汪 楠，郝風節(jié)，王俊青

（上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院普外科，上海 200025）

多倍體是指細胞中存在2 套以上的染色體組。在自然界中，多倍體現(xiàn)象廣泛存在，常見于植物類、魚類、兩棲動物類，但在哺乳動物中少見。正常生理狀態(tài)下，人體多倍體細胞一般僅見于心臟、骨髓、肝臟等特定組織和器官。其中，已證實肝細胞多倍體與肝臟再生、穩(wěn)態(tài)、終末分化、衰老等相關，但關于其具體功能和作用機制目前尚未明確。

原發(fā)性肝癌是世界范圍內常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。根據(jù)2018 年公布的全球腫瘤流行病學統(tǒng)計數(shù)據(jù)，全球肝癌的年新發(fā)病人數(shù)達84.1 萬人，居惡性腫瘤第6 位，年患病死亡數(shù)達78.2 萬人，居惡性腫瘤第2 位。原發(fā)性肝癌在我國高發(fā)，我國肝細胞癌（肝癌）年新發(fā)病例占全球的55.4%，年死亡人數(shù)占全球的53.9%,位居常見惡性腫瘤的第4 位和腫瘤致死病因的第2 位[1-2]。肝臟是人體最大的消化器官和多倍體器官。近年來，越來越多的研究提示多倍體細胞可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，包括多種人類腫瘤的癌前病變和惡性轉化。因此，研究多倍體肝細胞與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關機制，對肝癌的預防、早期診斷和治療具有重要的研究和臨床轉化意義。本文就多倍體肝細胞的形成機制、功能及病理生理學意義進行闡述，深入探討多倍體肝細胞在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的研究進展。

多倍體肝細胞的形成機制

人體細胞除生殖細胞外，細胞內染色體組通常以二倍體形式存在并發(fā)揮生物學功能。在不同生理或病理條件下，二倍體生物可通過多種途徑和機制在特定組織或器官中形成多倍體細胞。二倍體生物形成多倍體細胞的途徑大致包括細胞融合、細胞核內復制和細胞質分裂失敗3 種形式[3-4]。

一、細胞融合

細胞融合是指2 個單核二倍體肝細胞（2n）融合在一起而產(chǎn)生一個雙核四倍體肝細胞（2×2n）。就人類肝細胞而言，當肝細胞形成細胞融合時，雙核四倍體肝細胞保留了正常進入分裂周期的能力，可產(chǎn)生2 個單核四倍體肝細胞（4n）。在此基礎上，單核四倍體肝細胞進一步多倍體化，則可形成雙核四倍體（2×4n）或單核八倍體肝細胞（8n）[5]。研究表明，在肝臟嵌合體小鼠模型中可觀察到肝細胞間細胞融合現(xiàn)象。然而，由于細胞外囊泡可能形成偽影干擾細胞倍性的觀察，對于肝臟中肝細胞融合的存在目前仍有爭議[6]，尚有待進一步深入探討。

二、細胞核內復制

細胞核內復制是指細胞在不發(fā)生有絲分裂的前提下，細胞內發(fā)生多次DNA 合成，從而產(chǎn)生細胞多倍體化的細胞學現(xiàn)象。在生理條件下，哺乳動物的細胞周期可分為G1期、S 期、G2期和M 期4 個連續(xù)階段，該過程受細胞周期蛋白依賴性激酶等嚴密調控。多項研究表明，采用敲除特定細胞周期調節(jié)基因，能夠在相應的細胞周期進程中影響肝細胞多倍體化，進而建立富含不同細胞倍性的肝細胞小鼠模型，如敲除p53[7]、p21[8]、Rb[8-9]，可分別誘導不同細 胞周期階段的細胞形成多倍體肝細胞。持續(xù)的DNA 損傷可觸發(fā)肝細胞核內復制，可促使多倍體肝細胞的生成[10-11]。研究顯示，體外培養(yǎng)的肝細胞經(jīng)一定時間的紫外光照射后，在細胞周期S 期和G2期中，表現(xiàn)出共濟失調毛細血管擴張突變基因Rad3 相關激酶高度磷酸化和氧化應激反應，同時經(jīng)ATR/p53/pRb 通路，促進細胞周期抑制因子p53 和pRb 蛋白高表達，進而抑制細胞周期，產(chǎn)生多倍體肝細胞[10-11]。

三、細胞質分裂失敗

細胞質分裂是細胞分裂的最后環(huán)節(jié)，包括細胞分裂后期紡錘體重組、分裂溝的形成、中心體結構的脫落等環(huán)節(jié)。細胞質分裂失敗會產(chǎn)生雙核多倍體細胞，同樣細胞質分裂失敗后，如出現(xiàn)細胞核重新融合，也可能導致單核多倍體細胞形成。

1.PI3K/AKT 信號轉導途徑：就哺乳動物肝細胞而言，細胞多倍化起始于斷奶期間[12]，與高脂飲食及高水平胰島素、AKT 信號增強密切相關[5,12]。胰島素經(jīng)PI3K 信號通路進行調節(jié)，PI3K/AKT 信號通路是胰島素作用的主要下游通路。研究顯示，PI3K/AKT 信號通路在細胞遷移中發(fā)揮促使肌動蛋白細胞骨架極化和重組的作用，該通路各環(huán)節(jié)發(fā)生的變化均可能導致肝細胞質完全分裂失敗，進而形成多倍體細胞。

2.E2F 家族：E2F 家族是細胞周期進程的主要調節(jié)因子[13]。研究表明，該家族的E2F7 和E2F8 基因雙敲除的小鼠模型肝臟中富含二倍體肝細胞（基因敲除小鼠模型的肝細胞中二倍體肝細胞占60%～70%，而對照組肝細胞中則占3%～4%）[15-16]。在肝細胞多倍體化過程中，可觀察到E2F7 和E2F8 的表達水平顯著升高，表明其參與了細胞多倍體化的調節(jié)。E2F1 基因具有抑制細胞多倍體化的作用，E2F1 基因缺失，可導致細胞G2期和M 期轉錄效率下調，促進多倍體細胞形成[14]。

3.微小RNA（microRNA，miRNA）：Hsu 等[15]發(fā)現(xiàn)，miRNA與雙核多倍體肝細胞的形成間關系密切。在miR-122 基因敲除的小鼠模型中觀察到，肝細胞多倍體總量減少60%～70%。在此基礎上進一步研究顯示，miR-122 下調在誘導減少肝細胞多倍體化的同時，具有促進肝細胞癌發(fā)生的作用，提示miR-122 可能作為肝癌治療的潛在靶點，而與其相關的肝細胞多倍體化改變可能與肝癌發(fā)生、發(fā)展密切相關[16]。

多倍體肝細胞生理功能和意義的假說

正常生理狀態(tài)下，肝臟細胞多倍體化僅是肝臟生理發(fā)育的表現(xiàn)形式，還是具有一定的生物學意義,結合目前的理論，已有幾項假說支持肝臟細胞多倍體化具有特定的生物學意義。

一、肝細胞多倍體化與肝臟細胞的終末分化及衰老有關

最早的研究認為，在嚙齒類動物和人類中，肝細胞多倍體化與肝細胞終末分化及衰老有關。既往研究提示，肝細胞多倍體化伴隨著肝細胞的終末分化、增殖能力和細胞分裂功能的下降[20]。然而最近研究表明，多倍體肝細胞雖然可能與細胞衰老進程的加速相關，但多倍體肝細胞仍保留了分裂和增殖的能力，因此認為肝細胞多倍體不屬于細胞分化的終末形式。Pandit 等[17]提出，E2F8 基因敲除的小鼠其肝臟主要由二倍體肝細胞組成，其肝臟的再生能力與具有大量多倍體細胞的野生型小鼠肝臟間沒有差異，有力地支持了上述觀點。同樣，Knouse 等[18]、Miyaoka 等[19]、Miettinen 等[20]發(fā)現(xiàn)，在部分肝切除術后，多倍體肝細胞的分裂程度與二倍體亦相同；Duncan 等[21]把成年小鼠的二倍體和八倍體肝細胞移植到延胡索二酰乙酰乙酸水解酶缺陷的小鼠肝臟內，結果發(fā)現(xiàn)，二倍體和八倍體肝細胞具有同等的再增殖潛力，說明多倍體肝細胞均具有相當高的增殖能力。

二、多倍體肝細胞具有增強和穩(wěn)定肝細胞功能的作用

多倍體肝細胞具有多套染色體組。新近觀點認為，多倍體細胞相應的基因在轉錄過程中能夠成倍增加，籍此導致特定代謝功能的增強[21-22]。Lu 等[23]早在2007 年就使用微陣列分析觀察了來自野生型小鼠的不同核倍體數(shù)肝細胞的基因表達譜，僅發(fā)現(xiàn)了在不同人群之間的基因表達譜中存在一些差異。Kreutz 等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，二倍體肝細胞與單核多倍體肝細胞的基因表達譜不同，而與雙核多倍體肝細胞的基因表達譜相近。上述發(fā)現(xiàn)提示，肝細胞核倍體數(shù)的增加可能提高肝細胞的生物功能。Miettinen 等[20]應用周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1,CDK1）基因敲除的小鼠建立了單核多倍體肝細胞模型，研究較高的細胞核倍體數(shù)與肝細胞代謝之間的關系，結果表明，較高的肝細胞核倍體數(shù)會誘導線粒體相關基因和脂質從頭合成途徑相關基因表達水平下降，同時誘導細胞骨架、糖酵解基因表達水平升高，說明多倍體肝細胞具有促進肝臟代謝功能的作用。

肝臟具有較高的能量需求，細胞多倍體化后功能的增強可能有助于其快速適應環(huán)境改變帶來的生物學壓力。Bahar等[25]采用基于單分子熒光原位雜交技術方法，定量分析了肝細胞內特定啟動子的活化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)基因轉錄過程中轉錄效率、轉錄頻率等存在不穩(wěn)定性，啟動子在活化和關閉狀態(tài)之間隨機切換，并誘導細胞基因表達圍繞一定的值上下波動，即形成“轉錄噪聲”。值得一提的是，多倍體肝細胞的轉錄噪聲很小，表明肝臟多倍體化參與了轉錄噪聲產(chǎn)生的嚴格調控和有效緩沖，使基因表達趨向穩(wěn)定，并在此基礎上保持肝細胞發(fā)揮穩(wěn)定的生理功能[22,26]。

三、多倍體肝細胞促進肝組織修復及抵抗基因毒性損傷

肝臟是人體中最為重要的再生器官，同樣也是為數(shù)不多的多倍體細胞占總體細胞一半以上的器官。研究表明，對小鼠肝臟施行部分切除后，其殘余肝組織中的多倍體肝細胞發(fā)生明顯增殖，并參與了肝組織的再生。Zhang 等[27-28]建立了E2F7 和E2F8 雙敲除二倍體肝臟小鼠模型，并對其進行部分肝切除，結果發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠肝臟（多倍體肝細胞）部分肝臟切除后的肝組織再生能力比較，多倍體肝細胞在修復受損肝組織方面能力明顯高于二倍體肝細胞。同樣，使用四氯化碳毒素處理野生型小鼠與E2F7、E2F8 雙敲除小鼠，獲得小鼠肝損傷模型，對比2 種小鼠處理后的肝臟體積和重量，也得到了類似結果。上述發(fā)現(xiàn)說明，肝細胞的多倍體化對肝臟再生影響顯著。

肝細胞多倍體與肝癌的關系

一、環(huán)境特異性背景下多倍體細胞與人類腫瘤

基因組學已證實，約有30%的人類實體腫瘤，如結腸直腸癌、胰腺癌、肺癌等中存在大量多倍體細胞[29]。在臨床病理診斷中，多倍體腫瘤細胞與腫瘤侵襲性強、惡性程度高、預后較差相關?；诖?，多數(shù)學者認為，細胞多倍體化參與了從癌前病變到惡性腫瘤轉變的動態(tài)過程，基因組倍性的增加極有可能是腫瘤發(fā)生的重要驅動因素[26]。Ganem 等[30]發(fā)現(xiàn)，將TP53 基因敲除的四倍體乳腺上皮細胞移植至免疫缺陷的裸鼠中會引起惡性腫瘤，而移植TP53 基因敲除的二倍體乳腺上皮細胞不會引起惡性腫瘤，這一發(fā)現(xiàn)提示四倍體會引起腫瘤發(fā)生。由于正常成年人的肝臟在生理狀態(tài)下富含大量多倍體細胞，故多倍體在肝臟腫瘤發(fā)生中的作用目前尚無法解釋。對于多倍體細胞在肝臟中是促進腫瘤產(chǎn)生的因素還是抑制腫瘤惡性轉化的保護因素，不少學者展開了討論。

二、多倍體肝細胞對肝細胞肝癌發(fā)生、發(fā)展的潛在抑制作用

1.抑癌作用機制研究：根據(jù)前述提出的觀點，細胞多倍體化一般是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素。然而，研究表明，正常成年人的肝臟生理狀態(tài)下有50%為多倍體細胞。關于多倍體肝細胞是否與肝癌發(fā)生、發(fā)展相關，是否也具有促進肝癌發(fā)生的作用的問題，這值得探討。與大多數(shù)人類實體腫瘤相關研究不同，現(xiàn)有研究結果顯示，多倍體肝細胞具有拮抗肝癌發(fā)生、發(fā)展的作用。理論上，二倍體組織內的細胞通過經(jīng)典的雜合性丟失機制可導致惡性腫瘤的發(fā)生，即在2 個成對的抑癌基因中，1 個或2 個等位基因出現(xiàn)不同的基因組變化，可導致其失去抑制細胞轉化為癌細胞的功能。相反，多倍體肝細胞最多可以包含16 個等位抑癌基因，因而對抑癌基因的丟失或者突變具有緩沖作用?，F(xiàn)階段，有關肝細胞多倍體抑制肝癌發(fā)生的假說中，以下研究結論最被廣泛接受。這些研究提出，細胞多倍體化可以增加單細胞基因數(shù)目，保護細胞免受遺傳毒性機制的損害[28,31,34]。該研究者分別通過控制小鼠斷奶時間和Anln 基因、E2F8 基因的水平，建立了Anln 基因敲除小鼠模型 （肝細胞大多數(shù)為多倍體）和E2F8 基因敲除小鼠模型（肝細胞大多數(shù)為二倍體），隨后用二乙基亞硝胺建立了肝癌誘導模型。結果表明，多倍體細胞占優(yōu)勢的肝細胞組成狀態(tài)在多種肝癌模型中均顯示出腫瘤抑制功能。進一步研究顯示，多倍體肝細胞抑癌作用與緩沖抑癌基因突變或缺失有關，而并非抑制肝細胞在致癌性因素作用后的異常細胞增殖[27,30]。

作為上述假說的理論支持，Knouse 等[18]對E2F8 基因敲除小鼠和野生型小鼠分別進行了部分肝切除手術，結果發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，以二倍體為主的E2F7、E2F8 雙敲除小鼠術后的肝臟質量恢復率更高。另外，Wilkinson 等[32]從小鼠肝臟中直接提取肝細胞進行原代細胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中以二倍體為主的E2F7、E2F8 雙敲除肝細胞的增殖率明顯高于野生型多倍體肝細胞。上述結果提示，二倍體肝細胞增殖能力大于多倍體肝細胞，而多倍體肝細胞可能因其抑癌基因獲得多次復制機會，具備明顯的抑制肝癌作用。

2.與預后的相關性：多倍體肝細胞的不同細胞核狀態(tài)也與肝癌患者的預后相關。2019 年，Bou-Nader 等[33]利用腫瘤細胞原位成像的方法，分析了肝癌患者與健康對照者肝組織的細胞倍性譜，結果顯示，在人體肝癌發(fā)生過程中，雙核多倍體百分比及細胞倍性大大降低 （正常組織中約為15%，而腫瘤組織中約為5%）。相反，單核多倍體百分比及細胞倍性在肝癌中上升（正常組織中約為12%，而腫瘤組織中約為33%）。因此，單核多倍體肝細胞可能與低分化、增殖率高、預后不良的肝癌有關。

值得關注的是，在哺乳動物出生后的發(fā)育過程中，絕大部分肝細胞通過細胞質分裂失敗的形式生成雙核多倍體細胞。Bou-Nader 等[33]發(fā)現(xiàn)，雙核多倍體肝細胞在人類肝癌中幾乎不存在，強烈提示惡性肝細胞分裂時不存在細胞質缺陷，為之后的研究提供了方向。除此之外，Bou-Nader 等[32]的研究結果也支持了Zhang 等[28,34]和Lin 等[31]的假說。

雖然多倍體肝細胞與肝癌的關系仍未完全闡明，但多倍體肝細胞對肝癌發(fā)揮抑制作用觀點已逐步被研究者所接受，細胞質分裂機制與癌細胞增殖之間的分子聯(lián)系是當前研究的熱點。Anln、E2F 等基因涉及細胞有絲分裂多個環(huán)節(jié)，將是進一步深入探討的重要領域。前述的miRNA-122 也為研究者從非編碼RNA 著手研究肝細胞多倍體與腫瘤的關系，提供了另一種研究思路[15-16]。

結論和展望

多倍體形成是一種特殊的細胞功能機制，其產(chǎn)生原理和生物學意義尚待深入闡述。多倍體細胞在人體生理發(fā)育過程中必不可少，肝臟作為人體最大的多倍體器官，肝細胞多倍體化貫穿于肝臟發(fā)育、生長、再生及衰老的全過程中。明確肝臟多倍體與肝癌間的關系，以及肝癌究竟是來自于多倍體還是二倍體肝細胞，將為之后的臨床肝癌預防、診斷、治療提供重要理論支持。全面揭示多倍體肝細胞抑制肝癌發(fā)生、發(fā)展的具體機制，將推動肝癌精準治療的開展。此外，尚可進一步探討以下相關問題，如肝細胞倍性能達到的極限；多倍體肝細胞如何實現(xiàn)細胞增殖；多倍體肝細胞如何解決有絲分裂期間形成的多極紡錘體[18,20]等。