范瓊　鄧愛妮　朱玉龍　周聰　趙敏　葉海輝

摘 要 研究地膽頭提取液中總多酚和類黃酮含量及其生理活性。測定了不同地膽頭提取液的總多酚含量、類黃酮含量及其清除DPPH自由基的能力，并比較了不同料液比的地膽頭提取液對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的抑制率。結(jié)果表明：不同提取劑提取的地膽頭總多酚和類黃酮含量不同，其中，丙酮提取液中總多酚和類黃酮含量分別為12.27 mg/g、7.50 mg/g，均高于乙醇、甲醇、水提取液中的總多酚和類黃酮含量；地膽頭丙酮、甲醇、乙醇提取液對(duì)DPPH 自由基的清除率分別為94.60%、93.41%、90.87%，均高于人工合成氧化劑BHT（89.15%）和地膽頭水提取液（62.75%）；地膽頭提取液對(duì)ACE的抑制效果隨著料液比的增加而越明顯，其中，1 ∶ 10的料液比下，乙醇地膽頭提取液對(duì)ACE抑制率達(dá)到96.67%。通過本研究得出，在地膽頭乙醇、甲醇、水、丙酮4種提取液中，丙酮提取液的總多酚和類黃酮含量最高，且其抗氧化性效果最佳，乙醇地膽頭提取液的抗高血壓能力最強(qiáng)。地膽頭提取液具有明顯的抗氧化性和抗高血壓等生理活性，在功能食品及中草藥領(lǐng)域里具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 地膽頭；化學(xué)成分；生物活性；抗氧化性；抗高血壓

中圖分類號(hào) S567.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The polyphenol content， flavonoid content and DPPH scavenging activity of Elephantopus scaber（ES）extracts were detected， and the angiotensin converting enzyme（ACE）scavenging activity of ES extracts at different ratio solid-to-solvent were compared. The polyphenol and flavonoid content from ES with different extraction solvent were different， the polyphenol and flavonoid content of acetone extract was 12.27 mg/g and 7.50 mg/g， both higher than that of the methanol extract， ethanol extract， water extract. The DPPH scavenging activity of ES acetone extract， methanol extract and ethanol extract was 94.60%， 93.41%， 90.87%， respectively， which was higher than the DPPH scavenging activity of ES water extract and BHT； With the increasing of ratio solid-to-solvent， the ACE scavenging activity of ES extracts was better， the ACE scavenging activity of ES ethanol extract represented 96.67% at ratio solid-to-solvent of 1 ∶ 10. Among the four ES extracts， more polyphenol and flavonoid content were extracted by acetone than methanol， ethanol and water. And the antioxidant activity of ES acetone extract was the best. ES ethanol extract showed the best anti-hypertension. ES has great potential for the development of functional foods and herbs due to its excellent antioxidant activity and anti-hypertension activity.

Key words Elephantopus scaber； chemical constituents； bio-activity； antioxidant activity； anti-hypertension

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.025

地膽頭（Elephantopus scaber）別名苦地膽、土公英等，屬多年生草本，是中國長江以南常用的民間草藥，并收錄于《海南常見中草藥名錄》。地膽頭有清熱解毒、利尿消腫、治急性黃疸型肝炎和肝硬化腹水等功效[1]。近代醫(yī)學(xué)研究指出， 地膽頭含有羽扇豆醇、豆甾醇和倍半萜類化合物——內(nèi)酯、菊糖、果糖和氨基酸等化學(xué)成分， 其有效成分為倍半萜類化合物[2]。地膽頭全草對(duì)痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌有抑制作用。在國外，利用地膽頭治療糖尿病、腫瘤和肝炎等研究較廣泛[3-6]，在國內(nèi)，對(duì)地膽頭的研究大多是對(duì)其化學(xué)成分、微量元素、抗炎抗菌性和抗腫瘤等方面進(jìn)行分析[7-10]。在實(shí)際運(yùn)用上，中國已有多個(gè)含地膽頭的復(fù)方制劑應(yīng)用于臨床。此外，因?yàn)榫哂歇?dú)特香味及藥用功效，地膽頭作為煲湯輔料被中國南方多省地使用[11]。許多研究表明地膽頭在保肝、抗糖尿病、抗高血壓、抗腫瘤等生理活性上有巨大的潛在價(jià)值，但是目前對(duì)地膽頭生理活性的整體性研究尚少見報(bào)道。

本研究定量測定了地膽頭提取液中抗氧化成分總多酚和類黃酮的含量，并分別從DPPH清除率和ACE抑制率2方面對(duì)地膽頭的生理活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為地膽頭資源的開發(fā)利用提供科研基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

地膽頭全草，購于海南省儋州市紅旗市場，野生品種，經(jīng)鑒定為地膽頭全草；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度97.8%，德國Dr.Ehrenstorfer公司），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%，美國Sigma公司），血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（來自兔肺，≧2.0 units/mg，美國Sigma公司）；其他試劑均為分析純。

儀器：HR5026植物粉碎機(jī)[飛利浦（中國）投資有限公司]，SHZ-B水浴恒溫振蕩器（常州諾基儀器有限公司生產(chǎn)），F(xiàn)D53熱風(fēng)循環(huán)式烘箱（德國Binder賓得公司生產(chǎn)），AE200 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)]，UV-3900 紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司生產(chǎn)），TDL-5C離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 地膽頭提取液的制備 將地膽頭洗凈，于75 ℃烘干，過100目篩后存放于干燥陰涼處備用。

取4個(gè)500 mL錐形瓶，各加入地膽頭粉末10 g，并分別加入200 mL蒸餾水、80%乙醇（V/V）、80%甲醇（V/V）、80%丙酮（V/V）等4種不同提取液，振蕩12 h；取出后離心過濾，并分別用提取溶劑定容至200 mL，濾液分別為地膽頭水提取液、乙醇提取液、甲醇提取液和丙酮提取液。提取液存放于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多酚含量的測定 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（0.100±0.001）g，用水完全溶解后，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中定容，配制成濃度為1 000 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液到50 mL容量瓶中，定容；分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，加10%福林酚顯色劑5 mL，反應(yīng)5 min后，加入7.5%碳酸鈉溶液4 mL，混勻，室溫下反應(yīng)1.0 h；在750 nm波長下測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=0.001 3x+0.116 4（其中y為沒食子酸含量，單位為mg，x為吸光度，R2=0.999 3），具有很好的線性關(guān)系。

提取液中總酚含量的測定：移取0.1 mL提取液，按照測定沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，在750 nm波長下測定其吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算地膽頭總多酚的沒食子酸當(dāng)量。以1 g地膽頭干樣中的沒食子酸毫克當(dāng)量表示多酚含量。

1.2.3 類黃酮含量的測定 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（0.100±0.001）g，用水完全溶解后，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中定容，配制成濃度為1 000 mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取3.0、6.0、8.0、10.0、14.0、16.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液到100 mL容量瓶中，定容。

分別吸取0.5 mL地膽頭提取液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL比色管中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，再加水至刻度，密塞，搖勻，放置15 min；以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，在波長510 nm處測定吸光值；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=0.002 6x+0.023 2（其中y為蘆丁含量，單位為mg，x為吸光度，R2=0.997 7），具有很好的線性關(guān)系，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算地膽頭類黃酮的蘆丁當(dāng)量。以1 g地膽頭干樣中的蘆丁毫克當(dāng)量表示類黃酮含量。

1.2.4 DPPH自由基清除率的測定 0.2 g/L DPPH溶液的配制：精確稱取0.02 g DPPH，用無水乙醇溶解并定容于100 mL的棕色容量瓶中，此溶液濃度為0.2 g/L，即配即用。

BHT溶液的配制：精確稱取0.1 g BHT，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，即得濃度為1.0 g/L的BHT儲(chǔ)備液。

DPPH自由基清除率測定：分別吸取0.1 mL對(duì)照空白溶液、地膽頭提取液和BHT溶液，各加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH=7.4）0.4 mL，混勻；然后各加入0.5 mL濃度為0.2 g/L的DPPH溶液，混勻后在室溫下反應(yīng)20 min后，于最大吸收波長517 nm處以水為參比溶液，測定其吸光度，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。并按下式計(jì)算清除率。

清除率/%=[1-■]×100

式中：A0為0.5 mL DPPH溶液與樣品溶劑的吸光度；Ai為0.5 mL DPPH溶液與樣品溶液的吸光度；Aj為0.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液與樣品溶液的吸光度。

1.2.5 ACE抑制率的測定 ACE抑制率的測定參考Cushman等[12]的方法并稍作改動(dòng)。用0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH=8.3）將馬尿酰-組胺酰-亮氨酸（HHL）配成5.0 mmol/L的溶液；在2 mL小離心管中分別加入150 μL的5 mmol/L的HHL溶液和100 μL的地膽頭提取液，于37 ℃下保溫5 min后，再加入50 μL ACE溶液（溶解于蒸餾水中，活力為0.1 U/mL），混勻后在37 ℃下保溫60 min；加入200 μL 1.0 mol/L的鹽酸溶液以終止反應(yīng)，再加入1.5 mL乙酸乙酯，經(jīng)15 s振蕩混勻后，靜置5 min；移取1.0 mL的乙酸乙酯層，烘箱烘干（90 ℃，90 min）后，加入1.5 mL蒸餾水，混勻后在228 nm處測定吸光度，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。

對(duì)照試驗(yàn)：在2 mL小離心管中分別加入150 μL HHL溶液和100 μL的地膽頭提取液，于37 ℃下保溫5 min后，加入200 μL 1.0 mol/L鹽酸溶液以終止反應(yīng)；加入50 μL ACE溶液（溶解于蒸餾水中，活力為 0.1 U/mL），混勻后在37 ℃下保溫60 min；再加入1.5 mL乙酸乙酯，經(jīng)15 s振蕩混勻后，靜置5 min；移取1.0 mL的乙酸乙酯層，烘箱烘干（90 ℃，90 min）后，加入1.5 mL蒸餾水，混勻后在228 nm處測定吸光度。并按下式計(jì)算抑制率。

抑制率/%=[1-■]×100

式中：A0為提取溶劑和ACE反應(yīng)的吸光度；Ai為地膽頭提取液與ACE反應(yīng)的吸光度；Aj為對(duì)照試驗(yàn)反應(yīng)的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Origin 8.0軟件處理，多重比較分析用SPSS 15.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 地膽頭提取液中的總多酚含量

酚類物質(zhì)廣泛存在于植物食品中，多酚物質(zhì)具有特殊的生物活性，是強(qiáng)的抗自由基物質(zhì)，其活性相當(dāng)于VE的20倍[13]。地膽頭不同提取液中多酚含量如表1所示，水提取液和80%甲醇提取液的多酚含量差異性不明顯，其余樣品間的多酚含量差異顯著。80%丙酮提取液中的總多酚含量明顯高于其他提取液的總多酚含量。水提取液、80%乙醇提取液、80%甲醇提取液、80%丙酮提取液中的總多酚含量分別為9.25、8.98、9.30、12.27 mg/g，這表明丙酮能更好地提取地膽頭中的多酚物質(zhì)。

2.2 地膽頭提取液中的類黃酮含量

黃酮類化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫、防治血管硬化、降血糖等功能[14]。從表2中可以得知，分別用水、80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮溶液提取地膽頭中的類黃酮，所得類黃酮含量從高到低順序分別為80%丙酮提取液、80%甲醇提取液、80%乙醇提取液、水提取液，其類黃酮含量分別為7.50、5.63、5.27、4.21 mg/g，且各組樣品之間的類黃酮含量差異顯著。

2.3 地膽頭去除DPPH自由基的清除率

自由基是游離存在的含有不配對(duì)電子的基團(tuán)，它們在體內(nèi)有很強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力，易對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等產(chǎn)生傷害，從而引起機(jī)體損傷[15]。從表3可知，80%乙醇提取液、80%甲醇提取液、80%丙酮提取液的DPPH自由基清除率分別為90.87%，93.41%，94.60%，高于BHT和水提取液對(duì)DPPH的清除率，BHT的DPPH自由基清除率為89.15%，水提取液的DPPH清除率為62.75%。同時(shí)，各個(gè)樣品的DPPH清除率差異性明顯。從試驗(yàn)結(jié)果可以得知，有機(jī)溶劑比無機(jī)溶劑提取的地膽頭提取液具有更強(qiáng)的抗氧化性效果，這表明地膽頭中的抗氧化性物質(zhì)能更好地溶解于有機(jī)相溶劑中。

2.4 地膽頭對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的抑制率

高血壓嚴(yán)重危害著人類的健康，95%以上的患者是原發(fā)性高血壓，而通過抑制ACE活性可以有效地降低原發(fā)性高血壓的發(fā)生[16]。ACE主要參與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，ACE能催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)榫邚?qiáng)效升高血壓作用的物質(zhì)血管緊張素Ⅱ，同時(shí)，ACE將具降壓作用的物質(zhì)舒緩激肽降解，使之失去降壓作用[17]。目前用于降血壓的藥物，其降血壓原理主要是抑制ACE的活性。本研究中，在37 ℃下，往地膽頭提取液中加入HHL反應(yīng)5 min后，加入ACE，HHL在ACE的催化下快速分解成馬尿酸和二肽HL，如果地膽頭提取液對(duì)ACE活性有抑制效果，馬尿酸和二肽的生產(chǎn)量會(huì)相應(yīng)減少，通過測定馬尿酸含量的減少量來計(jì)算地膽頭對(duì)ACE的抑制率，評(píng)價(jià)地膽頭的抗高血壓效果。不同濃度的地膽頭提取液對(duì)ACE的抑制效果見圖1，不同料液比下地膽頭提取液對(duì)ACE抑制率的多重比較分析見表4。從表中可以看出，在顯著水平為0.05時(shí)，料液比為1 ∶ 25的80%乙醇提取液和料液比為1 ∶ 10的80%丙酮提取液對(duì)ACE的抑制率差異不顯著，其余各組樣品之間均差異顯著。表4和圖1表明，地膽頭乙醇提取液對(duì)ACE的抑制效果最好，且隨著料液比的增加，地膽頭提取液對(duì)ACE的抑制率越高。當(dāng)料液比為1 ∶ 10時(shí)，地膽頭乙醇提取液的ACE抑制率達(dá)到96.67%，而水提取液和丙酮提取液對(duì)ACE的抑制率分別僅為53.33%和56.67%。

3 討論

沒有一種單一的方法能夠充分地評(píng)價(jià)一種物質(zhì)的生理活性，本試驗(yàn)采用多種方法從不同角度研究了地膽頭的化學(xué)成分及其生理活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同提取溶劑影響地膽頭中的總多酚、類黃酮提取含量。不同溶劑提取液中總多酚含量由低到高分別為80%乙醇提取液、水提取液、80%甲醇提取液、80%丙酮提取液。不同溶劑提取液的類黃酮含量排序?yàn)樗崛∫?80%乙醇提取液<80%甲醇提取液<80%丙酮提取液，說明80%丙酮溶劑能更好地提取地膽頭中總多酚和類黃酮，其含量分別為12.27 mg/g、7.50 mg/g。在其他南藥研究中，祁靜[18]發(fā)現(xiàn)檳榔提取工藝經(jīng)優(yōu)化后得到的多酚提取率為14.96 mg/g，王呈文等[19]研究發(fā)現(xiàn)牛大力的黃酮類含量為5.52 mg/g，由此可以看出，在南藥中地膽頭含有相對(duì)較高的總多酚和類黃酮含量。

本研究結(jié)果表明，80%丙酮地膽頭提取液對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)94.60%，均高于80%乙醇、80%甲醇、水地膽頭提取液；有機(jī)溶劑提取液對(duì)DPPH自由基的清除率均高于人工氧化劑BHT，說明地膽頭有機(jī)溶劑提取液有著明顯的抗氧化效果，其原因可能與地膽頭提取液中的總多酚和類黃酮含量有關(guān)，因?yàn)轭慄S酮和總多酚物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化效果[20-21]。溫先敏等[22]研究發(fā)現(xiàn)，地膽頭水提物具有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛作用，說明地膽頭具有一定的抗氧化性效果，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符。此外，本研究結(jié)果表明，不同溶劑提取液對(duì)ACE的抑制率從低到高分別為水提取液、80%丙酮提取液、80%乙醇提取液，且隨著料液比的增加，其對(duì)ACE的抑制率增強(qiáng)，在料液比為1 ∶ 10時(shí)，80%乙醇提取液對(duì)ACE的抑制率達(dá)到96.67%，具有非常明顯的抗高血壓效果。梁僑麗等[23]研究發(fā)現(xiàn)地膽頭對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，表明地膽頭有抗氧化、抗腫瘤等生理活性。

以上各方面試驗(yàn)結(jié)果表明，在南藥中地膽頭含有相對(duì)較高的抗氧化成分，并具有明顯的抗氧化和抗高血壓等生理活性。由此可見，地膽頭作為一種天然藥食同源植物具有巨大的開發(fā)及利用潛力。

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