雷超 鄭哲 李俊輝 王慶恒 黃榮蓮 鄧岳文

摘要：【目的】明確細(xì)胞內(nèi)視黃酸結(jié)合蛋白（CRABP）對(duì)馬氏珠母貝吸收代謝類胡蘿卜素的影響，為培育富含類胡蘿卜素的馬氏珠母貝養(yǎng)殖新品系打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎肦ACE克隆馬氏珠母貝CRABP基因（PmCRABP）cDNA全長(zhǎng)序列，并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分析PmCRABP基因在各組織中的表達(dá)特征及其在黃白閉殼肌中的表達(dá)量?！窘Y(jié)果】PmCRABP基因cDNA全長(zhǎng)1778 bp，開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)366 bp，編碼121個(gè)氨基酸，其5'非翻譯區(qū)（5'UTR）長(zhǎng)125 bp，3'UTR長(zhǎng)1287 bp。PmCRABP的分子量13.51 kD，理論等電點(diǎn)（pI）5.68，脂溶性系數(shù)62.81，不穩(wěn)定指數(shù)35.38，總平均親水性-0.517，其第5～120個(gè)氨基酸為L(zhǎng)ipocalin家族的結(jié)構(gòu)域。PmCRABP氨基酸序列與新對(duì)蝦（Metapenaeus ensis）CRABP氨基酸序列的相似度最高，同屬于CRABP蛋白，且二者的空間結(jié)構(gòu)極其相似。PmCRABP基因在馬氏珠母貝肝胰腺中的表達(dá)量最高，其后依次是外套膜、鰓和閉殼肌，各組織的表達(dá)量差異顯著（P<0.05，下同）。黃白閉殼肌個(gè)體的類胡蘿卜素含量與PmCRABP基因相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異，且二者間呈明顯的正相關(guān)?！窘Y(jié)論】PmCRABP參與了馬氏珠母貝的類胡蘿卜素代謝。

關(guān)鍵詞： 馬氏珠母貝；細(xì)胞內(nèi)視黃酸結(jié)合蛋白（CRABP）；類胡蘿卜素；克?。槐磉_(dá)

中圖分類號(hào)： S968.316.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）06-1086-07

Abstract：【Objective】Effects of intracellular retinoic acid-binding protein（CRABP） on absorption and metabolism of carotenoid in Pinctada fucata martensii were investigated to lay a foundation for breeding carotenoid-rich strains. 【Method】In this study， cDNA full length sequence of PmCRABP was obtained using RACE technology. Expression cha-

racters of PmCRABP gene in different tissues and its expression in white and yellow colored adductor muscle were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The full length of PmCRABP gene was 1778 bp， including 366 bp of open reading frame（ORF）， encoded 121 amino acids， a 5'untranslated region（5'UTR） of 125 bp and a 3'UTR of 1287 bp. The molecular weight was 13.51 kD， theoretical isoelectric point（pI） was 5.68， aliphatic index was 62.81 ，instability index was 35.38 and the grand average of hydropathicity（GRAVY） was -0.517. The 5th to the 120th amino acids of the PmCRABP protein were the domains of Lipocalin family. Comparative analysis between amino acid sequence of PmCRABP and that of CRABP of other species indicated that， the similarity between PmCRABP and Metapenaeus ensis CRABP was the highest. Expression of PmCRABP gene in hepatopancreas of P. fucata martensii was the highest， and followed by mantle， gill and adductor muscle. There was significant difference between expressions in different tissues（P<0.05，the same beow）. Carotenoid contents and PmCRABP gene expression in yellow and white adductor muscles were significantly different， and there was a significant positive correlation between carotenoid content and PmCRABP expression. 【Conclusion】The results showed that PmCRABP gene is involved in carotenoid metabolism of P. fucata martensii.

Key words： Pinctada fucata martensii； intracellular retinoic acid-binding protein（CRABP）； carotenoid； cloning； expression

0 引言

【研究意義】馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）是我國(guó)廣東、廣西和海南地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類，主要用于生產(chǎn)有核珍珠（王大鵬等，2011）。除了生產(chǎn)海水珍珠外，馬氏珠母貝還是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的貝類，富含?；撬?、無機(jī)鹽及微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其貝肉中的糖胺聚糖成分具有抑瘤、抗凝血等功效（郝瑞娟等，2015；陳雪欣等，2016），?；撬峋哂锌蛊凇⒁种蒲“迥?、降血壓血脂、降低膽固醇、保護(hù)視力及促進(jìn)大腦發(fā)育等生理功能（孔曉榮，1993）。因此，培育富含營(yíng)養(yǎng)成分的馬氏珠母貝養(yǎng)殖新品系，是促進(jìn)馬氏珠母貝養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的新路徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】視黃酸（Retinoic acid，RA）是維生素A的活性衍生物，屬于一種低分子量的脂溶性信號(hào)分子（Balling，1991）。RA對(duì)脊椎動(dòng)物的正常發(fā)育、組織細(xì)胞增生等起重要作用（黃蓓，1994；Sharma et al.，2003）。如RA會(huì)影響斑馬魚胚胎心臟房室分化（張立鳳等，2007），是受孕期間及整個(gè)妊娠過程中決定胚胎是否能良好發(fā)育的一個(gè)重要因素（李艷敏等，2014）。RA含有共軛雙鍵，極易被氧化劑氧化，必須在體內(nèi)與細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白（Cellular retinoic acid-binding protein，CRABP）結(jié)合以維持其穩(wěn)定性（齊焰和謝院生，2015），即CRABP參與RA代謝。依據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫分類，CRABP屬于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白超家族成員，該蛋白家族成員均包含6或8個(gè)β桶，作為三級(jí)結(jié)構(gòu)和高度保守結(jié)構(gòu)域的一部分（Zhang et al.，2012），其主要功能是運(yùn)載類固醇、類胡蘿卜素、類維生素A及其他小疏水性分子（Yang et al.，2011）。CRABP可分為CRABP1和CRABP2，其中，CRABP1能增強(qiáng)P450氧化酶而抑制RA在細(xì)胞中的功能作用，CRABP2則是將RA從細(xì)胞質(zhì)攜帶進(jìn)入細(xì)胞核的關(guān)鍵因子（楊芳，2011；李華等，2012）。目前，有關(guān)CRABP的研究主要集中在脊椎動(dòng)物上，Lee等（2006）對(duì)豬的CRABP1基因進(jìn)行了定位，楊艷萍等（2013）研究了小鼠胚胎CRABP1陽性神經(jīng)嵴細(xì)胞的時(shí)空分布與功能?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】明確CRABP在貝類胡蘿卜素代謝中的作用，可為培育富含類胡蘿卜素的貝類新品系打下基礎(chǔ)，但至今有關(guān)CRABP在貝類上的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用RACE克隆馬氏珠母貝CRABP基因（PmCRABP）的cDNA全長(zhǎng)序列，分析PmCRABP基因在各組織中的表達(dá)特征及其在黃白閉殼肌中的表達(dá)量，明確PmCRABP對(duì)馬氏珠母貝吸收代謝類胡蘿卜素的影響，為培育富含類胡蘿卜素的養(yǎng)殖新品系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試馬氏珠母貝來源于基礎(chǔ)群體，均為2齡貝，養(yǎng)殖在廣東湛江市徐聞縣大井村海區(qū)，選取規(guī)格較一致（38.01±4.13 g）的個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。剪取其外套膜、肝胰腺、閉殼肌和鰓用于基因克隆與組織定量表達(dá)分析；同時(shí)選取黃色與白色閉殼肌個(gè)體，取閉殼肌用于類胡蘿卜素含量與基因表達(dá)量分析。采集的樣品均置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩？俁NA提取試劑Trizol購自美國(guó)Invitrogen公司，pMD19-T載體、DNA Marker、LA Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，RACE試劑盒購自Clontech公司。

1. 2 PmCRABP基因全長(zhǎng)cDNA克隆及序列分析

1. 2. 1 總RNA提取及第一鏈cDNA合成 采用Trizol提取不同組織和黃白閉殼肌的總RNA，以10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性、SimpliNano核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)RNA濃度及純度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成中間片段cDNA模板，5'RACE和3'RACE模板的制備參照RACE試劑盒說明。

1. 2. 2 引物設(shè)計(jì)與合成 從本課題組已建立的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出與PmCRABP基因相似度較高的unigene片段，并以Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。

1. 2. 3 PmCRABP基因片段克隆 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照LA Taq DNA聚合酶說明進(jìn)行操作，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為目的條帶后，純化并連接至pMD19-T載體，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，菌液培養(yǎng)1 h后涂布于含Amp+的固體培養(yǎng)基上37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，并將目的基因送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。同時(shí)，采用巢式PCR對(duì)PmCRABP基因的3'端和5'端進(jìn)行RACE擴(kuò)增。

1. 2. 4 序列分析 利用DNAMAN將測(cè)序片段進(jìn)行拼接，以獲得PmCRABP基因cDNA全長(zhǎng)。同時(shí)，采用NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BLAST程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)和相似性分析，采用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）對(duì)PmCRABP基因進(jìn)行開放閱讀框（ORF）和蛋白序列預(yù)測(cè)，采用DNAMAN中的Phylogenetic tree構(gòu)建基于CRABP的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，采用MUSCLE（http：//

www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）對(duì)PmCRABP氨基酸序列與其他物種CRABP氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，使用SMART程序預(yù)測(cè)分析PmCRABP蛋白結(jié)構(gòu)域，分別以ExPASy（http：//web. expasy.org/ vg/index/

protein）和SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/

Signal/）對(duì)其氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析和信號(hào)肽預(yù)測(cè)，采用TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)PmCRABP蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，采用Motif Scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）對(duì)PmCRABP蛋白進(jìn)行功能位點(diǎn)檢測(cè)，并以SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.

fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)PmCRABP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、SWISS-MODEL（http：//

swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)PmCRABP蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1. 3 黃白閉殼肌類胡蘿卜素的提取與測(cè)定

參考吳小芬等（2016）的方法進(jìn)行黃白閉殼肌類胡蘿卜素含量測(cè)定分析，即分別準(zhǔn)確稱量黃白閉殼肌0.1 g，加入等量無水硫酸鈉和5 mL丙酮（分析純）充分勻漿，另加入5 mL丙酮潤(rùn)洗勻漿器2次，然后一并轉(zhuǎn)入10 mL的具塞試管中，用錫紙避光密封，4 ℃下保存3 d后4000 r/min離心10 min，取上清液，以紫外分光光度計(jì)在480 nm 處測(cè)定吸光值。

總類胡蘿卜素含量（μg/g）= A×K×V/E×G

式中，A為吸光值，K為常數(shù)（104），V為提取液體積（mL），E為摩爾消光系數(shù)（2500），G為樣品質(zhì)量（g）。

1. 4 不同組織中的PmCRABP基因差異表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)馬氏珠母貝鰓、外套膜、閉殼肌、肝胰腺和黃白閉殼肌的PmCRABP基因表達(dá)情況，通過2-ΔΔCt計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量，并以SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PmCRABP基因的克隆與序列分析結(jié)果

通過RACE擴(kuò)增分別獲得PmCRABP基因的5'非翻譯區(qū)（5'UTR）和3'UTR，其中，5'UTR長(zhǎng)125 bp，3'UTR長(zhǎng)1287 bp。利用DNAMAN將測(cè)序片段進(jìn)行拼接后，得到PmCRABP基因cDNA全長(zhǎng)1778 bp，其開放閱讀框（ORF）366 bp，編碼121個(gè)氨基酸（圖1）。

2. 2 PmCRABP的理化性質(zhì)分析結(jié)果

經(jīng)相關(guān)在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PmCRABP的分子量13.51 kD，理論等電點(diǎn)（pI）5.68，脂溶性系數(shù)62.81，不穩(wěn)定指數(shù)35.38，屬于穩(wěn)定蛋白（圖2）；總平均親水性-0.517，屬于疏水性蛋白。SignalP4.1預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PmCRABP不含信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。經(jīng)SMART分析得知，PmCRABP的第5～120個(gè)氨基酸為L(zhǎng)ipocalin家族結(jié)構(gòu)域。PmCRABP功能位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白有1個(gè)cAMP和cGMP依賴性的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)、3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)胞質(zhì)脂肪酸結(jié)合蛋白信號(hào)位點(diǎn)。

2. 3 PmCRABP與其他物種的同源性比對(duì)分析結(jié)果

利用DNAMAN中的Phylogenetic tree對(duì)不同物種的視黃醇類蛋白（表1）進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，CRABP蛋白、CRBP蛋白和RBP蛋白各自分開形成一簇（圖3）。其中，馬氏珠母貝與新對(duì)蝦聚在同一亞支上，同屬于CRABP蛋白，說明它們起源于同一祖先的基因復(fù)制。

采用MUSCLE對(duì)小家鼠（M. domesticus，CAA-

36011.1）、新對(duì)蝦（M. ensis，AAL68638.1）、煙草天蛾（M. sexta，AAC24317.1）、家蠶（B. mori，NP_0010373-

64.1）和PmCRABP氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果（圖4）表明，PmCRABP與小家鼠、煙草天蛾和家蠶的CRABP氨基酸序列同源性不高，但與新對(duì)蝦的同源性較高。

SOPMA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，PmCRABP的α螺旋占22.31%、β轉(zhuǎn)角占14.88%、無規(guī)則卷曲占30.58%、延伸鏈占32.23%。利用SWISS-MODEL對(duì)PmCRABP和新對(duì)蝦CRABP蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的空間結(jié)構(gòu)極其相似（圖5）。以TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)PmCRABP的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示PmCRABP無跨膜結(jié)構(gòu)，即符合PmCRABP為胞內(nèi)蛋白的特點(diǎn)。

2. 4 黃白閉殼肌個(gè)體的總類胡蘿卜素含量及PmCRABP基因表達(dá)量

采用丙酮萃取法對(duì)馬氏珠母貝的黃白閉殼肌進(jìn)行總類胡蘿卜素提取，并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PmCRABP基因在黃白閉殼肌中的表達(dá)量。結(jié)果表明，黃色閉殼肌中的總類胡蘿卜素含量（圖6）及PmCRABP基因表達(dá)量（圖7）均顯著高于白色閉殼肌（P<0.05，下同），且總類胡蘿卜素含量與PmCRABP基因表達(dá)量呈明顯的正相關(guān)。

2. 5 Pm-CRABP基因的組織表達(dá)差異分析結(jié)果

以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)馬氏珠母貝鰓部、外套膜、閉殼肌、肝胰臟PmCRABP基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，PmCRABP基因在以上組織均有表達(dá)，且在肝胰臟的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織（圖8）。

3 討論

本研究利用RACE克隆獲得PmCRABP基因序列，其cDNA全長(zhǎng)1778 bp，共編碼121個(gè)氨基酸。經(jīng)NCBI中的BLAST分析，發(fā)現(xiàn)PmCRABP含有Lipocalin結(jié)構(gòu)域，即屬于Lipocalin超家族。PmCRABP是一種低分子量的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白，在體內(nèi)負(fù)責(zé)結(jié)合視黃酸和其他相關(guān)脂肪酸（Gu et al.，2002）。經(jīng)相關(guān)在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PmCRABP的分子量13.51 kD，符合該類蛋白分子量低的特點(diǎn)。在動(dòng)物體內(nèi)，RA是維生素A最終的活性代謝產(chǎn)物（齊焰和謝院生，2015），而維生素A是一種動(dòng)物機(jī)體必需的脂溶性維生素，機(jī)體無法自行合成而必須從食物中獲取，其主要來源為植物中的類胡蘿卜素和動(dòng)物中的視黃酯（李艷敏等，2014）。自然界中存在600多種類胡蘿卜素，其中約50種具有活性，以β-胡蘿卜素活性最高（王二玲，2009）。被動(dòng)物攝取的β-胡蘿卜素在腸道內(nèi)經(jīng)β-胡蘿卜素-15，15'-加氧酶（βCMOOX）氧化生成2個(gè)分子的視黃醇（維生素A），接著被吸收入體內(nèi)氧化成視黃醛，再進(jìn)一步被氧化成RA（Mezaki et al.，2012）。王二玲（2009）研究發(fā)現(xiàn)，全反式視黃酸能顯著降低肉仔雞十二指腸、空腸和腎臟內(nèi)的βCMOOX活性，且抑制作用與其濃度（0～4 μmol/L）呈正比。由此推測(cè)，在馬氏珠母貝體內(nèi)PmCRABP是通過結(jié)合RA來參與類胡蘿卜素代謝。

RA的生物轉(zhuǎn)化過程在CRABP、視黃醇結(jié)合蛋白（RBR）和細(xì)胞內(nèi)視黃醇結(jié)合蛋白（CRBP）的協(xié)助下依次在小腸、肝臟和目標(biāo)細(xì)胞中完成（Das et al.，2014）。為比較PmCRABP基因在馬氏珠母貝不同組織中的表達(dá)量，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)馬氏珠母貝閉殼肌、鰓、肝胰臟和外套膜4個(gè)組織中的PmCRABP基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在肝胰腺的相對(duì)表達(dá)量最高，但具體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制有待進(jìn)一步探究。CRABP作為結(jié)合RA的特定蛋白，主要存在于RA含量較高的組織中（Balling，1991），而RA對(duì)β-胡蘿卜素又有反饋調(diào)控作用（王二玲，2009）。本研究也發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)群體黃白閉殼肌個(gè)體的總類胡蘿卜素含量存在顯著差異，對(duì)應(yīng)的PmCRABP基因表達(dá)量也存在顯著差異，且總類胡蘿卜素含量與PmCRABP基因表達(dá)量呈明顯的正相關(guān)，進(jìn)一步說明PmCRABP是通過結(jié)合RA來參與類胡蘿卜素代謝。

4 結(jié)論

馬氏珠母貝黃白閉殼肌個(gè)體的總類胡蘿卜素含量和PmCRABP基因相對(duì)表達(dá)量均存在顯著差異，且二者間呈明顯的正相關(guān)，說明PmCRABP參與了馬氏珠母貝的類胡蘿卜素代謝。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）