農(nóng)倩 張雯龍 藍桃菊 蘇琴 陳艷露 張艷 覃麗萍 謝玲

摘 要 通過平皿和盆栽共生對抗法，篩選到1株對香蕉枯萎病具有防治作用的深色有隔內(nèi)生真菌L-14，2種方法的防效分別達到72.4%和56.5%，接種該菌株可顯著提高香蕉幼苗的鮮重。形態(tài)觀察和28S rDNA序列比對分析結(jié)果表明，該菌株為裂殼菌（Schizothecium sp.）。使用該菌株浸根處理接種香蕉苗后，植株系列抗氧化保護酶如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）及超氧化物歧化酶（SOD）的活性均顯著高于對照，而菌株L-14與香蕉枯萎病菌混合接種處理樣品的PPO和SOD活性顯著高于單獨接種處理，表明接種該生防菌能增強香蕉的抗氧化防護系統(tǒng)，提高其對香蕉枯萎病的抗性。

關(guān)鍵詞 裂殼菌；深色有隔內(nèi)生真菌；香蕉枯萎病；生物防治

中圖分類號 S436.681 文獻標識碼 A

Abstract A dark septate endophytic（DSE）fungus L-14 was screened for further activity among the ten DSEs. The disease control efficacies of L-14 against the Fusarium wilt was found up to 72.4% in the culture dish and 56.5% in the pot culture method. After inoculation of this strain into the banana seedling， the fresh weight of banana seedlings significantly increased over the control plant. Morphological observation and 28S rDNA sequence alignment analysis showed that the strain belonged to the genus Schizothecium. After inoculation of L-14 with banana seedlings， the antioxidant enzymes such as phenylalanine ammonia lyase（PAL）， peroxidase（POD）， polyphenol oxidase（PPO）and superoxide dismutase（SOD）were significantly higher over the control. The activity of PPO and SOD was found to be higher in case of mix inoculation of L-14 strain and banana Fusarium wilt disease pathogen. The results suggested that DSE strain L-14 could improve the resistance to banana Fusarium wilt disease of the seedling by triggering the over expression of antioxidative defense system.

Key words Schizothecium sp.； dark septate endophytes； banana Fusarium wilt disease； biological control

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.027

香蕉枯萎病又稱香蕉巴拿馬病、黃葉病、凋萎病，是制約香蕉生產(chǎn)的一種毀滅性土傳病害。該病由鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense）侵染引起[1-2]，近年來對華南蕉區(qū)的為害日趨擴大。至今尚無有效防治香蕉枯萎病的藥劑，抗病香蕉品種又無法達到產(chǎn)量的要求[3-4]。生物防治作為防治香蕉枯萎病的措施之一，具有良好的發(fā)展和應(yīng)用前景，國內(nèi)外學者對此開展了不少研究，已報道的具有應(yīng)用前景的防治微生物包括真菌、細菌和放線菌等?？路落摰萚5]研究發(fā)現(xiàn)通過連續(xù)施用木霉菌株gz-2菌劑對香蕉枯萎病的防治效率可達74.4%；石妞妞等[3]于接種香蕉枯萎病菌前4 d和前2 d，施用枯草芽孢桿菌T122F，對香蕉枯萎病防效可達66%。茹祥等[6]分離到2株對香蕉枯萎病有較好防治效果的放線菌DL-24和DL-28，盆栽平均防效分別達76.5%和83.6%，田間防效為67.5%和47.5%。盡管香蕉枯萎病防治微生物資源的收集篩選研究已經(jīng)廣泛開展，但因田間環(huán)境因素復雜，適用于大規(guī)模田間應(yīng)用的微生物資源依然很少。

深色有隔內(nèi)生真菌（Dark Septate Endophyte， DSE）是一類能與寄主植物互惠共生的微生物，其定殖宿主具有非專一性，且在逆境環(huán)境中，DSE也分布廣泛[7-8]。DSE能夠定殖于宿主體內(nèi)形成互惠共生體，相比其它完全暴露在根際土壤中的生防微生物，受到環(huán)境的影響相對較小，可能在田間應(yīng)用中更容易獲得穩(wěn)定良好的防治效果。本研究通過平皿和盆栽共生對抗法，對香蕉枯萎病生防DSE菌株進行篩選，由形態(tài)觀察和28S rDNA序列分析，對生防菌株進行鑒定。通過測定香蕉植株系列抗氧化保護酶如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化，探索生防菌防治香蕉枯萎病的機理，為進一步開發(fā)利用生防菌株提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉組培苗：桂蕉6號（廣西植物組培苗有限公司提供）；DSE菌株：由本實驗室從甘蔗根圍分離保存，共10株（編號分別為L-1、C29-7-2、L-14、B-1、G-X、C23-5-1、G、N3、EWM和M-1）；香蕉枯萎病病原菌：鐮刀菌4號生理小種（FOC4）。

1.2 方法

1.2.1 平皿抗性篩選 DSE菌株活化后接種于燕麥培養(yǎng)基上（燕麥粉10 g/L，瓊脂18 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L1，KH2PO4 1.5 g/L，NaNO3 1 g/L），每皿接3個菌塊，培養(yǎng)10 d后，選擇長勢一致香蕉組培苗移栽至菌落上，根系平鋪于菌落表面，每個菌落移栽1株。移栽后的培養(yǎng)皿放至組培瓶，在25 ℃，光強180 μmol/（m2·s）、光周期16 h ∶ 8 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d后，鏡檢香蕉根部組織，且進行DSE菌株再分離。以不接種菌株處理為對照，每處理3個重復，每重復7皿。

將鐮刀菌活化后接于水瓊脂培養(yǎng)基上，每皿接種3個菌塊，28 ℃培養(yǎng)4 d待用。將上述DSE-香蕉苗共生體連同培養(yǎng)基移至長有鐮刀菌的培養(yǎng)基，于28 ℃，光強180 μmol/（m2·s），濕度80%條件下培養(yǎng)15 d。對照直接接入帶有鐮刀菌的水瓊脂平板上。觀察記錄病級、計算病情指數(shù)和防治效果。病情分級標準：0級為外觀無可見癥狀；1級為植株長勢無明顯受阻，全株黃萎面積≤35%；2級為植株弱小，35%<全株黃萎面積≤80%；3級為全株黃萎面積>80%。

防效計算公式為：病情指數(shù)=∑（病株級數(shù)×代表數(shù)值）/（株數(shù)總和×最高病級代表值）；防治效果=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

1.2.2 盆栽試驗 取3～4葉期長勢一致的香蕉幼苗種于營養(yǎng)杯中（直徑×高：19 cm×20 cm），杯中放置滅菌土壤。將活化后的DSE菌塊接入PDB培養(yǎng)基中，25 ℃，120 r/min震蕩培養(yǎng)14 d，用滅菌紗布過濾收集菌絲，滅菌水洗滌菌絲數(shù)次后，將菌絲打碎配制成5×105 cfu/mL的菌液。每株香蕉苗灌根50 mL DSE菌液，每隔15 d灌1次，共灌3次。于最后一次灌根后10 d，隨機選取各處理及重復的6株香蕉苗，測量其株高和鮮重，檢驗其促生效果，其余植株留作抗病試驗。鐮刀菌活化后，配制成濃度為1×106 cfu/mL的孢子液。于最后一次灌根結(jié)束10 d后，對香蕉苗進行傷根并接種鐮刀菌孢子液，隨時觀察植株發(fā)病情況。于接種后25 d解剖香蕉球莖，觀察記錄發(fā)病情況并計算防效。每處理3個重復，每重復8株苗，以清水灌根并接種鐮刀菌孢子液的處理為對照。病情分級標準：0級為球莖健康無變色；1級為球莖變色面積占球莖面積<20%；2級為20%≤球莖變色面積占球莖面積<40%；3級為40%≤球莖變色面積占球莖面積的<60%；4級為60%≤球莖變色面積占球莖面積<80%；5級為球莖變色面積占球莖面積≥80%。防效和防治效果計算公式同1.2.1。

1.2.3 菌株的分類鑒定 形態(tài)觀察：將待檢菌株接種至PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3周后觀察菌落形態(tài)特征。用插片法將純化的菌株接于燕麥培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)2～4周，于明顯看到菌絲著生在蓋玻片上時，取出玻片，光學顯微鏡下進行觀察。

分子鑒定：將菌株接種于PDB培養(yǎng)基中，于28 ℃、120 r/min震蕩培養(yǎng)14 d后，過濾收集菌絲。菌絲體總DNA采用CTAB法[9]提取，28S rDNA擴增引物為LROR：5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′和LR5：5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′。擴增體系25 μL，其中含：MasterMix（TIANgel）9 μL，20 μmol/L正反引物各1 μL，DNA 1 μL，ddH2O用14 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物測序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。通過NCBI Blastn對獲得序列進行比對分析，使用MEGA6.0程序進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.2.4 抗氧化酶活性的測定 取長勢一致的3葉期香蕉組培苗，無菌水徹底洗凈根部，每瓶10株并加入不同的菌液進行浸根處理：菌株L-14菌液20 mL（L-14）；FOC4孢子懸浮液20 mL（FOC4）；菌株L-14菌液20 mL，浸根12 h后加入Foc4孢子懸浮液2 mL（L-14+ FOC4）；無菌水20 mL（CK）。L-14菌液及Foc4孢子懸浮液濃度分別為：5×105 cfu/mL和1×106 cfu/mL。分別于浸根后的第1、3、5、7、9天，剪取香蕉頂端葉片，參照薛玉瀟等[10]的方法制備酶液?？寡趸富钚詼y定參照楊述省[11]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株平皿抗病性鑒定

對接種后的香蕉植株根部進行顯微檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有DSE菌絲（圖1-A），通過根部內(nèi)生真菌再分離培養(yǎng)及形態(tài)學觀察確定為原接種的DSE菌株，從而明確DSE-香蕉苗共生體已建立。平皿共生對抗法結(jié)果顯示，10株DSE菌株對香蕉枯萎病表現(xiàn)出強弱不等的抑菌能力。其中L-1平皿防治效果最高，達83.5%，C29-7-2和L-14的防效分別為75.6%和72.4%，但兩者間防效差異不顯著（圖1-B），選取防效前5位的菌株繼續(xù)進行盆栽抗病試驗。

2.2 菌株盆栽抗病性鑒定

選取平皿防效前5位的L-1、C29-7-2、L-14、B-1及G-X進行盆栽抗病性鑒定。結(jié)果表明，L-14菌株防效高達56.5%，顯著高于其他菌株處理，B-1處理防效僅為7.2%（表1）。香蕉株高和總鮮重的測量結(jié)果顯示，各處理的香蕉株高和鮮重均高于對照，尤以菌株L-14促生作用最明顯，2次測定數(shù)值均顯著高于對照（表1），因此，取該菌株作進一步的鑒定。

2.3 L-14的形態(tài)學鑒定

L-14在PDA培養(yǎng)基上長速較快，28 ℃培養(yǎng)14 d后菌落直徑為60～65 mm，菌落圓形，棕色至深棕色，呈粉狀。顯微鏡觀察可見有隔光滑菌絲，菌絲淺黃褐色。分生孢子梗呈保齡球狀至長瓶狀，頂端有明顯囊領(lǐng)，部分彎曲。分生孢子梗不分枝或偶有1～2個分枝，淺黃褐色，表面光滑，有0～2個分隔，分隔處稍有縊縮或不縊縮。分生孢子梗長為7.9～25.7 μm，梗最寬部位為1.7～3.8 μm，最窄部位為0.7～1.7 μm。分生孢子于分生孢子梗頂部鏈生，淺黃褐色，呈梨形、倒卵球形或楔形，基部有平整截面，光滑無隔，大小約為1.9～3.3 μm×1～2 μm，能產(chǎn)生厚垣孢子，直徑大小為2.0～7.0 μm（圖2）。上述特征與為裂殼菌（Schizothecium sp.）屬真菌的形態(tài)特征基本相符[12]。

2.4 L-14的分子鑒定

對菌株L-14的擴增序列進行比對分析，結(jié)果表明，該菌株和Schizothecium fimbratum（登錄號AY999092）的相似性達98%，并以94%的支持率與Schizothecium fimbratum單獨聚為一支（圖3），因此認為L-14菌株屬于Schizothecium sp.真菌。

2.5 相關(guān)抗氧化酶活性的變化

苯丙氨酸解氨酶（PAL）：在第1天時，不同處理間的PAL活性無明顯差異（圖4-A）；從第3天開始，不同接種處理的PAL活性均明顯高于對照，且均在第7天時達到峰值，此時單獨接種L-14處理的PAL活性為處理間最高，是對照的1.5倍；在處理的第9天時，不同接種方式間的PAL活性無顯著差異（圖4-A）。

過氧化物酶（POD）：在處理的前3 d，不同接種處理間的POD活性差異不顯著，自第5天開始，所有處理的POD活性顯著高于對照，其中單獨接種FOC4及L-14+FOC4混合接種處理的POD活性均顯著高于單獨接種L-14處理，但這2個處理間的活性差異不顯著（圖4-B）。

多酚氧化酶（PPO）：第3～7天，不同處理間的PPO活性差異顯著，而以L-14+FOC4混合接種處理的PPO活性最高，極值在第7天，此時的活性為對照的2.1倍，在第9天時該處理的PPO活性雖然有所下降，但仍然比其他2個單獨接種的處理顯著提高（圖4-C）。

超氧化物歧化酶（SOD）：由圖4-D可知，各接種處理的SOD活性在第1天和第3天差異不顯著，從第5天后活性水平顯著升高，在第7天達到峰值水平。處理間以L-14+FOC4混合接種處理的SOD活性最高，單獨接種FOC4的活性次之，單獨接種L-14處理的最低，但仍然顯著高于對照。

3 討論

已有研究結(jié)果表明，DSE分布的生境廣泛，從沿海灘涂到內(nèi)陸高原山地，從熱帶、溫帶到凍原地區(qū)及南北極地區(qū)都有分布[13]，且沒有宿主特異性，在菌根植物和莎草科、十字花科、藜科等傳統(tǒng)非菌根植物的根中均發(fā)現(xiàn)其定殖[14]。有關(guān)DSE的種類組成，尚未有十分全面的描述，但可培養(yǎng)性為采用傳統(tǒng)形態(tài)學和分子生物學方法對其進行分類鑒定提供了基礎(chǔ)[15]。已報道的DSE包括10多個屬，近30個種的真菌。本研究通過形態(tài)學特征分析，結(jié)合28S rDNA基因序列的比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，并與前人[12-13]研究結(jié)果綜合比較，將分離得到菌株L-14鑒定為Schizothecium sp.，并已向中國普通微生物菌種保藏管理中心申請菌種專利保藏，編號為CGMCC NO.12240。隨著菌根研究領(lǐng)域的日益發(fā)展，DSE被廣泛證實能與宿主互惠共生，改善宿主植物的營養(yǎng)狀況，增強宿主植物對有機和無機營養(yǎng)的吸收利用，增加植株根系長度和生物量[16]。本研究中所接種的5株DSE菌株對香蕉幼苗的生物量都有明顯的提高，其中接種L-14的植株比對照鮮重增加50%以上。研究顯示，DSE真菌可分泌出多種胞外水解酶，包括纖維素酶、漆酶、淀粉酶等多種水解酶，上述酶的存在保證其對各種形態(tài)營養(yǎng)元素的利用，從而實現(xiàn)DSE對宿主的促生功能[16-17]，本研究中的DSE菌株的促生功能是否與此相關(guān)還需進一步研究揭示。

已有研究證實，植物形成與DSE形成菌根后可提高宿主的抗病能力[18-20]。目前認為DSE抑制或減輕植物病原菌危害的機理主要有3個方面：競爭作用，DSE可與根際病原菌競爭植物光合產(chǎn)物，DSE的定殖消耗植物根系的碳源，在一定程度上抑制病原菌的發(fā)生和發(fā)展；代謝抑菌物質(zhì)，對病原菌形成抗生作用；引發(fā)植物的防御性反應(yīng)，誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，預防后續(xù)病原菌感染，而植物抗氧化防護系統(tǒng)在其中扮演重要角色[21-22]。在本研究中，不管是單獨接種還是混合接種，相關(guān)抗氧化防護酶的活性都較對照顯著增加，而混合接種的PPO活性和SOD活性更是顯著高于單獨接種，這表明接種DSE菌株L-14能夠進一步增強香蕉的抗氧化防護系統(tǒng)，提高其對枯萎病的抗性。

4 結(jié)論

從甘蔗根圍土壤分離篩選獲得深色有隔內(nèi)生真菌L-14，結(jié)合形態(tài)學特征，序列分析將其鑒定為Schizothecium sp.，接種該菌株可顯著提高香蕉苗的鮮重，并能有效誘導香蕉植株相關(guān)的抗氧化防護酶活性，提高其對香蕉枯萎病的抗性。

參考文獻

[1] Pegg K G， Moore N Y， Bentley S. Fusarium wilt of banana in Australia： a review[J]. Australian Journal of Agricultural Research， 1996， 47（4）： 637-650.

[2] Ploetz R C. Fusarium wilt of banana is caused by several pathogens referred to as Fusarium oxysporum f. sp. cubense[J]. Phytopathology， 2006， 96（4）： 653-656.

[3] 石妞妞， 杜宜新， 阮宏椿， 等. 枯草芽孢桿菌T122F內(nèi)生定殖及對香蕉枯萎病的防治效果[J]. 植物保護， 2015， 41（1）： 95-99.

[4] 余 超， 肖榮鳳， 劉 波， 等. 生防菌FJAT-346-PA的內(nèi)生定殖特性及對香蕉枯萎病的防治效果[J]. 植物保護學報， 2010， 37（3）： 493-498.

[5] 柯仿鋼， 黃思良， 付 崗， 等. 西貢蕉枯萎病生防木霉菌株gz-2的鑒定及生物學特性研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報， 2010， 23（5）： 1 533-1 539.

[6] 茹 祥， 曾 濤， 莫坤聯(lián)， 等. 海南吊羅山原始林區(qū)抗香蕉枯萎病土壤放線菌的分離及田間防治效果試驗[J]. 中國農(nóng)學通報， 2012， 28（13）： 97-102.

[7] Mandyam K， Jumpponen A. Seeking the elusive function of the root-colonising dark septate endophytic fungi[J]. Studies in Mycology， 2005， 53（1）： 173-189.

[8] Knapp D G， Kovács G M， Zajta E， et al. Dark septate endophytic pleosporalean genera from semiarid areas[J]. Persoonia， 2015， 35（1）： 87-100.

[9] Saghai M A， Soliman K M， Jorgensen R A， et al. Ribosomal DNA spacer-length Polymorphism in barley： mendellian inheritance chromosomal location and population dynamics[J]. PNAS， 1984， 81（24）： 5 014-5 018.

[10] 薛玉瀟， 賈慧升， 王國芬， 等. 接種生防菌和病原菌對香蕉抗枯萎病的誘導[J]. 熱帶生物學報， 2012， 33（1）： 62-65， 68.

[11] 楊述省. 生防菌JK-2粗霉素活性物質(zhì)分析及對香蕉枯萎病誘導抗性的研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2009.

[12] Cai L， Jeewon R， Hyde K D. Phylogenetic evaluation and taxonomic revision of Schizothecium based on ribosomal DNA and protein coding genes[J]. Fungal Diversity， 2005， 19（1）： 1-21.

[13] 劉茂軍， 張興濤， 趙之偉. 深色有隔內(nèi)生真菌研究進展[J]. 菌物學報， 2009， 28（5）： 888-894.

[14] Jumpponen A， Mattson K G， Trappe J M. Mycorrhizal functioning of Phialocephala fortinii： interactions with soil nitrogen and organic matter[J]. Mycorrhiza， 1998， 7（2）： 261-265

[15] Tejesvi M V， Ruotsalainen A L， Markkola A M， et al. Root endophytes along a primary succession gradient in northern Finland[J]. Fungal Diversity， 2010， 41（1）： 125-134

[16] Andrade-Linares D R， Grosch R， Restrepo S， et al. Effects of dark septate endophytes on tomato plant performance[J]. Mycorrhiza， 2011， 21（2）： 413-422

[17] Upson R， Read D J， Newsham K K. Nitrogen form influences the response of Deschampsia antarctica to dark septate root endophytes[J]. Mycorrhiza， 2009， 20（1）： 1-11

[18] Hashiba T， Narisawa K. The development and endophytic nature of the fungus Heteroconium chaetospira[J]. FEMS Microbiol Lett， 2005， 252（1）： 191-206

[19] Narisawa K， Hambleton S， Currah R S. Heteroconium chaetospira， a dark septate root endophyte allied to the Herpotrichiellaceae（Chaetothyriales） obtained from some forest soil samples in Canada using bait plants[J]. Mycoscience， 2007， 48（2）： 274-281

[20] Khastini R O， Ohta H， Narisawa K. The role of a dark septate endophytic fungus， Veronaeopsis simplex Y34， in Fusarium disease suppression in Chinese cabbage[J]. J Microbiol， 2012， 50（3）： 618-624

[21] Mandyam K， Jumpponen A. Diversity and function of fungal endophytes of a tallgrass prairie[J]. Proceedings of the Annual Meeting of the Mycological Society of Japan， 2005， 49（1）： 156.

[22] Mandyam K. Dark septate fungal endophytes from a tallgrass prairie and their continuum of interactions with host plants[D]. USA： Kansas State University， 2008.