趙輝　郭靜遠(yuǎn)　孔華　郭安平

摘 要 狗尾草是研究C4光合作用的優(yōu)秀模型，具有熱帶植物的典型特征，也可作為研究熱帶作物的重要模型，高效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是模式植物廣泛服務(wù)于科研的基礎(chǔ)，目前狗尾草作為模式植物的研究在國(guó)外越來越熱門，但在國(guó)內(nèi)還沒有被關(guān)注。但作為模式植物狗尾草現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化技術(shù)還不完善，轉(zhuǎn)化周期有待縮短，轉(zhuǎn)化效率需要進(jìn)一步提高。本研究以狗尾草ME34品系不同階段胚性愈傷為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系研究，通過實(shí)驗(yàn)大大提高了狗尾草的轉(zhuǎn)化效率，縮短了轉(zhuǎn)化周期，為狗尾草轉(zhuǎn)基因研究提供了新的技術(shù)方法，新方法主要包括以下技術(shù)環(huán)節(jié)：高效胚性愈傷誘導(dǎo)技術(shù)，受體胚性愈傷的選擇，適宜轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌株系及培養(yǎng)條件，浸染和共培養(yǎng)條件與方法，抗性愈傷篩選條件，抗性愈傷成苗條件等。

關(guān)鍵詞 狗尾草；遺傳轉(zhuǎn)化；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

中圖分類號(hào) S544.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Setaria viridis is a wild-type species of Setaria italica and is an excellent model for studying the photosynthesis of C4. It is also a model for studying monocotyledonous plants， abiotic stress tolerance and energy plants. At present， the research of S. viridis is becoming more and more popular abroad， but the understanding of this model is still at the initial stage in domestic. In this study， the high efficient embryogenic callus induction technique was established， and the Agrobacterium transformation system of embryogenic callus was studied by using ME34 different stages of embryogenic calli. Which provided a new high efficient Agrobacterium transformation system for Setaria viridis： Light culture of seeds at early stage promoted embryogenic callus induction； Embryogenic calli with less than 3 subcultures was chosen for transformation； AGL 1 strain was used to transform and cultured at 20 ℃； The macro-elements of inoculation and cocultivation medium was halved and pH adjusted to 5.2； AGL 1 was activated 2-3 hours before inoculation； Inoculation with 30～60 minutes； Co-cultured with 5-7 days； Embryogenic calli selection with 40-50 mg/L hygromycin for at least 1 month； In the late period of calli selection， light culture promoted regeneration； At the regeneration and rooting stage， the selection was 20 mg/L hygromycin； Seedlings with root hair were the positive plants.

Key words Setaria viridis； genetic transformation； agrobacterium transformation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.020

狗尾草（Setaria viridis）屬單子葉植物綱禾本科黍亞科，黍亞科常分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，高粱、甘蔗、玉米、谷子、薏苡、黃茅、白茅等都屬于黍亞科，該科植物具有熱帶植物的典型特征。狗尾草是谷子（Setaria italica）的野生近緣種，是研究C4光合作用的優(yōu)秀模型，同時(shí)也是研究單子葉植物、非生物脅迫耐受性和能源植物的模型，目前狗尾草作為模式植物在國(guó)外的研究越來越熱門，國(guó)內(nèi)對(duì)該模式植物的認(rèn)識(shí)還處于起步階段，研究較少。此外，狗尾草是新型的轉(zhuǎn)基因模式植物，與雙子葉模式植物擬南芥相比具有生長(zhǎng)周期短、植株矮小、易于種植、容易轉(zhuǎn)化、基因組小、二倍體、能產(chǎn)生大量自交系種子等優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)良的單子葉模式植物；由于其起源于熱帶，具有C4光合作用系統(tǒng)，與谷子、玉米、高粱、甘蔗、薏苡以及重要能源草類親緣關(guān)系接近，是重要的C4植物模型；狗尾草是谷子（Setaria italica）的野緣近親，兩者核型基本相同，帶型相近，基因組大小都約為510 Mb，是研究谷子基因的重要模型，亦是研究人工選擇對(duì)作物進(jìn)化影響的模式植物；狗尾草對(duì)非生物脅迫耐受能力強(qiáng)，抗性基因豐富，是研究耐旱、耐熱、耐鹽等脅迫反應(yīng)的重要模式植物；狗尾草與重要的能源作物柳枝稷、芒草等黍亞科草類形態(tài)學(xué)上非常相似，是研究這些能源草類的重要模式植物[1-10]。

高效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是模式植物廣泛服務(wù)于科研的基礎(chǔ)，目前狗尾草的研究在國(guó)外越來越熱門，已有遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究報(bào)道，但作為模式植物，其轉(zhuǎn)化周期和轉(zhuǎn)化效率有待進(jìn)一步優(yōu)化提高。本研究參考最早開啟狗尾草模式植物研究的美國(guó)Donald Danforth Plant Science Center 的Thomas P. Brutnell實(shí)驗(yàn)室[1]和美國(guó)康奈爾大學(xué)Joyce Van Eck實(shí)驗(yàn)室[2]的轉(zhuǎn)化方法，建立和優(yōu)化狗尾草胚性愈傷高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，為狗尾草作為模式植物研究提供新的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及轉(zhuǎn)化受體材料 以狗尾草ME34品系為植物材料，材料由美國(guó)Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P. Brutnell實(shí)驗(yàn)室提供。以ME34品系經(jīng)休眠處理的成熟種子去皮發(fā)芽后誘導(dǎo)的胚性愈傷為轉(zhuǎn)化外植體材料。

1.1.2 農(nóng)桿菌及質(zhì)粒 農(nóng)桿菌為AGL 1菌株，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為pZmUbi-GUS（ZmUbis-HPH）見圖1，GUS標(biāo)記基因，HygR植物篩選基因，KanR菌落篩選基因，由美國(guó)Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P. Brutnell 實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)組培技術(shù)

（1）種子的無菌處理和胚性愈傷誘導(dǎo)。選取經(jīng)休眠處理的狗尾草干燥成熟種子，去除種皮后將約1 g種子裝入14 mL離心管，用10 mL有效濃度約1%～3%的次氯酸鈉溶液加50 μL吐溫20溶液，滅菌消毒處理約10 min，無菌水清洗多次后，將種子接種于胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（CIM）上。CIM是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加微量元素35 mg/L ZnSO4·7H2O，0.6 mg/L CuSO4·5H2O，激素2.0 mg/L 2，4-D，0.5 mg/L KT，4 g Gelzan植物凝膠，pH調(diào)整到5.8。接種種子時(shí)注意種子芽點(diǎn)朝上，不直接接觸培養(yǎng)基，每皿培養(yǎng)基接種子約25個(gè)。培養(yǎng)溫度24 ℃，暗培養(yǎng)或光培養(yǎng)（弱光，12 h/12 h，day/night；50%～60%濕度）；觀察胚性愈傷誘導(dǎo)情況。

（2）胚性愈傷繼代培養(yǎng)。挑取種子誘導(dǎo)出的胚性愈傷在CIM上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每2周繼代1次，觀察愈傷增殖和再生情況。培養(yǎng)溫度24 ℃，暗培養(yǎng)。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)胚性愈傷轉(zhuǎn)化

（1）轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備。轉(zhuǎn)化前3～5 d將帶pZmUbi-GUS（ZmUbis-HPH）質(zhì)粒的AGL 1菌株在添加50 mg/L Carbenicillin和50 mg/L Kanamycin 的LB培養(yǎng)基上涂板，最好挑取2個(gè)以上單菌落同時(shí)涂板，20 ℃暗培養(yǎng)。

（2）農(nóng)桿菌的活化處理及浸染。挑取培養(yǎng)3～5 d的新鮮農(nóng)桿菌菌塊，用浸染培養(yǎng)基（CIML）懸浮處理，菌液濃度調(diào)整到OD600 0.6～0.8，然后20 ℃輕搖振蕩培養(yǎng)2～3 h，以活化農(nóng)桿菌。然后將胚性愈傷加入活化的浸染液中，一般每50 mL菌液中加入50～100塊胚性愈傷（直徑約0.5 cm），20 ℃輕搖振蕩浸染0.5～1 h。CIML是液體培養(yǎng)基不添加植物凝膠，以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，添加激素 2.0 mg/L 2，4-D，0.5 mg/L KT，添加乙酰丁香酮（acetosyringone）40 mg/L，添加表面活性劑Synperonic 0.1%（質(zhì)量體積比）；配制兩種浸染液，其中CIML1的MS大量元素減半，pH調(diào)整到5.2，CIML2的參照文獻(xiàn)[1-2]，MS大量元素不減半，pH調(diào)整到5.8。

（3）胚性愈傷與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)。將經(jīng)過浸染過程的胚性愈傷從浸染液中取出，用無菌濾紙吸干多余的菌液，然后將愈傷接到放有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上（CIMC），20 ℃ 暗培養(yǎng)3～9 d，分別在共培養(yǎng)3、5、7、9 d時(shí)取出愈傷，用GUS瞬時(shí)表達(dá)染色，觀察不同浸染和共培養(yǎng)條件的轉(zhuǎn)化效果。CIMC是固體培養(yǎng)基添加4 g Gelzan植物凝膠，以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加激素2.0 mg/L 2，4-D，0.5 mg/L KT，添加乙酰丁香酮（acetosyringone）40 mg/L；配制兩種共培養(yǎng)基，其中CIMC1的MS大量元素減半，pH調(diào)整到5.2，CIMC2的參照文獻(xiàn)[1-2]，MS大量元素不減半，pH調(diào)整到5.8。

（4）抑菌和篩選培養(yǎng)。將經(jīng)過共培養(yǎng)的愈傷接到抑菌和篩選培養(yǎng)基（CIMS）上進(jìn)行抑菌和篩選培養(yǎng)，觀察農(nóng)桿菌抑制情況，農(nóng)桿菌不污染的條件下，每2周繼代1次，24 ℃暗培養(yǎng)或后期配合光培養(yǎng)，觀察抗性愈傷生長(zhǎng)情況，選擇合適的篩選濃度和篩選培養(yǎng)時(shí)間。CIMS是在CIM的基礎(chǔ)上添加抑制農(nóng)桿菌的抗生素Timentin 200 mg/L，添加篩選劑Hygromycin 40或50 mg/L。

（5）抗性愈傷成苗培養(yǎng)。將抗性愈傷或抗性幼芽接到成苗培養(yǎng)基（PRM），24 ℃光培養(yǎng)。PRM是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖20 g/L，pH值為5.8，添加激素2 mg/L KT，添加Timentin 100 mg/L，添加Hygromycin 20 mg/L，培養(yǎng)時(shí)間2～4周。

（6）生根培養(yǎng)。將在PRM上再生達(dá)到約1 cm以上的芽單獨(dú)取出，接到生根培養(yǎng)基（RM）上生根，24 ℃光培養(yǎng)。RM是以改良MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素減半，蔗糖減半，pH值為5.8，添加Timentin 100 mg/L，添加Hygromycin 20 mg/L，培養(yǎng)時(shí)間1～2周。

1.2.3 調(diào)查項(xiàng)目及統(tǒng)計(jì)方法 針對(duì)種子誘導(dǎo)胚性愈傷的數(shù)量，進(jìn)行胚性愈傷誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)，胚性愈傷誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出胚性愈傷的種子數(shù)/發(fā)芽種子數(shù)×100%；針對(duì)不同共培養(yǎng)時(shí)間，不同浸染和共培養(yǎng)條件，進(jìn)行GUS基因瞬時(shí)表達(dá)染色觀察；經(jīng)篩選抑菌過程后，進(jìn)行抗性愈傷塊的數(shù)量統(tǒng)計(jì)，抗性愈傷誘導(dǎo)率=抗性愈傷塊數(shù)/轉(zhuǎn)化的胚性愈傷塊數(shù)×100%，胚性愈傷轉(zhuǎn)化率=再生抗性植株的愈傷塊數(shù)/轉(zhuǎn)化的胚性愈傷塊數(shù)，抗性苗陽(yáng)性率=GUS染色陽(yáng)性苗數(shù)/抗性苗總數(shù)×100%。

1.2.4 GUS檢測(cè) GUS染色液按照常規(guī)方法配制X-Gluc母液和X-Gluc基液，然后按比例混合后儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用，取用于檢測(cè)的組織塊，加入GUS染色液中37 ℃過夜染色，倒掉染色液，70%的酒精脫色1～3次，95%的酒精脫色1～2次，觀察GUS染色情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 光暗培養(yǎng)對(duì)胚性愈傷誘導(dǎo)效率的影響

胚性愈傷誘導(dǎo)率低，以及缺少胚性愈傷的挑取經(jīng)驗(yàn)是限制狗尾草種子胚性愈傷轉(zhuǎn)化體系廣泛應(yīng)用的主要因素。除調(diào)整部分培養(yǎng)基配方外，在同樣的CIM培養(yǎng)基上，參照文獻(xiàn)[1-2]的方法在24 ℃暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)出的愈傷（圖2-A），胚性愈傷誘導(dǎo)率低于10%，因此需要多次繼代增殖以產(chǎn)生足夠的胚性愈傷進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

經(jīng)觀察愈傷誘導(dǎo)過程中的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷誘導(dǎo)率低的緣故主要在于誘導(dǎo)過程中非胚性的愈傷比胚性的愈傷生長(zhǎng)快，很快就占領(lǐng)了胚性愈傷的生長(zhǎng)空間；進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)胚性愈傷都從種子發(fā)芽后的生長(zhǎng)點(diǎn)處長(zhǎng)出來，而非胚性的愈傷是從發(fā)芽后的葉子和根處長(zhǎng)出。為了提高種子的胚性愈傷誘導(dǎo)率，將胚性愈傷誘導(dǎo)過程移至光培養(yǎng)狀態(tài)下，實(shí)驗(yàn)表明由于光照下葉子變綠，變綠的葉子對(duì)培養(yǎng)基的激素耐受力提高，難誘導(dǎo)出愈傷，而生長(zhǎng)點(diǎn)部位的愈傷誘導(dǎo)不受影響，這樣就大大提高了胚性愈傷的誘導(dǎo)效率。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察，如果胚性愈傷誘導(dǎo)一直在光下進(jìn)行，誘導(dǎo)出的胚性愈傷會(huì)很快老化再生成芽，不利于胚性愈傷的繼代增殖和基因轉(zhuǎn)化的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

因此，綜合以上實(shí)驗(yàn)與觀察，在種子誘導(dǎo)胚性愈傷初期，即接種子后在光照下培養(yǎng)一周后移到暗培養(yǎng)條件，能大大提高種子胚性愈傷的誘導(dǎo)率（見圖2-B），ME34品系胚性愈傷誘導(dǎo)率達(dá)43%，A10品系胚性愈傷誘導(dǎo)率達(dá)50%，同時(shí)誘導(dǎo)出的胚性愈傷不易老化，不影響胚性愈傷繼代增殖能力。

2.2 浸染和共培養(yǎng)條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

根據(jù)玉米、水稻、大豆等作物高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化經(jīng)驗(yàn)，參見文獻(xiàn)[1-2]的方法，實(shí)驗(yàn)為狗尾草轉(zhuǎn)化設(shè)計(jì)了兩套不同的浸染和共培養(yǎng)條件，OLD方法與文獻(xiàn)[1-2]的一致，采用CIML2和CIMC2培養(yǎng)基，NEW方法改變了浸染培養(yǎng)基和共培養(yǎng)培養(yǎng)基的成分與pH，即MS大量元素減半，pH調(diào)整到5.2，采用CIML1和CIMC1培養(yǎng)基。共培養(yǎng)溫度為20 ℃。從圖3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)不同時(shí)間的GUS染色情況可知，NEW方法GUS染色整體情況比OLD方法強(qiáng)：共培養(yǎng)3 d時(shí)差異不大，僅在愈傷表面染色；共培養(yǎng)5 d時(shí)GUS染色差異明顯，NEW方法明顯染色面積更大，染色深入到胚性愈傷塊內(nèi)部，而OLD方法GUS染色面積小，主要是愈傷塊表面染色；共培養(yǎng)7 d時(shí)，兩種方法染色面積相當(dāng)，但NEW方法染色更深入胚性愈傷內(nèi)部。共培養(yǎng)階段GUS染色情況反映的是被轉(zhuǎn)化基因進(jìn)入受體細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)情況，強(qiáng)的瞬時(shí)表達(dá)意味著更高的轉(zhuǎn)化效率。此外，從瞬時(shí)表達(dá)情況看，共培養(yǎng)3 d時(shí)農(nóng)桿菌只進(jìn)入了愈傷表面少量的胚性受體細(xì)胞，得到染色的主要是愈傷塊表面不容易再生植株的非胚性愈傷；共培養(yǎng)5 d以上才有足夠量的胚性愈傷細(xì)胞受到農(nóng)桿菌感染得到轉(zhuǎn)化，因此狗尾草胚性愈傷轉(zhuǎn)化時(shí)共培養(yǎng)時(shí)間至少5 d以上才有高的轉(zhuǎn)化效率。

從表1統(tǒng)計(jì)結(jié)果可見，在其他條件一致，浸染和共培養(yǎng)階段大量元素含量和pH條件的改變對(duì)狗尾草胚性愈傷農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響是顯著的，OLD和NEW的條件相比，抗性愈傷率從51%升高到100%，胚性愈傷轉(zhuǎn)化率從42%提高到80%，轉(zhuǎn)化效率成倍提高。

2.3 胚性愈傷繼代時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，狗尾草胚性愈傷不耐繼代，隨著繼代次數(shù)的增加，胚性愈傷容易老化、分化，轉(zhuǎn)化效率明顯降低。從圖4可見，分別挑選繼代1次和4次的胚性愈傷在相同轉(zhuǎn)化條件下同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，胚性愈傷經(jīng)過Hygromycin 50 mg/L 1個(gè)月篩選抗性愈傷再生情況差異顯著，早期的胚性愈傷有很多抗性愈傷再生，說明轉(zhuǎn)化效率很高；繼代4次的胚性愈傷抗性愈傷再生能力很差，說明轉(zhuǎn)化效率很低。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，胚性愈傷的狀態(tài)和繼代時(shí)間顯著影響狗尾草農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率。

2.4 篩選條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

參照文獻(xiàn)[1-2]的方法對(duì)轉(zhuǎn)化的胚性愈傷進(jìn)行了篩選，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用40 mg/L Hygromycin篩選半月后轉(zhuǎn)接到成苗培養(yǎng)基上很難得到真正的轉(zhuǎn)化苗，假陽(yáng)性很高。實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)化后的胚性愈傷在40 mg/L Hygromycin CIMS上培養(yǎng)半月時(shí)，大部分轉(zhuǎn)化愈傷還沒有褐化，新鮮的抗性愈傷還沒有大量再生。高效的胚性愈傷轉(zhuǎn)化，在篩選階段一般先伴隨著舊愈傷的大量褐化死亡，之后是新的抗性愈傷的再生和增殖。由于在參考文獻(xiàn)中未看到明顯此種現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)中調(diào)整了篩選條件，在抗性愈傷誘導(dǎo)階段（CIMS），以及成苗（PRM）和生根（RM）階段都增強(qiáng)了篩選力度，實(shí)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。從表2可知ME34狗尾草品系胚性愈傷適應(yīng)較高的篩選濃度，愈傷篩選階段40～50 mg/L Hygromycin的濃度下至少篩選1個(gè)月（2周繼代一次）才有足量的抗性愈傷再生，此外愈傷篩選階段Hygromycin的篩選濃度不同會(huì)影響抗性苗陽(yáng)性率，在40 mg/L Hygromycin的條件下抗性苗陽(yáng)性率為42%，每塊愈傷再生的抗性苗數(shù)多，在50 mg/L Hygromycin的條件下抗性苗陽(yáng)性率為95%，每塊愈傷再生的抗性苗數(shù)明顯減少（GUS染色情況見圖5）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，更高的篩選條件抗性苗的陽(yáng)性率增加，但抗性苗出苗數(shù)減少，轉(zhuǎn)化過程中需要觀察愈傷生長(zhǎng)狀況調(diào)整篩選條件，才能結(jié)合不同的狗尾草品系，不同繼代次數(shù)的胚性愈傷受體材料情況，達(dá)到高效的篩選和再生。

2.5 光照條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著胚性愈傷篩選時(shí)間的加長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化周期隨之延長(zhǎng)，為了縮短轉(zhuǎn)化周期，在胚性愈傷篩選階段后半月將進(jìn)行篩選的愈傷移到弱光下培養(yǎng)，這樣的改變達(dá)到了很好的轉(zhuǎn)化和成苗效果，一方面抗性愈傷繼續(xù)再生增殖，另一方面較早再生的抗性愈傷在光照的影響下開始分化，縮短了轉(zhuǎn)化苗后繼再生的時(shí)間，提高了轉(zhuǎn)化苗的再生效率，狗尾草轉(zhuǎn)化效率成倍提高（見圖6）。

2.6 優(yōu)化后的狗尾草ME34品系胚性愈傷農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系及時(shí)間表

綜合以上實(shí)驗(yàn)，狗尾草ME34品系胚性愈傷農(nóng)桿菌高效轉(zhuǎn)化體系基本過程如下（圖7）：胚性愈傷誘導(dǎo)需要4周，種子接到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的第1周光培養(yǎng)，之后暗培養(yǎng)；誘導(dǎo)出的胚性愈傷直接用于轉(zhuǎn)化或繼代1～2次后再轉(zhuǎn)化，第1次胚性愈傷繼代2周時(shí)間，第2次1周時(shí)間，都有較高的轉(zhuǎn)化效率，胚性愈傷繼代3次后轉(zhuǎn)化效率明顯降低；胚性愈傷浸染后共培養(yǎng)5～7 d；接著進(jìn)行抑菌和篩選，篩選在高濃度篩選條件（40～50 mg/L Hygromycin）下4周，每2周繼代1次，愈傷篩選后期轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)；成苗培養(yǎng)（低篩選濃度20 mg/L Hygromycin）1周；生根培養(yǎng)1周（低篩選濃度20 mg/L Hygromycin）。

3 討論

狗尾草除作為模式植物外，其轉(zhuǎn)化體系本身也是很好的研究轉(zhuǎn)化技術(shù)的模式，其胚性愈傷誘導(dǎo)周期短，且能繼代增殖，通過改變胚性組織誘導(dǎo)條件，能很好的驗(yàn)證外界條件對(duì)體胚組織誘導(dǎo)、發(fā)育、分化等的影響。通過實(shí)驗(yàn)證明改變浸染和共培養(yǎng)條件能顯著提高狗尾草胚性愈傷轉(zhuǎn)化效率，無論瞬時(shí)表達(dá)效率還是穩(wěn)定表達(dá)效率都明顯提高，因此浸染和共培養(yǎng)條件是狗尾草農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的重要技術(shù)環(huán)節(jié)；此外，愈傷的狀態(tài)（繼代次數(shù)）也是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，繼代3次以上的胚性愈傷，不建議用作受體材料；同時(shí)，光暗培養(yǎng)條件能顯著影響狗尾草胚性愈傷誘導(dǎo)效率和抗性愈傷再生成苗效率，這可能跟狗尾草的熱帶起源有關(guān)，配合適宜的光暗培養(yǎng)條件是提高狗尾草胚性愈傷整體轉(zhuǎn)化效率的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系，整個(gè)轉(zhuǎn)化周期11～14周，比國(guó)外文獻(xiàn)[1-2]4個(gè)月（16～17周）縮短了1個(gè)多月時(shí)間，轉(zhuǎn)化效率也成倍提高，由A10品系5%的轉(zhuǎn)化效率[2]，提高到ME34品系約43%×22×83%×95%=135.6%的轉(zhuǎn)化效率，國(guó)內(nèi)還沒有狗尾草高效轉(zhuǎn)化體系的報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)狗尾草的轉(zhuǎn)化效率還跟品系有關(guān)系，ME34是比較適宜轉(zhuǎn)化的品系，原因主要是該品系的胚性愈傷容易誘導(dǎo)，并且耐受繼代增殖，抗性愈傷再生成苗的能力也較強(qiáng)；與之相比A10品系雖然胚性愈傷更容易誘導(dǎo)，但該品系的胚性愈傷不耐受繼代過程，容易老化，對(duì)篩選劑敏感，抗性愈傷再生成苗的能力弱，因此需要根據(jù)不同品系的特點(diǎn)適當(dāng)?shù)恼{(diào)整轉(zhuǎn)化中的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)，才能達(dá)到高的轉(zhuǎn)化效率。ME34和A10品系都是國(guó)外研究較多的狗尾草品系，網(wǎng)上已經(jīng)有它們的基因組數(shù)據(jù)信息公開，便于轉(zhuǎn)化前后的基因研究與比對(duì)。

參考文獻(xiàn)

[1] Thomas P Brutnell， Lin Wang， Kerry Swartwood， et al. Setaria viridis： A model for C4 photosynthesis[J]. The Plant Cell， 2010， 22： 2 537-2 544.

[2] Eck Joyce Van， Kerry Swarwood. Setaria viridis[J]. Methods in Molecular Biology， 2015， 1223： 57-67.

[3] Pinghua Li， Thomas P Brutnell. Setaria viridis and Setaria italica， model genetic systems for the panicoid grasses[J]. Journal of Experimental Botany， 2011， 62（9）： 3 031-3 037.

[4] Hui Jiang， Hugues Barbier， Thomas Brutnell. Methods for performing crosses in Setaria viridis， a new model system for the grasses[J]. Journal of Visualized Experiments， 2013， 80（e50527）： 1-8， doi： 10.3791/50527.

[5] 李秀蘭， 陳瑞陽(yáng). 谷子和狗尾草核型分析[J]. 武漢植物學(xué)研究，1985， 3（4）： 409-412.

[6] 李 瑋， 姜翠茹， 陳龍俊. C4模式植物的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2010（23）： 22

[7] 龔秀秀， 王 凱， 董 雯， 等. C4光合作用調(diào)節(jié)機(jī)制[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2013（3）： 19-23

[8] 智 慧， 刁現(xiàn)民， 呂 芃， 等. 人工鹽脅迫法鑒定谷子及狗尾草物種耐鹽基因型[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2004， 8（4）： 15-18.

[9] 殷立娟， 李美榮. 中國(guó)C4植物的地理分布與生態(tài)學(xué)研究Ⅰ. 中國(guó)C4植物及其與氣候環(huán)境的關(guān)系[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 1997， 17（4）： 350-354.

[10] 孫 偉， 王德利， 王 立， 等. 狗尾草蒸騰特性與水分利用效率對(duì)模擬光輻射增強(qiáng)和CO2濃度升高的響應(yīng)[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)， 2003， 27（4）： 448-453.