal width and stomatal density among different ploidy. With the increase of ploidy， the length and width of stomata increased while the stomatal density decreased. The stomatal length ranges of diploids， triploids and tetraploids was 10.65-15.29 μm， 14.04-18.89 μm and 15.15-19.37 μm， respectively. The stomatal width ranges of diploids， triploids and tetraploids was 7.13-10.65 μm， 8.58-11.83 μm and 10.38-13.83 μm， respectively. The stomatal density of diploids， triploids and tetraploids was 520.62-867.69 個(gè)/mm2、402.53-764.80 個(gè)/mm2 and 381.79-555.32 個(gè)/mm2， respectively. The demarcation of stomatal length of 15.15 μm， stomatal width of 10.38 μm and stomatal density of 555.32 個(gè)/mm2 could be used to identify tetraploid from mixed population of diploid and tetraploid. The demarcation of stomatal length of 14.04 μm， stomatal width of 8.58 μm and stomatal density of 764.80 個(gè)/mm2 could be used to exclude diploid from mixed population of diploid， triploid and tetraploid partly.

Key words rubber tree； polyploid； stomatal character； ploidy identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.001

多倍體植物具有細(xì)胞體積大、個(gè)體高大、葉片寬厚、分枝數(shù)少、花果少、種子大、生長(zhǎng)速度快、代謝速率高、特殊代謝物質(zhì)產(chǎn)量高、抗逆性和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[1-4]，在以獲得生物產(chǎn)量為目標(biāo)的生產(chǎn)應(yīng)用中具有二倍體無可比擬的優(yōu)勢(shì)。橡膠樹育種的主要目標(biāo)是獲得特殊代謝物質(zhì)膠乳，通過多倍體育種途徑，可以在常規(guī)雜交育種的基礎(chǔ)上，選育出更高產(chǎn)高抗的橡膠樹新品種。在云南大面積推廣的云研77-2和77-4被證明為三倍體[5]，表明橡膠樹多倍體育種作為常規(guī)雜交育種的有效補(bǔ)充，具有重要的研究?jī)r(jià)值。

氣孔性狀作為多倍體鑒定的指標(biāo)之一，在楊樹[6]、蘋果[7]、梨[7]、葡萄[8-9]、月季[10]等多種植物上得到了研究和應(yīng)用。在橡膠樹中，目前已經(jīng)通過人工誘導(dǎo)[11-21]、自然選擇和分離[22-25]等途徑獲得了大量橡膠樹多倍體植株，其中通過形態(tài)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、流式細(xì)胞倍性檢測(cè)等方法篩選天然多倍體是最主要的途徑[26]。橡膠樹不同倍性的氣孔性狀的相關(guān)研究只有周鐘毓等[27]對(duì)比了人工誘導(dǎo)的四倍體與二倍體對(duì)照的差異，關(guān)于多倍性水平的氣孔性狀差異的研究至今未見報(bào)道。

本研究以通過流式細(xì)胞倍性檢測(cè)鑒定出的不同倍性的橡膠樹為研究對(duì)象，分析橡膠樹不同倍性的氣孔性狀差異，探討通過氣孔性狀快速鑒定橡膠樹倍性的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料中的二倍體和三倍體植株來源于橡膠樹GT1自然授粉子代，四倍體植株來源于人工誘導(dǎo)獲得的橡膠樹。因資料缺失，四倍體的原始二倍體和親本未知。所有植株的倍性均經(jīng)流式細(xì)胞倍性檢測(cè)確認(rèn)。

1.2 方法

1.2.1 倍性分析 流式細(xì)胞倍性檢測(cè)參考康向陽等[28]的方法，用流式細(xì)胞儀（CyFlow Ploidy Analyzer/Cy）進(jìn)行倍性分析。

1.2.2 氣孔長(zhǎng)度和寬度測(cè)量，氣孔密度的觀察與計(jì)算

對(duì)已檢測(cè)出的不同倍性植株，二倍體和三倍體分別隨機(jī)取10株，每株取1個(gè)成熟葉片，四倍體植株取10個(gè)成熟葉片。采用指甲油法[29]，在LeicaDMBL顯微鏡40×物鏡下進(jìn)行氣孔性狀觀察。每片氣孔裝片隨機(jī)選取3個(gè)視野使用LeicaDFC550顯微鏡照相機(jī)拍照。每個(gè)視野中隨機(jī)取3個(gè)氣孔，使用Image J圖像分析軟件測(cè)量氣孔長(zhǎng)度和寬度，不同倍性分別測(cè)量90個(gè)氣孔。通過一張照片氣孔數(shù)量和照片所拍攝區(qū)域的面積計(jì)算氣孔密度。測(cè)量氣孔密度的圖像所拍攝區(qū)域的面積為0.028 812 mm2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理在Microsoft Excel 2013中進(jìn)行，使用IBM SPSS Statistics22中文版進(jìn)行相關(guān)性分析、方差分析和多重比較，使用R語言繪制密度分布曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式細(xì)胞倍性檢測(cè)

流式細(xì)胞倍性檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，二倍體植株的DNA相對(duì)含量為200，三倍體植株的DNA相對(duì)含量為300，四倍體植株的DNA相對(duì)含量為400。流式細(xì)胞倍性檢測(cè)可以準(zhǔn)確鑒定出橡膠樹的倍性。

2.2 不同倍性橡膠樹葉片氣孔性狀差異

氣孔性狀觀察結(jié)果（圖2，表1）表明橡膠樹不同倍性間的氣孔長(zhǎng)度、氣孔寬度、氣孔密度均存在極顯著差異，二倍體、三倍體和四倍體的氣孔長(zhǎng)度范圍分別為10.65～15.29、14.04～18.89、15.15～19.37 μm，氣孔寬度范圍分別為7.13～10.65、8.58～11.83、10.38～13.83 μm，氣孔密度范圍分別為520.62～867.69、402.53～764.80、381.79～555.32 個(gè)/mm2。表明隨著橡膠樹倍性的提高，氣孔的長(zhǎng)度和寬度均增大，而氣孔密度減小。分別以每個(gè)視野內(nèi)測(cè)量的3個(gè)氣孔的長(zhǎng)度、寬度的平均值為結(jié)果，計(jì)算氣孔密度與氣孔長(zhǎng)度和寬度的相關(guān)性，結(jié)果表明氣孔密度與氣孔長(zhǎng)度和寬度存在極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.55和-0.507。

不同倍性橡膠樹的氣孔性狀的密度分布（圖3、4、5）表明，四倍體和二倍體在氣孔長(zhǎng)度值、寬度值和密度值區(qū)間上均有較大區(qū)別，以氣孔長(zhǎng)度15.15 μm、氣孔寬度10.38 μm和氣孔密度555.32 個(gè)/mm2為臨界值，可以快速準(zhǔn)確區(qū)分二、四倍體混合群體中的四倍體和二倍體。三倍體和二倍體、四倍體在氣孔長(zhǎng)度值、寬度值和密度值在分布區(qū)間上均存在較大的重復(fù)，但以氣孔長(zhǎng)度14.04 μm，氣孔寬度8.58 μm和氣孔密度764.80 個(gè)/mm2為臨界值，可以篩除二、三、四倍體混合群體中的部分二倍體，提高多倍體鑒定的效率。

3 討論

植物多倍體的氣孔密度較二倍體小，氣孔長(zhǎng)度和寬度較二倍體大，是植物多倍體的重要特征之一。周鐘毓等[27]觀察經(jīng)秋水仙堿處理和多次分離篩選與細(xì)胞學(xué)鑒定認(rèn)為穩(wěn)定典型的橡膠樹多倍體（四倍體）的氣孔，結(jié)果表明多倍體植株的氣孔密度比二倍體植株小10%左右，氣孔的長(zhǎng)度、寬度比二倍體植株大10%，與其二倍體對(duì)照均存在顯著或極顯著差異。本研究對(duì)比了橡膠樹二倍體、三倍體和四倍體的氣孔性狀差異，結(jié)果表明不同倍性間的氣孔密度、氣孔長(zhǎng)度、寬度均存在極顯著差異，隨著橡膠樹倍性的提高，氣孔的長(zhǎng)度和寬度均增大，而氣孔密度減小，與周鐘毓的研究結(jié)果相似。

植物產(chǎn)生多倍體的機(jī)制主要有體細(xì)胞染色體加倍和未減數(shù)配子（2n）發(fā)生兩種，體細(xì)胞染色體加倍產(chǎn)生四倍體，2n配子發(fā)生產(chǎn)生三倍體和少量四倍體。橡膠樹四倍體和二倍體的氣孔性狀差異較大，以氣孔長(zhǎng)度15.15 μm、氣孔寬度10.38 μm和氣孔密度555.32個(gè)/mm2為臨界值，可以快速鑒定人工誘導(dǎo)體細(xì)胞加倍得到的二、四倍體混合群體中的四倍體。橡膠樹三倍體和二倍體、四倍體在氣孔長(zhǎng)度值、寬度值和密度值在分布區(qū)間上均存在較大的重復(fù)，但以氣孔長(zhǎng)度14.04 μm，氣孔寬度8.58 μm和氣孔密度764.80個(gè)/mm2為臨界值，可以篩除2n配子發(fā)生途徑獲得的二、三、四倍體混合群體中部分二倍體，提高多倍體的篩選效率。

植物多倍體的判別和鑒定方法從原理上根據(jù)其內(nèi)在和外在的特征衍生而來[30]。在橡膠樹的多倍體鑒定中，形態(tài)鑒定法、細(xì)胞學(xué)鑒定法、流式細(xì)胞檢測(cè)等是最常用的多倍體鑒定方法。

形態(tài)鑒定法主要是根據(jù)多倍體在整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)的外部形態(tài)特征，初步鑒定是否為多倍體，在大規(guī)模的鑒定中可以進(jìn)行初步篩選，減少工作量。形態(tài)鑒定法在橡膠樹的多倍體（四倍體）鑒定中被大量應(yīng)用。橡膠樹四倍體的主要特征有：葉片較二倍體對(duì)照顯著增厚，葉脈增粗一半以上，葉色濃綠，葉片與主動(dòng)脈夾角變小[16]；古銅期葉普遍表現(xiàn)出葉形指數(shù)小，側(cè)脈條數(shù)少，葉脈檢定角小[17]；雌花和雄花比二倍體對(duì)照的大[31]。本研究中的三倍體和二倍體在形態(tài)特征上沒有觀察到明顯區(qū)別，因此形態(tài)鑒定法在鑒定三倍體中并不適用。

細(xì)胞學(xué)鑒定法主要是指染色體計(jì)數(shù)法。橡膠樹二倍體染色體條數(shù)為2n=36，三倍體為2n=54，四倍體2n=72。經(jīng)過初步的形態(tài)鑒定后，采用染色體計(jì)數(shù)確認(rèn)是常用的方法[5，14，31-37]。染色體計(jì)數(shù)法是倍性鑒定最直接、準(zhǔn)確的方法，但其制片技術(shù)要求高，對(duì)部分植物有一定難度[38]。隨著技術(shù)的進(jìn)步，染色體計(jì)數(shù)法逐漸被更加高效、便捷的流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法替代。

流式細(xì)胞儀的工作原理是用染色劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色后測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比，DNA含量柱形圖直接反映出不同倍性的細(xì)胞數(shù)，近年來在倍性分析中應(yīng)用越來越廣泛。張?jiān)丛碵25]首次通過流式細(xì)胞倍性檢測(cè)法從橡膠樹GT1自然授粉群體中檢測(cè)出三倍體植株，并經(jīng)染色體計(jì)數(shù)確認(rèn)。

橡膠樹多倍體較二倍體還有其它性狀的差異。如黃有軍等[36]觀察到海墾2、PR107、RRIM600三個(gè)品系多倍體植株葉片主要形態(tài)特征為葉形指數(shù)、一級(jí)側(cè)脈數(shù)和主脈導(dǎo)管列數(shù)比二倍體的小，柵欄組織、海綿組織和葉片厚度比二倍體的大。多倍體樹皮較二倍體對(duì)照多列射線密度低，射線細(xì)胞口徑較大，“網(wǎng)眼”比二倍體的寬、性狀多樣、不規(guī)則、排列較亂，圍繞多列射線的乳管或軸向薄壁細(xì)胞排列變得混亂。陸永林等[31]測(cè)定多倍體花粉粒直徑有41.0%超過50 μm，甚至有超過55 μm。賴杭桂等[20]認(rèn)為直徑在30～50 μm的為正?；ǚ?，50 μm以上的為加倍花粉粒。以上性狀差異因?yàn)闇?zhǔn)確性不高（葉形指數(shù)、一級(jí)側(cè)脈數(shù)等）或難以直接觀察（導(dǎo)管列數(shù)，花粉直徑）等原因未被應(yīng)用。

本研究根據(jù)不同倍性橡膠樹氣孔性狀差異，提出以氣孔長(zhǎng)度、氣孔寬度和氣孔密度作為橡膠樹多倍性混合群體中的多倍體的鑒別或提高篩選效率的指標(biāo)，總結(jié)和討論了橡膠樹多倍體鑒定的方法及其應(yīng)用，在橡膠樹多倍體育種研究中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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