劉淑文, 丁家旺, 秦 偉

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海水中致病菌檢測研究進展

劉淑文1, 2, 丁家旺1, 秦 偉1

(1. 中國科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點實驗室(煙臺海岸帶研究所), 山東省海岸帶環(huán)境過程重點實驗室, 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所, 山東煙臺 264003; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

海水中致病菌種類繁多、致病性強, 對水產(chǎn)養(yǎng)殖和人體健康存在著潛在危害。傳統(tǒng)的檢測方法培養(yǎng)過程復(fù)雜繁瑣、耗時長、效率低, 難以滿足實際工作的需求。因此, 建立海水中致病菌的快速、靈敏、準確的檢測技術(shù)勢在必行。本文綜述了流式細胞技術(shù)、分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法和生物傳感器技術(shù)等在海水致病菌檢測中的應(yīng)用, 總結(jié)了上述方法在海水致病菌檢測中的研究現(xiàn)狀。

海水致病菌; 檢測; 流式細胞技術(shù); 分子生物學(xué)方法; 免疫學(xué)方法; 生物傳感器技術(shù)

隨著我國沿海經(jīng)濟建設(shè)速度的逐步加快和海洋開發(fā)活動的日益頻繁, 排往近海的污染物總量持續(xù)增加, 海水環(huán)境污染尤其河口海岸帶環(huán)境污染問題日漸凸顯。在種類繁多的海水環(huán)境污染物中, 致病菌正引起人們越來越多的關(guān)注。海水中的致病菌有來自陸源, 亦有來自海洋自身。陸源的致病菌主要來自生活污水、大陸徑流以及海岸沙灘的流入[1]。大腸桿菌是水質(zhì)糞便污染的指示菌, 是海水陸源污染的重要生物之一[2]。目前, 世界大部分國家及國際組織將大腸桿菌數(shù)量作為海水水質(zhì)的衛(wèi)生學(xué)指標和水環(huán)境的細菌學(xué)指標[3]。已有研究表明, 具有凈化病原菌能力的繁茂膜海綿(), 能夠以攝食的方式凈化水環(huán)境中的大腸桿菌[4]。除陸源致病菌外, 自然海水中含有喜好生長于有機質(zhì)豐富環(huán)境中的副溶血性弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌等致病菌。這些致病菌在海水中的數(shù)量可以有效指示海水遭受有機物污染的程度[5]。研究表明, 海水中致病菌的污染不僅威脅人體的健康安全, 而且會對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的危害和損失[6]。因此, 實現(xiàn)海水致病菌的快速檢測, 不僅可以有效掌握環(huán)境污染物的時空分布特點、追蹤污染途徑、尋找污染源、預(yù)測污染的發(fā)展動向及環(huán)境質(zhì)量變化趨勢, 而且可以為改善海域生態(tài)質(zhì)量、促進海水資源的合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 海水中致病菌的檢測方法

由于海水組分復(fù)雜、基體效應(yīng)大、海水中致病菌的含量低, 且易隨海流變化, 因而要求分析方法具有良好的選擇性、高靈敏度及快速檢測過程。傳統(tǒng)的檢測方法培養(yǎng)過程復(fù)雜繁瑣、耗時長、效率低, 難以滿足實際工作的需求。因此, 研究者不斷探索新的檢測方法。本文從流式細胞技術(shù)、分子生物學(xué)方法、基因芯片技術(shù)、免疫學(xué)方法和生物傳感器技術(shù)等方面綜述了海水致病菌檢測的研究進展。

1.1 流式細胞技術(shù)(flow cytometry, FCM)

流式細胞分析具有快速、靈敏、精確以及便于操作等優(yōu)點, 已在微生物檢測方面發(fā)揮越來越重要的作用。流式細胞儀能夠檢測被熒光分子標記的細胞或微粒[7]。鄧燈等[8]建立了一種特異性好、精密度高的魚腸道弧菌單克隆抗體的流式細胞檢測技術(shù)。以抗魚腸道弧菌單克隆抗體為基礎(chǔ), 結(jié)合流式細胞術(shù), 根據(jù)熒光信號強弱比例確定檢測魚腸道弧菌時所需單克隆抗體。在最優(yōu)反應(yīng)條件下, 抗魚腸道弧菌單克隆抗體可特異性識別魚腸道弧菌, 并且通過對不同密度的魚腸道弧菌進行重復(fù)性試驗發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)均在5%以內(nèi)。流式細胞技術(shù)與分子生物學(xué)等技術(shù)的結(jié)合已成為流式細胞儀的發(fā)展方向, 并且能夠穩(wěn)定而全面地檢測細菌種類[9]。Joachimsthal等[10]利用流式細胞術(shù)與熒光原位雜交技術(shù)結(jié)合, 實現(xiàn)對輪船壓艙水中的各種細菌含量及總量進行檢測, 結(jié)果表明, 壓艙水中細菌總量達到0.67%~39.55%, 其中腸道菌、弧菌以及大腸桿菌的含量分別為0~2.46%、0.18%~35.82%和0~2.46%。在墨西哥北部灣的浮游細菌種類調(diào)查的項目中, Jochem等[11]同樣將兩種技術(shù)相結(jié)合, 從而準確鑒定出海洋細菌的種類, 并對細菌生物量進行了統(tǒng)計, 分析了墨西哥北部灣海域浮游細菌的時空變化。

流式細胞術(shù)在微生物方面的應(yīng)用發(fā)展相對較晚, 但是很適合對大數(shù)量的細菌進行逐個的快速多參數(shù)精確測量。需要指出的是, 流式細胞儀的前期成本比較高, 其應(yīng)用前景對熒光材料的選擇和樣品處理的發(fā)展提出了挑戰(zhàn)[12-13]。

1.2 分子生物學(xué)方法

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展, 分子生物學(xué)方法以其簡單、快速、專一、微量、準確等優(yōu)點在快速檢測病原微生物方面得到了迅速發(fā)展。目前海水致病菌檢測常用的分子生物學(xué)方法主要包括聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)和基因芯片技術(shù)等。

1.2.1 聚合酶鏈式反應(yīng)

聚合酶鏈式反應(yīng)是最常用的核酸擴增技術(shù), 具有特異性、高效性和準確性高三大特點, 已廣泛應(yīng)用于微生物病原菌的檢測[14-17]。目前, 常用的PCR技術(shù)包括多重PCR (multiplex PCR), 實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)和反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 如表1所示。

1.2.1.1 多重PCR

多重PCR可通過擴增多個核酸片段, 從而實現(xiàn)對多種致病菌的同時檢測。Kong等[18]采用多重PCR實現(xiàn)了對海水中6種不同致病菌的準確、快速、同時檢測。該檢測技術(shù)的最低檢測限度可達1 CFU/mL。為了進一步提高靈敏度, Gonzalez等[19]將多重PCR和DNA微陣列結(jié)合, 實現(xiàn)了對海水魚類5種致病菌的飛克級檢測。嵌套式PCR可解決PCR中由于模板量低而檢測不到譜帶所導(dǎo)致的靈敏度低的問題。Calvo等[20]提出的多重PCR與高準確度嵌套式PCR結(jié)合技術(shù)實現(xiàn)了對水體中5種致病菌的同時檢測。但在實驗過程中應(yīng)展開陰性對照, 從而減少假陽性樣品的干擾。

1.2.1.2 實時熒光定量PCR

熒光定量PCR是近年發(fā)展起來的一項新技術(shù)。該技術(shù)巧妙地利用了PCR技術(shù)核酸擴增的高效性、探針技術(shù)的高特異性、光譜技術(shù)的高敏感性以及計量高準確性等優(yōu)點, 在致病菌的檢測中有較好的應(yīng)用前景。Fykse等[21]在7 h內(nèi)準確靈敏地檢測到壓艙水中100 CFU/mL的霍亂弧菌。由于標記有l(wèi)uxS基因的定量實時PCR對粘質(zhì)沙雷氏菌具有特異性作用, 因此這一檢測技術(shù)可靈敏、快速地檢測到環(huán)境水樣中的沙雷氏菌[22]。同時, 實時熒光定量PCR還可量化被動物糞便污染的海水沉積物中的細菌[23], 定量檢測水體中靶基因的復(fù)制份數(shù)和RNA的復(fù)制份數(shù)等[24]。但由于熒光素種類、檢測光源的局限性以及其較高的成本, 實時熒光定量PCR復(fù)合式檢測的廣泛應(yīng)用受到限制。

1.2.1.3 反轉(zhuǎn)錄PCR

當樣品中存在無致病性的死細胞或者游離的DNA時, 致病菌DNA的檢測中會產(chǎn)生假陽性信號。因此上述PCR法很可能會夸大檢測結(jié)果。李善志等[25]以mRNA為檢測模板, 針對單增李斯特菌的溶血素基因hlyA設(shè)計引物, 以此建立起靈敏的活菌檢測RT - PCR技術(shù), 并對冷凍蝦仁等人工污染樣品中單增李斯特活菌進行檢測, 最低檢測限可達4.5 CFU/mL。

由于面臨低溫, 營養(yǎng)被剝奪等因素, 海水中的致病菌進入一種活的非可培養(yǎng)(viable but non-culturable,VBNC)的狀態(tài), 這種狀態(tài)下的致病菌在一定條件下可以復(fù)蘇并仍有致病能力, 依然會對人體健康潛在危害[26-27]。傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法不能檢測VBNC狀態(tài)下的細菌細胞, 因而可能低估其潛在的致病性。而PCR法由于擴增了游離的DNA或者死細胞中的DNA, 從而夸大了其致病能力。RT-PCR廣泛應(yīng)用于VBNC 狀態(tài)下致病菌致病能力的檢測。半巢式反轉(zhuǎn)錄PCR的應(yīng)用能準確靈敏地檢測人工海水中VBNC狀態(tài)的創(chuàng)傷弧菌, 并能夠?qū)ζ渲虏∧芰M行驗證[28]。除了致病菌的檢測, RT-PCR與Taqman探針技術(shù)的結(jié)合還能夠定量檢測海水中的腸道病毒[29]。

PCR 由于其高度的敏感性及特異性等優(yōu)勢在海水致病菌檢測中得以廣泛應(yīng)用。多重PCR技術(shù)能夠同時檢測多種致病菌, 簡便、高效、快速, 而且還可減少或避免因操作步驟過多而污染所帶來的假陽性等問題。但是多重PCR技術(shù)的體系比較復(fù)雜, 可以通過優(yōu)化設(shè)計引物與PCR反應(yīng)條件等手段來進一步增強特異性, 提高靈敏度。實時熒光定量PCR將DNA擴增與分子雜交同步進行, 由于在封閉體系內(nèi)擴增與檢測, 既省去了凝膠電泳的繁瑣操作, 縮短了檢測時間, 又避免了試驗過程中污染, 減少了假陽性的發(fā)生率, 具有特異性強、靈敏度高、準確度高、操作自動化等優(yōu)點。但是該技術(shù)需要昂貴的儀器, 成本高。反轉(zhuǎn)錄PCR雖然可以檢測到VBNC狀態(tài)下致病菌, 但是操作繁瑣, 提取過程中的RNA極易受到RNA酶的污染而降解, 其純度和完整性難以得到保證。

PCR檢測病原微生物雖然快速, 但可能因為擴增模板量太低而檢測不到譜帶。而且PCR產(chǎn)物需要用酶切或分子雜交驗證, 在對野外環(huán)境的水樣、海產(chǎn)品標本進行檢測時, 通常由于菌量少、菌株變異大, 而使得檢出率較低[30]。PCR檢測技術(shù)仍存在成本高、效率低、質(zhì)控差等缺陷, 未來應(yīng)向高靈敏度、高特異性、高通量、高重復(fù)性、簡易、經(jīng)濟方向發(fā)展。以適應(yīng)致病菌對檢測技術(shù)的要求[31]。

1.2.2 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)具有微型化、高通量、平行化、自動化等優(yōu)勢。目前, 許多學(xué)者將基因芯片技術(shù)應(yīng)用到對致病菌的快速檢測與鑒定中。戈蕾[32]采用基因芯片技術(shù)成功檢測到6種主要的海水魚類病原弧菌。為了提高菌種鑒定準確率, 需借助16S rDNA進行測序分析, 例如致病菌哈氏弧菌[33]以及海洋細菌C-5[34]的鑒定。利用細菌分類學(xué)上具有重要意義的16S rDNA基因作為檢測的靶分子, 并在其間設(shè)計檢測探針, 可建立一套致病菌的基因芯片快速檢測技術(shù)。Barlaan等[35]在16S rDNA基因基礎(chǔ)上, 結(jié)合電化學(xué)微陣列芯片的使用, 實現(xiàn)了對海水中8種致病菌的檢測, 并且在單個基因芯片上就能夠?qū)崿F(xiàn)對90種致病菌的檢測(表1)。

表1 分子生物學(xué)方法檢測海水中致病菌

基因芯片技術(shù)作為生物芯片技術(shù)中發(fā)展最完備的一個分支, 理論上可以做到在一次實驗中檢測出所有的致病菌, 具有很好的靈敏度, 其在海水中致病菌的檢測方面也發(fā)揮越來越重要的作用。但在獲取大量準確的基因序列、簡化樣品制備和標記操作、增加信號檢測靈敏度以及降低成本等方面還需要進一步提高[36]。

1.3 免疫方法

免疫學(xué)技術(shù)是結(jié)合生物化學(xué)或者物理學(xué)方法建立的病原檢測技術(shù), 該技術(shù)簡化了病原微生物的鑒定步驟。其中以酶聯(lián)免疫、熒光免疫以及免疫磁珠為主的分析方法在微生物研究中被廣泛應(yīng)用。

1.3.1 酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)

酶聯(lián)免疫分析法是把酶的放大作用與免疫反應(yīng)特異性相結(jié)合的分析技術(shù), 是酶分析技術(shù)的經(jīng)典代表, 也是最常用的免疫技術(shù)之一。Zhong等[37]提出的以IgY為捕獲抗體, IgG檢測抗體構(gòu)成的夾心ELISA能夠?qū)崿F(xiàn)對副溶血性弧菌快速靈敏檢測, 其檢測限為2.5×104CFU/mL, 檢測時間為4 h。與以往的ELISA相比, 該方法在穩(wěn)定性和準確性上有較大的提高。利用ELISA技術(shù)亦可對海水樣品中所有的弧菌進行特異性的捕獲, Laczka等[38]在70 min內(nèi)實現(xiàn)對12種弧菌的快速、準確、靈敏檢測。

1.3.2 熒光免疫檢測技術(shù)(Immunofluorescence Assay, IA)

熒光免疫檢測技術(shù)可通過檢測熒光強度來直接檢測致病菌。Goel等[39]借助異硫氰酸熒光素(FITC)對霍亂弧菌O1外膜蛋白的多克隆抗體進行染色, 該方法能夠快速靈敏地特異性識別霍亂弧菌O1。除了對霍亂弧菌O1的熒光標記, Wang等[40]還對霍亂弧菌O139熒光標記, 采用熒光免疫檢測聚集物(immunofluorescent-aggregation, IFAG)方法對其進行檢測, 即使在干擾細菌的存在下, 該方法也能成功檢測到環(huán)境水樣中的霍亂弧菌O1和霍亂弧菌O139。

1.3.3 免疫磁珠技術(shù)(Immunomagnetic Beads Separation Techniques, IMBS)

免疫磁珠技術(shù)不僅具備了固相化試劑特有的優(yōu)點以及免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性, 還有高效、快速、可重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)點, 因此越來越廣泛地應(yīng)用于微生物學(xué)檢測。免疫磁珠技術(shù)檢測海水中鰻弧菌時, 由于磁珠的富集作用, 磁珠與菌液最佳反映時間縮短到20 min, 檢測敏感度高達到0.13 CFU/mL。該技術(shù)比常規(guī)分離培養(yǎng)方法高出近100倍[41]。李倩倩等[42]通過共價交聯(lián)法將三色量子點與抗沙門菌、抗志賀菌和抗金黃色葡萄球菌的特異性抗體偶聯(lián), 選用3種不同顏色、不同發(fā)射波長的量子點作標記, 經(jīng)免疫磁珠富集, 同一反應(yīng)體系中可實現(xiàn)3種菌同時檢測。

免疫分析中, 載體磁珠的應(yīng)用可代替常規(guī)的選擇性增菌培養(yǎng)過程, 特異地將目的微生物從樣品中快速地分離出來[43]。同樣, 磁珠載體也與PCR技術(shù)[44]、電化學(xué)技術(shù)[45]、流式細胞術(shù)[46]等結(jié)合使用, 可充分發(fā)揮二者優(yōu)勢, 大大提高分離效率和檢測極限。

免疫學(xué)方法的優(yōu)點是高效, 可在幾個小時內(nèi)出結(jié)果(表2), 不需復(fù)雜儀器, 所需設(shè)備簡單、易操作。但該方法在識別過程中容易受其他微生物共同抗原以及抗體與非抗原物質(zhì)之間的非特異性反應(yīng)的干擾, 易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此, 需要制備更高特異性的單克隆抗體或多克隆抗體。免疫磁珠分離技術(shù)在一定程度上可代替常規(guī)的選擇性增菌培養(yǎng)過程, 可特異有效地將目的微生物從樣品中快速的分離出來。但是免疫磁珠制備困難, 要獲得均勻性好、超順磁性、粒度適中、易于結(jié)合蛋白質(zhì)的磁珠難度大。此外, 一旦菌體發(fā)生變異, 該方法的檢測結(jié)果將可能會不準確[47]。

表2 免疫學(xué)方法檢測海水中致病菌

1.4 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器是以固定化生物活性物質(zhì)(酶、蛋白質(zhì)、微生物、DNA以及生物膜等)作為分子識別元件與適當?shù)奈锢砘蛘呋瘜W(xué)換能器有機結(jié)合而組成的一種先進分析檢測裝置。其工作原理為: 待測物質(zhì)經(jīng)擴散作用進入固定生物敏感膜層, 經(jīng)分子識別而發(fā)生生物學(xué)反應(yīng), 傳感器的敏感層與復(fù)雜樣品中的特定目標分析物之間如酶與底物、抗體與抗原、外凝集素與糖蛋白、核酸與其互補片段之間的識別反應(yīng)會產(chǎn)生一些物理信號如光、熱、聲、質(zhì)量、顏色、電化學(xué)等的變化, 經(jīng)特定儀器放大后加以顯示或記錄。產(chǎn)生的信息如光、熱、音等被相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)換器變?yōu)榭啥亢涂商幚淼碾娦盘? 再經(jīng)二次儀表放大并輸出, 以電極測定其電流值或電壓值, 從而換算出被測物質(zhì)的量或濃度。

生物傳感器(Biosensor) 具有分析速度快、專一性強、準確度高、成本低、可重復(fù)使用、易實現(xiàn)自動化等優(yōu)點。在致病菌的檢測應(yīng)用中, 根據(jù)生物傳感器選用的換能器工作原理可分為光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器、質(zhì)量傳感器等。

1.4.1 光學(xué)生物傳感器(Optical Sensor)

光學(xué)傳感器由于具有高選擇性和靈敏度而廣泛應(yīng)用于致病菌的檢測中。光學(xué)傳感器中以熒光傳感器和表面等離子體共振傳感器應(yīng)用較為廣泛。

1.4.1.1 表面等離子體共振傳感器(Surface Plasmon Resonance Biosensor, SPR)

SPR傳感技術(shù)具有實時快速、分析復(fù)雜體系的時間短, 靈敏度高, 無需標記樣品并能在混濁或不透明的樣品中進行檢測等優(yōu)點。因此, 近年來SPR傳感技術(shù)的開發(fā)研究工作得到了迅猛發(fā)展[48]。劉儒平等[49]建立了一種基于SPR技術(shù)的大腸桿菌特異性快速檢測方法。該方法利用一抗和二抗的質(zhì)量擴增效應(yīng)和生物素—親和素的多級放大效應(yīng), 實現(xiàn)了對低濃度大腸桿菌ATCC25922 的快速檢測。該方法操作快速、靈敏度高、特異性強, 在食品安全分析、環(huán)境污染檢驗等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。Yilmaz借助分子印跡技術(shù)合成的生物接受體固定在SPR生物傳感器上, 該方該方法簡單快速, 準確性較高, 但靈敏度需要提高[50]。Piliarik等借助DNA技術(shù)構(gòu)建的新型SPR生物傳感器, 能夠識別食源性致病菌特定DNA或RNA的核酸片段, 進行高通量、靈敏、快速檢測, 該方法可在15 min內(nèi)實現(xiàn)對核酸100 pM級的檢測[51]。但SPR難以區(qū)分非目標致病菌, 存在非特異性吸附, 對溫度、樣品組成等干擾因素敏感的問題。

1.4.1.2 熒光傳感器

熒光檢測的靈敏度高, 可實現(xiàn)單分子檢測, 響應(yīng)速度快, 有固定的熒光信號, 可用多種染料實現(xiàn)多重分析[52]。Liu 等[53]借助CdSe/ZnS樹突狀核殼結(jié)構(gòu)納米晶體作為熒光標記物, 在沒有任何富集和孵化步驟下, 該方法對大腸桿菌O157︰H7的檢測限達到2.3 CFU/mL, 檢測時間為30 min。磁性納米顆粒用于快速分離磁珠-細胞結(jié)合物, Wang等[54]將等量子點QDs和磁納米顆粒應(yīng)用到生物傳感器中用于快速檢測單增性李斯特菌, 該傳感器的檢測限為2~3 CFU/mL, 檢測時間為1.5 h。在同一個樣品溶液中, 通過使用不同尺寸的QDs作為熒光標記物可以實現(xiàn)對不同細菌物種的同時檢測。Cho等[55]建立的原位熒光磁免疫傳感器能夠在2 h內(nèi)快速靈敏準確地檢測出低量大腸桿菌、沙門氏菌、單增性李斯特菌, 檢出限達到5 CFU/mL。這一方法簡單實用, 具有作為致病菌篩選工具的潛在優(yōu)勢。

1.4.2 電化學(xué)傳感器

電化學(xué)傳感器是發(fā)展最為成熟和應(yīng)用最廣的一類傳感器, 它可以在渾濁介質(zhì)中使用, 在微型化、集成化、智能化等方面得到快速發(fā)展。電化學(xué)傳感器具有操作簡單、攜帶方便、對分析物可以進行連續(xù)快速檢測等優(yōu)越性能, 在生命科學(xué)、食品安全、醫(yī)學(xué)檢驗和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[56]。按其所轉(zhuǎn)換的電學(xué)量類型可以將電化學(xué)傳感器分為: 電流型生物傳感器、電位型生物傳感器和阻抗型生物傳感器。

1.4.2.1 電流型傳感器(Amperometric biosensor)

電流型傳感器是常用的生物傳感器。以絲網(wǎng)印刷電極為基礎(chǔ)電極, 制備的多種用于檢測海水致病菌的電化學(xué)傳感器已有多次報導(dǎo)。Sharma[57]在絲網(wǎng)印刷電極的基礎(chǔ)建立的電流型免疫傳感器可檢測海水中的霍亂弧菌, 靈敏度為8 CFU/mL。這一方法簡單可行, 可用于環(huán)境中霍亂弧菌的檢測。此外, Laczaka提出的在絲網(wǎng)印刷電極上運用酶聯(lián)免疫分析法可在1h內(nèi)從含有12種不同的弧菌海水樣品中特異性檢測副溶血弧菌, 實現(xiàn)4×102CFU/mL的檢測[58]。該方法成本低, 耗時短, 微型化可實現(xiàn)原位檢測。用電化學(xué)活性物質(zhì)聚苯標記的大腸桿菌O157︰H7通過免疫磁分離后, 可在絲網(wǎng)印刷電極上進行電化學(xué)檢測。這一方法可在70 min內(nèi)實現(xiàn)70 CFU/mL大腸桿菌O157︰H7的檢測[59]。盡管較低的檢出限和較短的檢出時間有利于快速定性檢測, 但是該傳感器還需要在準確性上進行進一步的驗證, 以及在定量上進行改善。

1.4.2.2 電位型傳感器(Potentiometric biosensor)

電位型傳感可以基于pH變化或者離子濃度變化實現(xiàn)對致病菌的檢測。標記在大腸桿菌上的尿素酶可催化尿素產(chǎn)生NH3使得溶液的pH值發(fā)生變化, 通過檢測pH值的變化來檢測大腸桿菌?；诖颂岢龅碾娢粋鞲衅髟诳?.5 h內(nèi)實現(xiàn)10 CFU/mL的檢測[60-61]。我們課題組提出了一種基于核酸適體識別的免標記、免固定化電位型傳感器, 實現(xiàn)了海水中致病菌的快速檢測。單增性李斯特菌能夠與核酸適體特異性結(jié)合, 改變核酸適體的構(gòu)型或表面電荷, 從而影響其與魚精蛋白的作用, 使得電極電位變化發(fā)生改變。該電位型傳感器的靈敏度達到10 CFU/mL, 可以推廣用于其他致病菌的檢測。實際樣品檢測時, 我們采用樣品在線過濾系統(tǒng)實現(xiàn)對致病菌的富集, 能夠有效消除海水帶電荷離子的干擾[62]。

1.4.2.3 阻抗型傳感器(Impedimetric biosensor)

阻抗傳感器簡單、快速、無需標記, 廣泛應(yīng)用于致病菌的檢測。Guo等通過自組裝單層膜(SAM)將α—甘露糖苷固定在金電極上, 用于特異性捕獲大腸桿菌ORN 178。細胞膜上磷脂雙分子層的絕緣性會阻礙電極表面的電子傳遞, 因此通過檢測電極表面阻抗增加來確定有捕獲的大腸桿菌存在。該方法簡單快速, 可實現(xiàn)102CFU/mL的檢測[63]。用二茂鐵-抗微生物的縮氨酸蛙皮素I修飾的電化學(xué)阻抗傳感器可用來檢測大腸桿菌O157︰H7。在檢測過程中, 鍵合到二茂鐵-縮氨酸膜表面的大腸桿菌會使膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變形, 二茂鐵基團進入到溶液中, 因而電子更容易傳遞到金電極表面, 電阻抗值降低。在該傳感器中, 選用帶正電荷的蛙皮素I作為生物識別成分, 能夠特異性優(yōu)先檢測革蘭氏陰性致病的大腸桿菌。該方法的檢測時間小于2 h, 檢測限達到103CFU/mL[64]。Wan等[65]以功能化抗體修飾的3D泡沫鎳基底作為捕獲平臺的免疫傳感器, 借助電化學(xué)阻抗滴定法實現(xiàn)了對海水中硫酸鹽還原菌的檢測, 該方法具有高的選擇性和靈敏度。此外, 金納米顆粒(AuNPs)修飾的還原的氧化石墨烯紙(rGOP)有較大的活性區(qū)域, 有利于抗體的固定。Wang等[66]在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的電化學(xué)阻抗免疫傳感器能夠靈敏準確地檢測大腸桿菌O157︰H7。此方法避免了阻抗檢測的高成本, 有助于實現(xiàn)儀器便攜式及適時檢測等。此外, 石墨烯紙電極能夠長期保存且抗壓能力強, 能夠作為生物化學(xué)的微系統(tǒng)的應(yīng)用。

1.4.3 質(zhì)量傳感器(Mass-Sensitive Biosensor)

質(zhì)量傳感器的信號傳導(dǎo)是基于微小的質(zhì)量變化, 適用于對質(zhì)量變化極其敏感的檢測。石英晶體微天平(Quartz Crystal Microbalance, QCM)是最常用的質(zhì)量傳感器, 具有結(jié)構(gòu)簡單、成本低、靈敏度高、測量精度可達納克量級等優(yōu)點, 在微生物檢測方面得到廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。為實現(xiàn)快速檢測致病菌, Ozalp等[67]將沙氏門菌適體固定在磁珠上形成適體QCM傳感器。磁珠分離系統(tǒng)可以有效捕獲細菌細胞, 使反應(yīng)時間小于10 min, 檢測限為100 CFU/mL。該傳感器表面經(jīng)氫氧化鈉溶液洗脫后可重復(fù)使用。Salam等將Au納米顆粒與QCM免疫傳感器表面的多克隆抗體結(jié)合, 構(gòu)成的新型QCM傳感器能夠特異性地實時快速靈敏檢測傷寒沙氏門菌。與之前報道的QCM傳感器相比, 該傳感器可有效提高靈敏度, 對傷寒沙氏門菌的檢測限為10~20 CFU/mL[68]。Hong[69]等通過將氧化的免疫球蛋白G與單層自組裝膜上的酰肼交聯(lián)固定到壓電生物傳感器膜上, 用于檢測海水動物體內(nèi)的遲鈍愛德華氏菌。該傳感器特異性強, 靈敏度高, 再生性好, 可重復(fù)使用10次。

從表3可以看出, 生物傳感器技術(shù)在海水致病菌的檢測中取得了豐碩的成果。其在靈敏度、特異性以及檢測時間等方面又有了較大的提高, 但是由于微生物是活體物質(zhì), 對其的分析和檢測依然存在很多不確定性。生物傳感器在致病菌檢測中仍需要改進很多問題, 比如: 靈敏度需要進一步提高, 由于實際樣品的檢測往往需要很低的檢出限, 而由于非特異性信號等因素的干擾, 檢出限能達到10 CFU/mL左右的傳感器并不占多數(shù); 穩(wěn)定性需要提高, 由于構(gòu)建生物傳感器的生物敏感元件多為生物結(jié)構(gòu), 容易受外界條件影響, 因而生物傳感器在檢測和存放過程中應(yīng)克服生物結(jié)構(gòu)本身易變性的問題; 很多生物傳感器使用壽命并不長, 重復(fù)利用率不高, 容易造成資源的浪費。因此, 提高生物傳感器的靈敏度、使用壽命和生物響應(yīng)穩(wěn)定性, 設(shè)計微型化、便攜化、實用化的生物傳感器是今后的一個發(fā)展方向[70]。

表3 生物傳感器技術(shù)檢測海水中致病菌

2 總結(jié)與展望

每一種檢測海水中致病菌的技術(shù), 在不斷發(fā)展和創(chuàng)新過程中都各有優(yōu)勢。海水中存在眾多致病菌, 借助多重PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)可實現(xiàn)對多種致病菌的同時檢測; 實時熒光定量PCR利用熒光信號的積累能夠?qū)崟r監(jiān)測整個PCR過程, 實現(xiàn)定量檢測, 易實現(xiàn)自動化; 而反轉(zhuǎn)錄PCR只能檢測活的致病菌細胞, 可大大降低假陽性結(jié)果。免疫方法具有高效性, 與PCR檢測技術(shù)相比, 明顯縮短了檢測時間; 以磁珠為載體的免疫技術(shù)能快速有效富集目標病原菌, 且有較好的靈敏度和特異性。根據(jù)檢測原理的不同而發(fā)展起來的多類型傳感器在致病菌的檢出中應(yīng)用廣泛, 無論在分析速度, 準確性還是在靈敏度方面均有很大提高。

盡管許多發(fā)展的方法已經(jīng)實現(xiàn)了對某些海水中致病菌的檢測, 但是在海水復(fù)雜的基質(zhì)中, 致病菌濃度很低, 菌種繁多, 因此理想的致病菌檢測技術(shù)應(yīng)具有更高的靈敏度, 更強的選擇性以及可在短時間內(nèi)快速檢測。

分子生物學(xué)技術(shù)因為具有特異性強、靈敏度高以及快速簡單等優(yōu)點, 已被廣泛應(yīng)用于致病菌的檢測。致病菌的分離、富集和選擇高效的DNA提取方法是實現(xiàn)快速、特異、靈敏檢測的重要基礎(chǔ)[71]。因此, 今后研究中, 分子生物學(xué)技術(shù)的工作應(yīng)著重研究具有較強分離能力的分離方法, 例如對膜分離技術(shù)[72-73]進行優(yōu)化、納米磁性材料的應(yīng)用[74-75]等均可以有效提高致病菌的分離、富集效率。值得注意的是, 在分離富集過程中應(yīng)盡可能選擇特異性富集, 為后續(xù)DNA的提純提供質(zhì)量保證。同時簡化DNA的提取步驟, 縮短提取時間, 提高DNA的純度也是提高分子生物學(xué)檢測方法的又一重要手段。磁性材料經(jīng)過與致病菌特異性基因片段互補的寡核苷酸片段修飾后, 可以選擇性分離目標DNA, 此法靈敏、快速且干擾小[76-77]。

分子識別元件作為傳感器的重要元件, 是影響傳感器特異性、穩(wěn)定性以及適用范圍的關(guān)鍵因素。適配體具有分子小、易合成、易修飾、相對穩(wěn)定且對靶物質(zhì)可特異性識別、結(jié)合力很強等優(yōu)勢, 近幾年已作為一類分子識別元件用于搭載各種傳感元件組建成不同類型的生物傳感器[78-82]實現(xiàn)了對致病菌的檢測要求。同時, 近幾年來, 適配體作為構(gòu)建新型液相芯片的基礎(chǔ)在致病菌的檢測中也逐步引起關(guān)注[83-85]。新型液相芯片技術(shù)是以物理學(xué)、光學(xué)等編碼的基質(zhì)為載體, 通過制備不同配體功能化的載體, 實現(xiàn)對同一液相環(huán)境中多種靶細菌的同時檢測, 具有操作簡便、高靈敏度、高通量以及寬的線性測定范圍等優(yōu)點。因此, 隨著適配體篩選技術(shù)和液相芯片技術(shù)不斷提高, 以適配體為分子識別元件構(gòu)建的生物傳感器以及以適配體為基礎(chǔ)構(gòu)建的新型液相芯片檢測技術(shù)將會在海水中病菌的檢測中發(fā)揮重要的作用。

隨著新材料的出現(xiàn)和新技術(shù)的發(fā)展, 功能化納米材料在致病菌的檢測中發(fā)揮巨大的作用。例如有利于分離、富集和純化的磁性納米材料能夠有效縮短增菌時間, 大幅度提高檢測效率[86-88]; 利用納米金的光學(xué)特性引起的體系顏色的變化能夠?qū)崿F(xiàn)致病菌的快速檢測[89-91]; 以及利用量子點的熒光特性能夠顯著提高靈敏度等[92-93]。其中, 量子點作為理想的生物探針, 具有量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好、斯托克斯位移大、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄等獨特的光學(xué)特征[94-96], 在致病菌的檢測中潛在較大的應(yīng)用價值, 例如量子點免疫層析試紙條[97-98, 92]、量子點生物傳感器[99-100]、量子點標記流式細胞術(shù)[101-102]等檢測技術(shù)的建立。隨著量子點合成工藝的不斷改進以及量子點與免疫分析、適配體分析、生物傳感等檢測方法的結(jié)合, 將會為人們提供更多快速、靈敏、高效的檢測方法, 在海水致病菌檢測領(lǐng)域?qū)懈鼜V闊的應(yīng)用前景[103]。

檢測系統(tǒng)的智能化、微型化、便攜化發(fā)展, 使實時、現(xiàn)場、動態(tài)、快速檢測正在成為現(xiàn)實, 將成為一種新的發(fā)展趨勢。微流控芯片技術(shù)是將生物或化學(xué)樣品制備、輸送、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作集成到一塊芯片上完成。紙芯片是近年來發(fā)展起來的一種基于紙的微流控器件, 具有操作簡單、成本低廉、制作簡單等優(yōu)勢, 在致病菌的檢測中已有應(yīng)用[104-105]。但是微流控紙芯片應(yīng)用于致病菌的檢測尚處于初級階段, 要成功應(yīng)用于海水致病菌的檢測仍需要通過不斷地優(yōu)化與研究, 加強與電子設(shè)備的結(jié)合, 研制針對致病菌具有富集、分離、檢測多功能于一體的微流控紙芯片, 使其適用于海水中致病菌的檢測。

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Research progress in detecting pathogenic bacteria in seawater

LIU Shu-wen1, 2, DING Jia-wang1, QIN Wei1

(1. Key Laboratory of Coastal Environmental Processes and Ecological Remediation, Yantai Institute of Coastal Zone Research (YIC), Chinese Academy of Sciences (CAS); Shandong Provincial Key Laboratory of Coastal Environmental Processes, YICCAS, Yantai 264003, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijng 100049, China)

There are many different kinds of pathogenic bacteria in seawater, each of which are potentially hazardous to aquaculture and human health. Conventional methods for detecting pathogenic bacteria have the drawbacks of complicated culturing procedures, time-consuming labor, and low efficiency, which limits their practical application. Therefore, there is an urgent need for the development of rapid, sensitive, and accurate detection technology for pathogenic bacteria in seawater. In this paper, we provide an overview of the applications of flow cytometry, the molecular biology method, the immunology method, and biosensors with respect to bacteria in seawater and summarize the research status of these methods.

pathogenic bacteria in Seawater; detecting; flow cytometry, molecular biological method; immunology method; biosensor

P736.22

A

1000-3096(2017)02-0145-12

10.11759/hykx20160310002

2016-03-10;

2016-12-01

中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(XDA11020702); 山東省泰山學(xué)者人才計劃項目(TS20081159)

劉淑文(1991-), 女, 山東煙臺人, 碩士生, 主要從事電位型傳感器研究, E-mail: shuwenliu@yic.ac.cn; 秦偉, 通信作者, 研究員, E-mail: wqin@yic.ac.cn

Jul. 9, 2016

[This study was funded by the Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences, No.XDA11020702; Taishan Scholar Program of Shandong Province, No. TS20081159]

(本文編輯: 梁德海)