楊 銘, 于 洋, 張曉軍, 王全超, 3, 劉敬文, 3, 李富花, 相建海

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基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的凡納濱對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)

楊 銘1, 2, 于 洋1, 張曉軍1, 王全超1, 3, 劉敬文1, 3, 李富花1, 相建海1

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所, 實驗海洋生物學(xué)重點實驗室, 山東青島266071; 2. 福州市海洋與漁業(yè)技術(shù)中心, 福建福州350005; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

對蝦遺傳多樣性和育種研究需要大量的分子標(biāo)記。作者利用凡納濱對蝦()轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù), 采用MISA軟件進(jìn)行微衛(wèi)星序列挖掘, 共獲得14 767條微衛(wèi)星序列。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)在凡納濱對蝦中微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率為16.76%; 在所有的微衛(wèi)星序列中, 2堿基微衛(wèi)星最多, 占59.53%; 其次是3堿基微衛(wèi)星, 占35.78%。隨機(jī)選取其中74條序列設(shè)計引物, 通過DNA混池擴(kuò)增和分型的方法進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā), PCR擴(kuò)增的顯示有54對(72.97%)能擴(kuò)增出清晰的目的條帶, 進(jìn)一步分型的結(jié)果顯示27條(36.49%)微衛(wèi)星顯示出多態(tài)性, 從這些多態(tài)性的微衛(wèi)星位點中選擇11個位點在“科海1號”種質(zhì)庫材料中進(jìn)行個體分型, 結(jié)果顯示在該群體中微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)目為2~11個不等, 期望雜合度值為0.256~0.858, 觀察雜合度為0.213~0.875, 多態(tài)性信息含量為0.221~0.830, 在11個位點中有4個位點顯著偏離HWE (<0.05)。本研究結(jié)果為后續(xù)使用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行對蝦遺傳學(xué)研究, 促進(jìn)對蝦的遺傳選育和種質(zhì)資源保護(hù)提供了重要基礎(chǔ)。

凡納濱對蝦(); 微衛(wèi)星; 轉(zhuǎn)錄組; 遺傳多樣性

凡納濱對蝦()又稱南美白對蝦, 因其具有生長速度快、抗病能力強(qiáng)、餌料蛋白需求低等突出的養(yǎng)殖特性, 成為中國和世界上最主要的養(yǎng)殖對蝦種類, 占蝦類總產(chǎn)量的85%。然而, 病害頻發(fā)和種質(zhì)退化給對蝦養(yǎng)殖造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失, 通過遺傳改良提高對蝦的種質(zhì), 培育生長快速、抗性能力強(qiáng)的優(yōu)良品種對于對蝦養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展顯得尤為迫切。

在傳統(tǒng)的遺傳選育基礎(chǔ)上, 利用分子標(biāo)記研究選育種群的遺傳多樣性、輔助親本選擇能夠有效地提高選育效率, 尤其是對于如抗病性狀等難以進(jìn)行表型測定的性狀。微衛(wèi)星(又稱簡單重復(fù)序列, Simple Sequence Repeats, SSR)多態(tài)性高、穩(wěn)定性好, 且為共顯性標(biāo)記, 是一種理想的分子標(biāo)記。目前, 微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建、家系鑒定、品種純度檢測以及目標(biāo)性狀基因定位等研究領(lǐng)域[1-4]。凡納濱對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記在1996年即有報道[5], 最早批量開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的是Meehan等, 他們通過構(gòu)建基因組DNA文庫, 使用探針篩選的方法共得到含有573個微衛(wèi)星的173條序列, 據(jù)此設(shè)計了136對微衛(wèi)星引物并用于后續(xù)的連鎖圖譜構(gòu)建[6-7]、家系鑒定[8]等多方面工作。隨著測序技術(shù)的發(fā)展, NCBI上凡納濱對蝦的測序數(shù)據(jù)顯著增多, 利用已有的測序數(shù)據(jù), 特別是大量的EST數(shù)據(jù), 采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行微衛(wèi)星發(fā)掘成為研究熱點, 很多的EST-SSR位點被發(fā)現(xiàn)和驗證[3,9-10]。目前已發(fā)表的凡納濱對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記約有600多個, 然而對于具有如此重要經(jīng)濟(jì)價值的物種, 這樣少的微衛(wèi)星標(biāo)記顯然是不相稱的?？捎眠z傳標(biāo)記的缺乏是影響對蝦選育的重要原因之一[11]。

近年來, 通過高通量測序, 很多物種獲得了海量的序列數(shù)據(jù), 從這些序列中發(fā)掘微衛(wèi)星標(biāo)記成為一種更高效的手段[12-15]。本研究利用已公布的凡納濱對蝦高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫, 通過組裝的方法構(gòu)建出凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組參考序列, 運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組unigenes中的SSR標(biāo)記, 并驗證了開發(fā)出的SSR標(biāo)記的多態(tài)性, 這些微衛(wèi)星位點和開發(fā)出的分子標(biāo)記為后續(xù)對蝦遺傳研究提供了很好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源為包括5個不同胚胎和幼體發(fā)育時期的凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(NCBI數(shù)據(jù)庫: SRR1460493, SRR1460494, SRR1460495, SRR1460504, SRR1460505)[16], 測序平臺為HiSeq 2000 (Illumina, USA), 共獲得263 300 374條經(jīng)過過濾處理的序列, 總數(shù)據(jù)量為29.2 Gb。使用Trinity軟件(http: //trinityrnaseq. sourceforge.net/)對這些經(jīng)過過濾處理的序列進(jìn)行混合拼接形成參考序列。

1.2 微衛(wèi)星位點的批量發(fā)掘和引物設(shè)計

微衛(wèi)星序列的定位和識別使用MISA軟件(http: // pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)進(jìn)行, 由于轉(zhuǎn)錄組中存在polyA和polyT, 因此使用轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行SSR發(fā)掘時不考慮單堿基重復(fù), MISA參數(shù)設(shè)置如下: 2-6、3-5、4-5、5-5、6-5, 復(fù)合微衛(wèi)星標(biāo)記的最大長度為100 bp。MISA網(wǎng)站同時提供了用于批量轉(zhuǎn)換微衛(wèi)星兩側(cè)序列的Perl腳本p3_in.pl和p3_out.pl, 利用這兩個腳本將MISA結(jié)果轉(zhuǎn)換成Primer 3程序可以識別的格式, 在本地運(yùn)行Primer 3批量設(shè)計引物。

1.3 混池方法篩選多態(tài)性微衛(wèi)星位點

從凡納濱對蝦“科海1號”核心種質(zhì)庫中取32尾, 體長13~14 cm, 體質(zhì)量30~35 g。采用海洋生物基因組提起試劑盒(Tiangen)提取DNA, 提取的DNA使用Nanodrop 2000(Thermo Scientific, USA)測量DNA濃度后稀釋至100 ng/μL, 每8個個體的DNA等量混合, 構(gòu)建4個DNA混池。

在批量設(shè)計的引物中隨機(jī)選取74條, 采用TP-M13方法[17]對4個混池的對蝦基因組DNA進(jìn)行微衛(wèi)星分型, 為了避免非特異性擴(kuò)增, 擴(kuò)增并分型在單個個體中同時進(jìn)行。PCR擴(kuò)增上述樣品混池和單個個體DNA, PCR反應(yīng)在20 μL體系中進(jìn)行, 體系如下: 模板DNA(100 ng/μL)2μL, 10× Buffer 2 μL, dNTP 0.4 μL, MgCl21.2 μL, 正向引物0.1 μL, 反向引物 0.4 μL, M13 引物0.2 μL, Taq(2.5 U/μL)0.25 μL, 超純水13.35 μL。PCR反應(yīng)程序如下: 94℃ 4 min, 然后運(yùn)行94℃ 30 s, 50~60℃30 s, 72℃ 30 s 38個循環(huán); 接著運(yùn)行94℃ 45 s, 45℃ 45s, 72℃ 45 s 12個循環(huán); 最后72 ℃ 5 min, 4 ℃終止, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物避光保存。

將上述PCR產(chǎn)物使用超純水稀釋20倍, 之后配置上機(jī)樣品緩沖液, 緩沖液由HiDi甲酰胺和ROX 500標(biāo)準(zhǔn)品(Applied Biosystems, USA)組成, 兩者比例為9.85︰0.15。取稀釋后的PCR產(chǎn)物1 μL與9 μL的上機(jī)緩沖液混合, 95℃變性2 min, 立刻置于冰上以阻止DNA的復(fù)性。然后將加入上機(jī)緩沖液后的樣品在3130xl(Applied Biosystems, USA)進(jìn)行測序儀分型。分型結(jié)果使用GENEMARKER v1.91(SoftGenetics, USA)讀取分型數(shù)據(jù), 根據(jù)分型結(jié)果獲得每個微衛(wèi)星位點的多態(tài)性。

1.4 個體微衛(wèi)星分型研究微衛(wèi)星等位基因頻率

在凡納濱對蝦“科海1號”種質(zhì)庫的32個個體中研究微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性分布, 同時驗證混池篩選的微衛(wèi)星的準(zhǔn)確性, 所采用的分型方法同上。獲得微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)后, 使用PopGen32軟件計算群體的等位基因數(shù)、觀測雜合度和期望雜合度, 利用Cervus 3.0軟件計算位點的多態(tài)信息含量()利用GENEPOP 4.2軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析 (http: //genepop. curtin.edu.au/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組SSR位點開發(fā)

凡納濱對蝦的5個轉(zhuǎn)錄組組裝共獲得66 815條非冗余基因, 利用該數(shù)據(jù)共發(fā)掘SSR位點14 767個, 這些SSR位點分布于11 195條基因片段中, 其中以復(fù)合微衛(wèi)星形式存在的有1 844個, 微衛(wèi)星的發(fā)生頻率(含有SSR的非冗余基因數(shù)量與總非冗余基因數(shù)量的比值)為16.76%(表1)。在所發(fā)掘的微衛(wèi)星中, 2堿基微衛(wèi)星最多, 占59.53%, 其次是3堿基微衛(wèi)星, 占35.78%(圖1)。

表1 凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組SSR發(fā)掘位點統(tǒng)計

2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記驗證

從轉(zhuǎn)錄組選擇的74對微衛(wèi)星引物, 在“科海1號”DNA混池中進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 結(jié)果顯示能夠成功擴(kuò)增的引物有54對, 占設(shè)計所選序列的72.97%。經(jīng)過微衛(wèi)星分型后有27對(36.49%)顯示出多態(tài)性(表2), 多態(tài)性位點的等位基因數(shù)從2~8不等, 以2和3等位基因的居多, 少量微衛(wèi)星標(biāo)記含有7~8個等位基因。將這些發(fā)掘的標(biāo)記與已公布的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行BLAST比對, 未發(fā)現(xiàn)有共同的部分, 因此這些標(biāo)記為新發(fā)現(xiàn)的凡納濱對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記。

2.3 多態(tài)性微衛(wèi)星的種群分析

選擇11對具有多態(tài)性的轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星引物, 在“科海1號”種質(zhì)庫中進(jìn)行分型。結(jié)果顯示, 這11個微衛(wèi)星引物共包含65個等位基因, 每個位點檢測到的等位基因2~11個不等(表3)。遺傳多態(tài)性分析顯示, 這11個標(biāo)記在“科海1號”種群中的期望雜合度值從0.256到 0.858不等, 觀察雜合度從0.213到0.875不等, 多態(tài)性信息含量在0.221~0.830, 在11個位點中7個位點符合Hardy-Weinberg平衡, 有4個位點(LvU15501、LvC905、LvC2235、LvU27836)顯著偏離HWE (<0.05)。

表2 從凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組中挖掘的具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點

續(xù)表

微衛(wèi)星位點引物序列(5′-3′)退火溫度(℃)重復(fù)單元序列長度(bp)等位基因數(shù) LvC4800GCCTCGTCGAATCTTCTAGC60(gtca)5109~1172 CACAACCTCATGGTGACTGC LvC4959CTGGTCTGACTTTGGCTTCG60(ctgg)594~1022 AGACAGCTGCCTTACGCTCT LvC5147GGAGATGAGTAACCCGCACT60(gtg)7112~1212 CTCTTCCCCAACCTCCTCAT LvU15501CCCTTGCACCATATCTGAGG60(ttgc)10183~2035 GCCTGCTCTGTGGAATTTCT LvC966CGGACTTGATGCTCGTCTCT60(gcc)7133~1663 CCGTCAGGAACTCGTAGAGG LvC905ACATCATCGACATCGAGCAG55(gac)9279~3156 GTCATCGTCCTCCTCGTCAT LvC1661CCTGAGCCCAATAGCCTCTA60(cga)7114~1264 TGCCGGTTCTGAAGGAGTAG LvU16123AGCAGAGGCACCACCAAC60(cag)7104~1215 GTCGACTTCACCACGCTGT LvC3954GCTCAAGTACCGCAAAGACC60(acg)7144~1472 TCCTTGGAATCAGGCTCAAC LvC753GCCGATTTTAGTCTCGAACG60(acaa)5137~1542 TTGACCTGTAGGAGTTTCCTGA LvU15623TGTTCCACAGTTTCCTCGTCT60(agc)7141~1503 TGCTCCCTAGGTACAGGTCTTG LvU3848CCACTGGCAAATGCAAAGAT60(gag)7110~1193 TGGCTTCCCTTGTCTTGTCT LvC3299ACCAGACCTTCACCGAAATG55Compound345~3574 AAGGAAAGAAGGGGAAGTGC LvC2235TGTTGGCTACAAGTGCAGAAA58Compound289~3118 ACGATTCTGTGTCGCAAAAA LvU27836GGGGCCCATTTCTGTTTATT55(cat)7243~2707 GTCAGTTTCGCTATCCCAGC LvC96AAGTGATCACAGGAGGCGAG58Compound202~2082 CGGTGCAGGTTCTCCCTAT

表3 從轉(zhuǎn)錄組中發(fā)掘的11個多態(tài)性位點的遺傳多樣性信息

注:“*”.顯著偏離哈-溫平衡(<0.05)

3 討論

微衛(wèi)星標(biāo)記由于其較高的遺傳多樣性, 一直是研究人員開發(fā)的重點。雖然新一代分子標(biāo)記SNP、Indel等的出現(xiàn)使其關(guān)注度有所降低, 但是微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性高, 相對于SNP標(biāo)記多為2態(tài)性的特征, 微衛(wèi)星標(biāo)記在進(jìn)行種群遺傳關(guān)系分析方面具有更大用處。研究人員分析了微衛(wèi)星標(biāo)記和SNP標(biāo)記在進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定方面的功效, 發(fā)現(xiàn)SNP標(biāo)記具有很高的品種與群體特異性, 同一品種不同的群體之間也存在差異, 而中等密度的微衛(wèi)星標(biāo)記在種群關(guān)系上的作用比SNP效果更好[18], 因此微衛(wèi)星標(biāo)記仍然有很大的應(yīng)用空間。

具有多態(tài)性的SSR位點才可能開發(fā)為微衛(wèi)星標(biāo)記。本研究利用已經(jīng)獲得的高通量測序轉(zhuǎn)錄組序列, 采用生物信息學(xué)方法從測序拼接的數(shù)據(jù)中發(fā)掘SSR位點, 并進(jìn)行批量的引物設(shè)計, 通過混池法對微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性進(jìn)行分析, 最終獲得27個新的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記, 并在一個育種群體中分析了11個微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)、等位基因頻率和多態(tài)性信息含量等。從11個微衛(wèi)星標(biāo)記在育種群體的分型結(jié)果看, 91%(10/11)的位點平均多態(tài)信息含量分別為都在0.5以上, 根據(jù)Botstein等[19]提出的衡量標(biāo)準(zhǔn), 當(dāng)>0.5時, 意味著該位點為高度多態(tài)位點, 說明本研究開發(fā)的標(biāo)記的多態(tài)性較高, 同時也說明了育種群體雖然經(jīng)過多代的選育, 仍然具有較為豐富的遺傳多樣性?；螂s合度是衡量群體遺傳變異水平的理想?yún)?shù), 除了位點LvC96外, 其他10個位點的觀測雜合度和期望雜合度均較高, 也從一個側(cè)面說明了對蝦作為一種人工馴化程度較低的物種, 個體的雜合度仍然較高。

在進(jìn)行個體分型的11個位點中, 有4個(36%)位點顯著偏離哈-溫平衡(<0.05)。在已報道的水產(chǎn)動物微衛(wèi)星挖掘的文章中, 偏離哈-溫平衡的標(biāo)記出現(xiàn)較為普遍, 在菲律賓蛤仔()和擬穴青蟹()的微衛(wèi)星發(fā)掘中, 發(fā)現(xiàn)有84%和75%的標(biāo)記顯著偏離哈-溫平衡[20-21], 該現(xiàn)象的原因可能是由于海洋動物的遺傳變異度較高, 因此在微衛(wèi)星標(biāo)記的引物位置在不同個體中可能會存在SNP、Indel等變異, 使其中的等位基因無法擴(kuò)增出來, 產(chǎn)生無效等位基因, 導(dǎo)致分型結(jié)果顯著偏離哈-溫平衡。在本研究中, 所用的實驗材料取自育種群體, 由于在育種過程中是按照育種目的進(jìn)行的家系構(gòu)建, 親本之間的交配并不是隨機(jī)的, 這也可能是導(dǎo)致有些標(biāo)記偏離哈-溫平衡的原因之一。

凡納濱對蝦基因組復(fù)雜, 重復(fù)序列所占比例很高, 其中串聯(lián)重復(fù)序列至少占基因組序列的18.59%左右[22]。在本文的研究中, 生物信息學(xué)方法預(yù)測的微衛(wèi)星數(shù)目明顯高于其他物種, 可見無論在轉(zhuǎn)錄組中還是基因組中, 對蝦微衛(wèi)星的發(fā)生頻率均較高。相對于基因組序列, 從轉(zhuǎn)錄組中發(fā)掘的SSR數(shù)量較少, 這與轉(zhuǎn)錄組序列為功能基因有關(guān), 在編碼區(qū)較少有重復(fù)序列的出現(xiàn), 轉(zhuǎn)錄組中重復(fù)序列多出現(xiàn)在UTR區(qū)域。轉(zhuǎn)錄組中開發(fā)微衛(wèi)星的效率較低, 這與擴(kuò)增產(chǎn)物可能跨較大內(nèi)含子或者引物位于內(nèi)含子外顯子結(jié)合處造成擴(kuò)增失敗所致, 這也決定了在擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄組中的微衛(wèi)星序列時一般會選擇擴(kuò)增片段較小的引物。然而由于轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的微衛(wèi)星來源于基因的調(diào)控區(qū)或編碼區(qū), 可以直接、準(zhǔn)確地標(biāo)記功能基因, 所以更真實地反映該物種的遺傳多樣性。

本研究表明從高通量測序數(shù)據(jù)中篩選對蝦微衛(wèi)星是一種高效可行的方法, 研究結(jié)果大大增加了凡納濱對蝦可用的微衛(wèi)星標(biāo)記, 對于凡納濱對蝦的遺傳學(xué)研究、分子標(biāo)記選育以及種質(zhì)資源保護(hù)都具有重要意義。

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Development of microsatellite markers from the transcriptome sequences of Pacific white shrimp ()

YANG Ming1, 2, YU Yang1, ZHANG Xiao-jun1, WANG Quan-chao1, 3, LIU Jing-wen1, 3, LI Fu-hua1, XIANG Jian-hai1

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Oceanic & Fishery Technology Center of Fuzhou, Fuzhou 350005, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The Pacific white shrimp,, is one of the most economically important marine aquaculture species in China, as well as the world. A large number of molecular markers are required for the studies of genetic diversity and breeding in shrimp. In the present investigation, 14 767 SSRs were detected inunigenes derived from transcriptome sequencing. Among these, dinucleotide SSRs were the most abundant motif (59.53%), followed by trinucleotide (35.78%) SSRs. A total of 74 primer pairs were designed and validated using DNA pools. 54 pairs (72.97%) were amplified with clear band, and 27 pairs (36.49%) were found to be polymorphic. The genetic diversity was analyzed using 11 highly polymorphic SSR markers in the breeding population of “Kehai No.1, ” a selected new variety of. Consequently, the allele number of these microsatellites ranged from 2 to 11. Expected heterozygosity and observed heterozygosity ranged from 0.256 to 0.858 and 0.213 to 0.875, respectively. The polymorphic information varied from 0.221 to 0.830. Four loci deviated significantly from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (< 0.05). The large number of genetic markers developed in the present study would be highly beneficial to the researches to understand genetic diversity, selective breeding, and germplasm conservation in shrimp.

; microsatellite; transcriptome; polymorphism

S917.4

A

1000-3096(2017)02-0096-07

10.11759//hykx20160322002

2016-03-22;

2016-06-28

國家自然科學(xué)基金資助項目(31502161, 31672632); 國家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計劃資助項目(2012AA10A404)

楊銘(1971-), 男, 福建福州人, 工程師, 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)研究工作, E-mail: ymfj88@163.com; 張曉軍, 通信作者, E-mail: xjzhang@qdio.ac.cn

Mar. 22, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No.31502161, 31672632; The National High Technology Research and Development Program of China (863 Program), No.2012AA10A404]

(本文編輯: 譚雪靜)