劉曉曉 王星冉 王義勛 黃俊斌 陳京元 鄭露

摘要：【目的】研究馬尾松毛蟲高毒力球孢白僵菌菌株的生物學(xué)特性，為利用球孢白僵菌對馬尾松毛蟲進(jìn)行生物防治及大規(guī)模生產(chǎn)球孢白僵菌提供理論依據(jù)。【方法】在PDA培養(yǎng)基上測定6個(gè)溫度梯度（17、20、23、26、29和32 ℃）對供試球孢白僵菌高毒力菌株（B-2、B-14和B-19）生長速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率的影響；以查比克培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以等質(zhì)量的3種不同碳源或氮源代替蔗糖和硝酸鉀，測定不同碳、氮源對供試球孢白僵菌高毒力菌株生長速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率的影響。【結(jié)果】供試菌株在不同溫度條件下的生長存在一定差異，過高或過低均不利于B-2、B-14和B-19菌株菌絲生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)，在26 ℃下各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)均達(dá)最高值，菌株的生長速率、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率分別為3.36～3.77 mm/d、9.33×104～16.33×104個(gè)/mL和92.67%～99.67%；在不同碳氮源利用方面，最適生長、產(chǎn)孢的碳源為葡萄糖，菌絲生長速率和產(chǎn)孢量分別為3.56～4.35 mm/d、1.00×104～1.33×104個(gè)/mL，但孢子萌發(fā)率普遍不高；最適生長的氮源為蛋白胨，菌絲生長速率為4.40～4.81 mm/d；最適產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的氮源為酵母浸出液，產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率分別為5.67×104～51.33×104個(gè)/mL、58.03%～100.00%?！窘Y(jié)論】B-2菌株可優(yōu)先選作球孢白僵菌工業(yè)化生產(chǎn)菌種；在26 ℃下選擇葡萄糖和酵母浸出液為碳氮源可提高菌劑的生產(chǎn)效率。

關(guān)鍵詞： 球孢白僵菌；高毒力菌株；馬尾松毛蟲；生物學(xué)特性

中圖分類號： S763.421 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）06-1019-05

Biological characteristics of highly virulent strains of Beauveria bassiana for Dendrolimus punctatus

Abstract：【Objective】Biological characteristics of highly virulent strains of Beauveria bassiana were tested to provide theoretical basis for production and biocontrol of B. bassiana against Dendrolimus punctatus. 【Method】Effects of six different temperatures（17， 20， 23， 26， 29 and 32 ℃） on growth rate， sporulation quantity and spore germination rate of highly virulent strains of B. bassiana（B-2， B-14 and B-19） were measured respectively on PDA media. With Czapek media as the base， sucrose and potassium nitrate were replaced by three kinds of carbon sources or nitrogen sources of the same mass， in order to study the effects of different carbon sources and nitrogen sources on growth rate， sporulation quantity and spore germination rate of highly virulent strains of B. Bassiana. 【Result】The three tested strains grew differently under different temperatures. Extremely high and low temperatures were not beneficial to mycelial growth， sporulation and spore germination of B. bassiana strains. All biological indicators could reach the highest level under 26 ℃. The growth rate， sporulation quantity and spore germination rate were 3.36-3.77 mm/d， 9.33×104-16.33×104/mL and 92.67%-99.67% respectively. In terms of carbon sources application， glucose was the most suitable for growth and sporulation， with growth rate of 3.56-4.35 mm/d and sporulation quantity of 1.00-1.33×104/ml， but spore germination rate was low. Peptone was the best nitrogen source for mycelial growth（4.40-4.81 mm/d） and yeast extract was the most suitable for sporulation（sporulation quantity 5.67×104-

51.33×104/mL） and spore germination（spore germination rate 58.03%-100.00%）. 【Conclusion】Strain B-2 can be preferentially selected for industrial production of B. bassiana. At temperature 26 ℃， carbon source glucose and nitrogen source yeast extract can increase production effeciency of B. bassiana.

Key words： Beauveria bassiana； highly virulent strain； Dendrolrimus punctatus； biological characteristic

0 引言

【研究意義】馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatus）是我國南方松樹林中發(fā)生最嚴(yán)重的一種森林害蟲，主要為害馬尾松、濕地松、火炬松和黑松等松屬植物，松樹一旦受害，輕則松針枯黃卷曲，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)形似火燒，松林大片枯死（陳順立等，2004）。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一種廣譜性殺蟲真菌，林間應(yīng)用時(shí)對人畜無害，安全環(huán)保，也因其較強(qiáng)的殺蟲活性被廣泛應(yīng)用于松毛蟲等多種農(nóng)林害蟲的防治（Feng et al.，1994）。不同球孢白僵菌菌株產(chǎn)孢量高低、孢子萌發(fā)快慢及多少等與其毒力存在密切的相關(guān)性（王成樹等，1998）。因此，研究馬尾松毛蟲高毒力球孢白僵菌菌株的生物學(xué)特性，對應(yīng)用球孢白僵菌防治馬尾松毛蟲具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人對不同球孢白僵菌菌株的生物學(xué)特性已有較多報(bào)道。鄺灼彬等（2005）測試了6個(gè)溫度對球孢白僵菌菌株（分離自小猿葉甲成蟲）生長速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率的影響，結(jié)果表明，在17～26 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，該菌株的菌落生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率均升高，26 ℃最有利于該菌株的生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)，在32 ℃下該菌株不能生長。熊琦等（2012）研究表明，分離自桃小食心蟲幼蟲上的球孢白僵菌菌株TST05在15～35 ℃范圍內(nèi)均能生長和產(chǎn)孢，在20～30 ℃范圍內(nèi)菌落直徑和產(chǎn)孢量相對較高。不同的營養(yǎng)條件也會(huì)影響球孢白僵菌菌絲生長及產(chǎn)孢水平，適宜的營養(yǎng)能促進(jìn)菌絲快速生長及產(chǎn)孢，增強(qiáng)殺蟲活性（李農(nóng)昌等，1996；姚劍和黃大慶，2005）。球孢白僵菌菌株Bb13生長的最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為蛋白胨（程國華等，2006）；而球孢白僵菌HFW-05菌株生長的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為豆粕粉（陸晴等，2008）。齊永霞等（2011）研究表明，球孢白僵菌Bb06菌株對單糖、雙糖和多糖等多種碳營養(yǎng)及有機(jī)氮和無機(jī)氮等多種氮營養(yǎng)均能夠利用，但利用程度存在一定差異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】球孢白僵菌菌株的生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)與環(huán)境和營養(yǎng)條件有關(guān)，但不同菌株其生物學(xué)特性存在一定差異，因此很有必要對篩選到的馬尾松毛蟲高毒力球孢白僵菌菌株生物學(xué)特性進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以前期篩選到的馬尾松毛蟲高毒力球孢白僵菌菌株B-2、B-14和B-19為材料，研究不同溫度、碳源和氮源條件對球孢白僵菌菌株生長速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率的影響，旨在優(yōu)化球孢白僵菌的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)工藝，為利用球孢白僵菌防治馬尾松毛蟲提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

馬尾松毛蟲高毒力球孢白僵菌菌株B-2、B-14和B-19由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物真菌病害實(shí)驗(yàn)室篩選獲得（王義勛等，2016）。菌株寄主及地理來源信息詳見表1。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 不同溫度對球孢白僵菌高毒力菌株生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響 在培養(yǎng)3 d且生長一致的菌落邊緣打取直徑5 mm的菌絲塊接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，分別置于17、20、23、26、29和32 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復(fù)3皿，光照條件設(shè)為12 h光照/12 h黑暗。采用十字交叉法測量菌落直徑，每隔2 d測量一次，直到第10 d，計(jì)算菌株生長速率（mm/d）。

打取直徑5 mm的菌絲塊接種于PDA培養(yǎng)基上，在不同溫度條件下培養(yǎng)10 d的菌落中心打取一塊直徑5 mm的菌絲塊，放入裝有50 mL無菌水的小燒杯中，用磁力攪拌器攪拌15 min，使孢子充分分散，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算產(chǎn)孢量（個(gè)/mL）。

各菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，分別用無菌水收集孢子，制成孢子懸浮液（每視野約100個(gè)孢子），將孢子懸浮液滴在無菌載玻片上，放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于不同溫度下培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。24 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù)并計(jì)算孢子萌發(fā)率（%）；每個(gè)重復(fù)至少鏡檢50個(gè)孢子。

1. 2. 2 不同碳源對球孢白僵菌高毒力菌株生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響 以查比克培養(yǎng)基（0.50 g KCl，30.00 g蔗糖， 0.50 g MgSO4， 2.00 g KNO3， 0.01 g FeSO4， 1.00 g KH2PO4，2%瓊脂粉，蒸餾水1000 mL）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（方中達(dá)，2007），分別用等質(zhì)量碳元素的麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉代替蔗糖，接入直徑5 mm的菌絲塊，25 ℃條件下培養(yǎng)，參照1.2.1方法測量供試菌株的生長速率（mm/d）、產(chǎn)孢量（個(gè)/mL）和孢子萌發(fā)率（%）。

1. 2. 3 不同氮源對球孢白僵菌高毒力菌株生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響 以查比克培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等質(zhì)量氮元素的蛋白胨、牛肉膏、酵母浸出液代替硝酸鉀，接入直徑5 mm的菌絲塊，25 ℃條件下培養(yǎng)，參照1.2.1方法測量供試菌株的生長速率（mm/d）、產(chǎn)孢量（個(gè)/mL）和孢子萌發(fā)率（%）。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS v7.05對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用LSD法比較各處理的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同溫度對球孢白僵菌菌株生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響

3株供試球孢白僵菌菌株在6個(gè)溫度梯度下均能生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)，但不同溫度或菌株間存在一定差異（表2）。在17～26 ℃下，供試菌株的生長速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率均隨著溫度的升高而升高；在26 ℃下各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)均達(dá)最高值；隨著溫度的繼續(xù)升高，各項(xiàng)指標(biāo)均有所下降?？傮w來說，26～29 ℃最適于球孢白僵菌的生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)，溫度過高或過低均不利于球孢白僵菌的生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)。

在26 ℃下比較3株球孢白僵菌菌株的生長速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率，發(fā)現(xiàn)以B-2菌株的生長速率最高，為3.77 mm/d，顯著高于其他2株菌株（P<0.05，下同）；B-14菌株的產(chǎn)孢量最高，為16.33×104個(gè)/mL，顯著高于B-2菌株，但與B-19菌株差異不顯著（P>0.05，下同）；3株供試菌株（B-2、B-14和B-19）的孢子萌發(fā)率無顯著差異，分別為92.67%、95.88%和99.67%。

2. 2 不同碳源對球孢白僵菌菌株生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響

3株供試菌株在不同碳源培養(yǎng)基上的生長速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率存在一定差異（表3）?？傮w而言，葡萄糖作為碳源時(shí)，供試3株菌株生長速率最快、產(chǎn)孢量最大、孢子萌發(fā)率也最高，其中B-14菌株的生長速率最高，顯著高于B-2菌株，但與B-19菌株無顯著差異；B-2菌株的孢子萌發(fā)率最高，為44.45%，顯著高于其他2株菌株；3株菌株（B-2、B-14和B-19）的產(chǎn)孢量無顯著差異，分別為1.33×104、1.00×104和1.33×104個(gè)/mL。

2. 3 不同氮源對球孢白僵菌菌株生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響

3株供試菌株在不同氮源培養(yǎng)基上的生長速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率存在一定差異（表4）?？傮w來說，以蛋白胨作為氮源時(shí)，供試菌株的生長速率均達(dá)最高值，其中B-14菌株生長速率最高，為4.81 mm/d，顯著高于B-19菌株，但與B-2菌株無顯著差異。酵母浸出液作為氮源時(shí)，供試菌株產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均達(dá)最高值，其中B-19菌株的產(chǎn)孢量最高，為51.33×104個(gè)/mL，顯著高于其他2株菌株； B-19和B-2菌株的孢子萌發(fā)率最高，均為100.00%，顯著高于B-14菌株。可見，3株供試菌株在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上生長較好，以酵母浸出液為氮源最有利于供試球孢白僵菌菌株的產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)。

3 討論

不同溫度條件下球孢白僵菌的營養(yǎng)生長和產(chǎn)孢能力有所不同（徐艷聆等，2009）。本研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌高毒力菌株（B-2、B-14和B-19）的最適生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)溫度均為26 ℃，與前人研究結(jié)果（鄺灼彬等，2005）一致；不同的是B-2、B-14和B-19菌株在32 ℃時(shí)仍能正常生長，可能是不同地理來源菌株對溫度的適應(yīng)能力存在差異；本研究中3株高毒力球孢白僵菌菌株對高溫適應(yīng)能力較強(qiáng)，更有利于保證菌劑在林間的穩(wěn)定性。綜合前人研究結(jié)果及本研究結(jié)果可知，溫度過高或過低均不利于菌株的生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)，因此，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)注意施用地溫度，盡量選擇在合適的季節(jié)施用，從而保證菌株活性及防治效果。

除溫度條件影響外，營養(yǎng)成分也是影響白僵菌菌株生長的重要因素之一（唐曉慶等，1996；James，2001；齊永霞等，2011）。球孢白僵菌對單糖、雙糖和多糖等碳營養(yǎng)及有機(jī)氮、無機(jī)氮等氮營養(yǎng)均能夠利用，但不同菌株間的利用程度存在一定差異（齊永霞，2011）。程國華等（2006）研究表明，球孢白僵菌菌株Bb13生長的最佳碳、氮源分別為葡萄糖和蛋白胨；陸晴等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌菌株HFW-05生長的最佳碳、氮源分別為蔗糖和豆粕粉。本研究供試碳源中以單糖葡萄糖最適合球孢白僵菌菌株生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)，可能是單糖相對于雙糖和多糖更有利于球孢白僵菌吸收；本研究選用的氮源均為有機(jī)態(tài)氮，但球孢白僵菌在菌絲生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)等不同生長發(fā)育階段所需的最優(yōu)氮源存在差異，可能與不同的信號通路和代謝途徑相關(guān)。

此外，球孢白僵菌菌種在繼代培養(yǎng)時(shí)常表現(xiàn)出產(chǎn)孢量降低、致病力減退等現(xiàn)象（唐曉慶等，1996）。對球孢白僵菌高毒力菌株B-2、B-14和B-19的毒力穩(wěn)定性及遺傳穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜合3株球孢白僵菌高毒力菌株在生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)率方面的生物學(xué)性狀，B-2菌株可優(yōu)先選作球孢白僵菌工業(yè)化生產(chǎn)菌種；在26 ℃下選擇葡萄糖和酵母浸出液為碳氮源可提高菌劑的生產(chǎn)效率。

參考文獻(xiàn)：

陳順立，林慶源，黃金聰. 2004. 南方主要樹種害蟲綜合管理[M]. 廈門：廈門大學(xué)出版社：113-119. [Chen S L， Lin Q Y， Huang J C. 2004. Integrated Pest Management for Maojor Trees in Southern China[M]. Xiamen： Xiamen University Press： 113-119.]

程國華，舒靜，丁克堅(jiān). 2006. 球孢白僵菌營養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，22（5）：365-368. [Cheng G H， Shu J， Ding K J. 2006. Study on nutrition demand and culture condition of Beauveria bassiana[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，22（5）： 365-368.]

方中達(dá). 2007. 植病研究法[M]. 第3版北京：中國農(nóng)業(yè)出版社：50. [Fang Z D. 2007. Research Methods of Plant Patho-

logy[M]. The 3rd Edition Beijing： China Agriculture Press： 50.]

鄺灼彬，呂利華，馮夏，陳煥瑜，武亞敬，何余容. 2005. 溫度及常見農(nóng)藥對球孢白僵菌生物學(xué)特性的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，26（3）：26-29. [Kuang Z B， Lü L H， Feng X， Chen H Y， Wu Y J， He Y R. 2005. Effect of temperatures and chemical pesticides on the biological characteristics of Beauveria bassiana[J]. Journal of South China Agricultural University， 26（3）： 26-29.]

李農(nóng)昌，樊美珍，李春如，李華，高智輝，朱潤德. 1996. 白僵菌有關(guān)培養(yǎng)條件及其與毒力關(guān)系的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，23（3）：254-259. [Li N C，F(xiàn)an M Z，Li C R，Li H，Gao Z H，Zhu R D. 1996. Relationship between culture conditions and virulence of Beauveria bassiana[J]. Journal of Anhui Agricultural University， 23（3）： 254-259.]

陸晴，曹偉平，董建臻，王金耀，馮書亮，王容燕，杜立新. 2008. 不同碳、氮營養(yǎng)對球孢白僵菌HFW-05的生長及胞外蛋白酶產(chǎn)量的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，23（5）：142-146. [Lu Q， Cao W P， Dong J Z， Wang J Y， Feng S L， Wang R Y， Du L X. 2008. Effects of different carbon and nitrogen sources on the growth and extracellular protease production of Beauveria bassiana HFW-05[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 23（5）： 142-146.]

齊永霞，陳方新，李增智. 2011. 不同碳、氮營養(yǎng)對球孢白僵菌生物學(xué)特性和抑菌活性的影響[J]. 激光生物學(xué)報(bào)，20（1）：38-44. [Qi Y X， Chen F X， Li Z Z. 2011. Effects of carbon sources and nitrogen sounces on the biological characteristics and antifungal activity of Beauveria bassiana[J]. Acta Laser Biological Sinica， 20（1）： 38-44.]

唐曉慶，樊美珍，李增智. 1996. 球孢白僵菌繼代培養(yǎng)中菌落局變現(xiàn)象及環(huán)境影響因素的研究[J]. 真菌學(xué)報(bào)，15（3）：188-196. [Tang X Q， Fan M Z， Li Z Z. 1996. Study on saltation of Beauveria bassiana，an important entomogenous fungus， subcultured in different conditions[J]. Mycosystema， 15（3）： 188-196.]

王成樹，王四寶，李增智. 1998. 球孢白僵菌高毒菌株篩選模型的研究[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，6（3）：245-249. [Wang C S， Wang S B， Li Z Z. 1998. Screening model for selec-

ting virulent strains of Beauveria bassiana[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 6（3）：245-249.]

王義勛，王星冉，陳京元，黃俊斌，鄭露. 2016. 馬尾松毛蟲高毒力白僵菌菌株篩選[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，47（5）：662-666. [Wang Y X， Wang X R， Chen J Y， Huang J B， Zheng L. 2016. Screening of highly virulent Beauveria bassiana Walker strains against Dendrolimus punctatus[J]. Journal of Southern Agriculture， 47（5）： 662-666.]

熊琦，朱永敏，曹天文，李捷，薛皎亮，謝映平，王全亮，杜仙當(dāng). 2012. 桃小食心蟲病原菌—球孢白僵菌TST05菌株生物學(xué)特性研究[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，38（2）：87-91. [Xiong Q， Zhu Y M， Cao T W， Li J， Xue J L， Xie Y P， Wang Q L， Du X D. 2012. Biological characteristics of the entomo-

pathogenic fungus of Carposina sasakii，Beauveria bassiana strain TST05[J]. Journal of Plant Protection，38（2）：87- 91.]

徐艷聆，呂文彥，趙潤洲，陳營. 2009. 環(huán)境對球孢白僵菌生物學(xué)特性的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，（8）：95-97. [Xu Y L， Lü W Y， Zhao R Z， Chen Y. 2009. Effects of environmental factors on the biological characteristics of Beauveria bassiana[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， （8）： 95-97.]

姚劍，黃大慶. 2005. 球孢白僵菌脂肪酸、酯酶、脂肪酶及其與毒力的關(guān)系[J]. 中國生物防治，21（3）：167-171. [Yao J， Huang D Q. 2005. The correlationship between fatty acid composition， ester and lipidase production and virulence of Beauveria bassiana against Dendrolimu spunctatus[J]. Chinese Journal of Biological Control， 21（3）： 167-171.]

Feng M G， Poprawski T J， Khachatourians G G. 1994. Production， formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control： Current status [J]. Biocontrol Science and Technology，4（1）： 3-34.

James R R. 2001. Effects of exogenous nutrients on conidial germination and virulence against the silverleaf whitefly for two hyphomycetes[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 77（2）： 99-107.

（責(zé)任編輯 麻小燕）