應(yīng) 銳, 張朝輝, 段筱杉, 趙 雪, 侯 虎, 李八方

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紫菜中類菌孢素氨基酸純化工藝的優(yōu)化及其抗紫外輻射作用研究

應(yīng) 銳, 張朝輝, 段筱杉, 趙 雪, 侯 虎, 李八方

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東青島 266023)

為了篩選純化紫菜類菌孢素氨基酸(mycosporine-like amino acid, MAAs)的離子交換樹脂, 優(yōu)化純化工藝, 并研究純化后MAAs體外抗紫外輻射活性, 本研究通過靜態(tài)動力學(xué)吸附及解析實驗, 篩選純化樹脂; 結(jié)合動態(tài)動力學(xué)吸附及解析單因素實驗建立響應(yīng)面法對SA-2型陽離子樹脂純化MAAs的二次多項式模型, 對MAAs的純化工藝進行優(yōu)化; 通過建立大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的復(fù)合紫外線(UVA+UVB)損傷模型, 分析純化后MAAs樣品的體外抗輻射活性。結(jié)果表明: 靜態(tài)動力學(xué)吸附及解析實驗篩選出SA-2型陽離子樹脂為純化MAAs的最佳樹脂, 吸附率和解析率分別為86.01%和56.63%; 吸附的最佳工藝條件為: 上樣液質(zhì)量濃度3 g/L、上樣流速1 mL/min、上樣液pH為6、洗脫液體積分?jǐn)?shù)為3%、洗脫流速為1.5 mL/min、洗脫液pH為6; 在此條件下吸附率為79.21%, 洗脫率為64.02%; 純化后的MAAs樣品能有效抑制紫外輻射而造成的損傷, 將菌種失活速度分別降低了39.10%和40.58%, 表現(xiàn)出顯著的抗紫外輻射活性。

壇紫菜; 類菌孢素氨基酸; SA-2樹脂; 純化; 響應(yīng)面; 抗紫外輻射

類菌孢素氨基酸(Mycosporine-like amino acids, MAAs)是一類廣泛存在于藻類、浮游植物及微生物中的多羥基酮類化合物, 這類物質(zhì)以環(huán)己烯酮為基本骨架, 通過連接不同種類的氨基酸縮合而成。由于側(cè)鏈上所連接的活性基團與共軛雙鍵的作用, 使得類菌孢素氨基酸存在多種功能活性, 在320~360 nm波長處具有較強的紫外線吸收作用, 基于這類物質(zhì)對保護生命材料具有潛在的應(yīng)用價值, 近年來已引起人們的廣泛關(guān)注[1-4]。目前, 針對于這類物質(zhì)的研究重點多聚焦于環(huán)境條件如溫度、光照、鹽度對藻類誘導(dǎo)產(chǎn)生并積累MAAs化合物的影響[4]。許志恒等也先后就從紫菜、江蘺等天然海藻中提取的類菌孢素氨基酸化合物其結(jié)構(gòu)組成及抗氧化活性進行研究[5-8]。

但是, 針對于海藻中提取的MAAs生物活性的研究大多存在樣品純化工藝復(fù)雜、純度較低等一系列問題。為進一步探究MAAs這類天然活性物質(zhì)的藥效成分、作用機理并實現(xiàn)將其應(yīng)用于制藥及化妝品工業(yè)中, 類菌孢素氨基酸純化技術(shù)的改進與優(yōu)化已成為需解決的首要問題[8-9]。目前, 針對這類物質(zhì)多采用層析(硅膠柱層析、凝膠柱層析、大孔樹脂、離子交換樹脂層析等)等方法對其進行純化分離[10-11]。而大孔樹脂、離子交換樹脂由于具有吸附量大、吸附率強、解析率高、可重復(fù)利用等優(yōu)點成為純化使用的首選[11]。

本文在此基礎(chǔ)上, 選取類菌孢素氨基酸含量較高的經(jīng)濟型海藻壇紫菜為原料, 提取其中的MAAs, 參考牛美英等提出的用陽離子交換樹脂純化類菌孢素氨基酸的方法[7, 9], 選取5種純化效果較好的離子交換樹脂, 通過對比其吸附率及解析率, 選擇最佳純化樹脂, 并結(jié)合單因素實驗結(jié)果分別對其吸附率、解析率建立Box-Behnken響應(yīng)面模型, 通過對比模型中各因素間交互關(guān)系, 優(yōu)化純化工藝[12-13]。并探究純化后的紫菜類菌孢素氨基酸抗紫外輻射活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇紫菜()海南地區(qū)生產(chǎn)(購于青島利群商廈); SA-2、001*7、201*7、D61、D152型離子交換樹脂(上海江萊生物科技有限公司); 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(取自中國海洋大學(xué)微生物實驗室); 無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氨水、Tris-HCl、氯化鈉均為分析純; 水為雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

粉碎機(天津泰斯特有限公司); HH-S4型恒溫水浴鍋(歐萊博科技有限公司); 攪拌器; 2-16型低溫高速離心機(Sigma); R1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鄭州長城儀器有限公司); PHS-3S型pH計(雷磁-上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司); UV-2802型紫外可見分光光度計(Unico); BT100-2J蠕動泵; Φ10 mm×20 cm玻璃層析柱(北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司); SW-CJ-1FD型超凈工作臺(南京貝登生物有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 MAAs粗提液的制備

參考金寧寧等[6]的提取方法, 對紫菜中類菌孢素氨基酸(MAAs)進行提取, 操作流程如下: 烘干紫菜→粉碎研磨過篩→40℃乙醇提取2 h→超聲波輔助提取20 min→離心→減壓蒸餾→醇沉→冷凍穩(wěn)定→冷凍離心→減壓蒸餾→真空冷凍干燥→凍干粗品→樣品復(fù)溶→MAAs粗提液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及粗提液質(zhì)量濃度的選擇

選取紫菜類菌孢素氨基酸主要組分Porphyra- 334作為標(biāo)準(zhǔn)品。Porphyra-334的摩爾吸光系數(shù)334= 4.23×104mol/(L·cm), 依據(jù)朗伯比爾定律[14],可計算得出標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。應(yīng)用HPLC法測定該組分在紫菜類菌孢素氨基酸中所占比例, 可計算求得類菌孢素氨基酸的濃度[5], 采用UV-HPLC擬合法, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6-7]。得到曲線方程為:= 20.889+0.008 47 (2=0.997 98)。根據(jù)方程, 分別計算并配制不同質(zhì)量濃度梯度的樣品粗提液。

1.3.3 MAAs純化樹脂的篩選

參考牛美英等[9]對多酚類物質(zhì)的純化方法, 以靜態(tài)動力學(xué)吸附實驗為依據(jù), 繪制動力學(xué)吸附及解析圖, 并分別以不同型號的陽離子交換樹脂對樣品的吸附量、吸附率、解析量、解析率為指標(biāo), 篩選出效果最佳的樹脂作為進一步純化所使用的樹脂。

1.3.4 純化樹脂的預(yù)處理

將篩選出的陽離子交換樹脂加入約4倍體積的雙蒸水浸泡24 h后, 洗滌處理。分別用1 mol/L的HCl動態(tài)洗滌2 h, 用雙蒸水沖洗至中性; 再用1 mol/L的NaOH動態(tài)洗滌2 h, 用雙蒸水沖洗至中性; 最后在使用樹脂前用1 mol/L的HCl將陽離子交換樹脂浸泡、動態(tài)洗滌2 h, 使樹脂轉(zhuǎn)為酸性。

1.3.5 陽離子交換樹脂純化MAAs樣品的單因素實驗

1.3.5.1 動態(tài)動力學(xué)吸附條件優(yōu)化

1) 樣品質(zhì)量濃度對吸附效果的影響

分別配制0.5~5 g/L的MAAs樣品粗提液, 保持上樣液pH為6, 上樣流速為1 mL/min。計算不同質(zhì)量濃度下樣品的吸附率。

2) 上樣液流速的吸附效果影響

配制3 g/L的MAAs樣品粗提液, 調(diào)節(jié)pH為6。分別以0.5 ~3 mL/min的上樣流速上柱樣品。實驗過程中上樣液每經(jīng)過0.5倍樹脂柱內(nèi)裝載體積(Bed Volume, BV)收集一次樣品, 定量檢測MAAs化合物含量, 從而計算吸附率。

3) 上樣液pH對吸附率的影響

選取質(zhì)量濃度為3 g/LMAAs粗提液, 分別調(diào)節(jié)上樣液的pH值從3到8, 以流速為1 mL/min的流速上柱, 通過計算流出液的濃度和體積, 計算吸附率。

1.3.5.2 動態(tài)動力學(xué)解析條件優(yōu)化

1) 洗脫液的質(zhì)量濃度對洗脫效果的影響

參考金寧寧等的純化方法[7], 選取NH3·H2O水溶液作為洗脫液, 分別配制體積分?jǐn)?shù)為1%~5%的NH3·H2O水溶液, 在固定洗脫液pH為6, 洗脫流速為1 mL/min, 洗脫體積為6 BV的條件下解析MAAs樣品, 計算不同體積分?jǐn)?shù)下洗脫液對洗脫率的影響。

2) 洗脫流速對洗脫效果的影響

在固定洗脫液體積分?jǐn)?shù)為3%、洗脫液pH為6、洗脫體積為6 BV的情況下, 分別將洗脫液以洗脫流速為0.5~3 mL/min上柱洗脫, 通過計算洗脫液的濃度, 計算洗脫率。

3) 洗脫液pH對洗脫效果的影響

固定洗脫液體積分?jǐn)?shù)為3%的NH3·H2O水溶液作為洗脫液, 洗脫流速為1.5 mL/min, 洗脫體積為6 BV的情況下, 調(diào)節(jié)洗脫液pH為2~8上柱洗脫, 通過計算洗脫液的濃度和體積, 計算洗脫率。

1.3.5.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化MAAs樣品純化工藝

采用Design-Expert8.0軟件設(shè)計MAAs樣品純化的響應(yīng)面實驗, 應(yīng)用Box-Behnken分別建立SA-2型樹脂在不同條件下對吸附率和解析率影響的實驗?zāi)Ｐ蚚15-16]。分別以樣品的質(zhì)量濃度、上樣液流速、上樣液pH值這三個因素為自變量, 以上柱吸附率響應(yīng)值的高低為因變量, 分析各因素間的交互影響, 優(yōu)化吸附實驗工藝。實驗設(shè)計因素水平見表1。再分別以洗脫液質(zhì)量濃度、洗脫流速、洗脫液pH值這3個因素水平為自變量, 以解析率響應(yīng)值的高低為因變量, 分析各因素間的交互作用, 優(yōu)化解析實驗工藝。實驗設(shè)計因素水平見表2。分別根據(jù)吸附及解析實驗響應(yīng)面給出的最優(yōu)工藝組合進行驗證性實驗, 每組實驗平行進行3次, 取平均值進行比較。

表1 吸附實驗自變量因素編碼及水平

表2 解析實驗自變量因素編碼及水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗采用Design-Expert 8.0設(shè)計實驗?zāi)Ｐ? 結(jié)合SPSS17.0軟件對其數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 MAAs抗紫外輻射實驗

選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌兩種常用菌種, 將菌種進行活化培養(yǎng)處理。實驗前先進行預(yù)實驗驗證樣品本身是否對其兩種菌種正常生長有抑制作用, 再測定樣品體外抗輻射活性[17-18]。將一定濃度的MAAs樣品加入到已滅菌的生理鹽水中, 使用該生理鹽水作為稀釋液, 稀釋菌體濃度至106cfu/mL, 空白對照組使用不加樣品的生理鹽水稀釋菌體至相同濃度。吸取10 mL菌懸液在復(fù)合輻照光源下(UVA+ UVB, 離光源30 cm)分別照射0 s、30 s、1 min、2 min、5 min、10 min、20 min, 完成菌懸液的紫外損傷造模。隨后吸取菌懸液20mL涂布平板, 經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)3 d后, 平板計數(shù)測定活菌數(shù), 以輻照時間為橫坐標(biāo), 活菌個數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制菌種存活曲線圖, 從而比較MAAs樣品體外抗紫外輻射效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)動力學(xué)實驗篩選離子樹脂

圖1為不同型號樹脂靜態(tài)吸附及解析效果圖。由圖可知, 通過選取的SA-2、001*7、201*7、D61、D152 5種樹脂的靜態(tài)吸附及解析實驗, 綜合比較吸附及解析效果, 得到SA-2型陽離子樹脂為樣品MAAs純化選用樹脂。靜態(tài)吸附量為16.43 mg/g± 0.32 mg/g、吸附率達86.01%±3.04%; 靜態(tài)解析量為9.06 mg/g±0.92mg/g、解析率為56.63%±1.02%。吸附及解析作用較其他類型樹脂效果更佳。

2.2 SA-2型陽離子樹脂動態(tài)動力學(xué)條件優(yōu)化

2.2.1 動態(tài)吸附單因素優(yōu)化實驗

對SA-2型陽離子交換樹脂層析純化紫菜類菌孢素氨基酸進行動態(tài)單因素優(yōu)化實驗。在保持樣品上樣液體積為3BV, 上柱固定吸附時間為4 h的條件下, 研究上樣液質(zhì)量濃度、上樣流速、上樣液pH各因素對吸附率的影響。

當(dāng)樣品上樣液濃度達到3 g/L時, 樹脂達到最大吸附率, 此后增大上樣液濃度, 吸附率不再增大并呈緩慢降低趨勢(圖2)。在選擇上樣液流速在0.5~3 mL/min范圍內(nèi), 隨上樣液流速的增大, 樣品的吸附率呈明顯的下降趨勢(圖3)。調(diào)節(jié)上樣液pH在3~8的范圍內(nèi), 隨上樣液pH的升高, 吸附率呈先增加后降低趨勢(圖4)。其中, 上樣液pH為6時, 樣品吸附率最高。這可能是因為MAAs樣品本身是一種偏弱酸性的酚類, 在弱酸性環(huán)境下易被吸附。

綜合考慮, 選擇上樣樣品濃度為 3 g/L的粗提液為響應(yīng)面優(yōu)化實驗中心點, 分別調(diào)節(jié)上樣流速為0.5、1、1.5 mL/min, 調(diào)節(jié)上樣液pH為5、6、7作為中心組合, 進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗。

2.2.2 動態(tài)解析實驗優(yōu)化

選擇NH3·H2O溶液作為洗脫液, 在保持洗脫體積為6BV的條件下, 研究洗脫液質(zhì)量濃度、洗脫流速、洗脫液pH各因素對洗脫率的影響。

在控制洗脫液質(zhì)量濃度為2%~4%的濃度范圍內(nèi), 隨洗脫液體積分?jǐn)?shù)的增加, 洗脫效果呈先增加后降低趨勢(圖5)。這可能是因為MAAs樣品本身呈弱酸性, 易在弱酸性環(huán)境中與樹脂結(jié)合吸附, 使用弱堿性的洗脫液易將其解析, 而隨堿性增強, 解析下的MAAs樣品在堿性環(huán)境中可發(fā)生部分降解[7], 所以出現(xiàn)解析率下降的情況。在控制洗脫流速為0.5~3 mL/min的范圍內(nèi), 隨洗脫流速的增加, 樣品的解析率呈明顯的下降趨勢(圖6)。調(diào)節(jié)洗脫液pH 在2~8的范圍內(nèi), 當(dāng)洗脫液的pH增大時, 洗脫率呈先增加后降低趨勢(圖7)。

綜合考慮, 選擇洗脫液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的洗脫液作為響應(yīng)面實驗中心點。保持洗脫液pH為5、6、7, 選擇洗脫流速范圍為 0.5~1.5 mL/min作為中心組合, 進行響應(yīng)面實驗優(yōu)化實驗。

2.2.3 動態(tài)吸附實驗響應(yīng)面模型的分析

在對SA-2型陽離子樹脂純化MAAs樣品的單因素實驗基礎(chǔ)上, 采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計動態(tài)吸附優(yōu)化實驗, 實驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

表3 SA-2型陽離子樹脂動態(tài)吸附優(yōu)化實驗設(shè)計與結(jié)果

對表3中SA-2樹脂動態(tài)吸附響應(yīng)面優(yōu)化數(shù)據(jù)進行多元回歸分析: 得到關(guān)于SA-2型陽離子樹脂對MAAs樣品吸附率的二次多項式回歸模型方程為:(%)=78.76–0.095–0.22–2.41–0.13+0.45+0.70–1.702–1.332–4.032。

對動態(tài)吸附實驗?zāi)Ｐ瓦M行方差分析: 分析結(jié)果見表4, 由表可知, 模型=104.78>0.01, 模型<0.000 1,表明實驗回歸模型極顯著;失擬=2.49<0.05(9.3), 失擬項=0.1993>0.05, 表示模型的失擬度不顯著, 模型矯正系數(shù)2Adj=0.983 2, 這說明有98.32%的響應(yīng)值能用該模型來解釋, 僅有1.68%的變異無法解釋此模型。模型的復(fù)相關(guān)數(shù)2=0.992 6這進一步說明模型擬合優(yōu)度好。

表4 吸附實驗回歸模型方差分析

注 : *差異顯著,<0.05; **差異極顯著,<0.01.下同

表5 吸附試驗回歸模型各因素顯著性檢驗

對動態(tài)吸附實驗建立回歸模型并對其各因素的顯著性進行檢驗, 檢驗結(jié)果見表5。由表可知, 模型中一次項, 二次項2、2、2以及交互項對吸附率有極顯著影響, 其余各因素影響不顯著(>0.05)。根據(jù)模型數(shù)據(jù)分析可知, 三因素對吸附率的影響因素順序依次為:>>, 吸附優(yōu)化工藝為: 上樣液質(zhì)量濃度3 g/L、上樣流速為1.5 mL/min、上樣液pH為6。此時, 吸附效率最佳, 吸附率達79.21%。模型優(yōu)化后回歸方程為:

(%)=–50.20800+4.26600+2.37450+43.68675

–0.26000+0.45000+1.39500

–1.700252–5.331002–4.032752

圖8為上樣流速與上樣液pH兩因素交互作用對吸附率影響的響應(yīng)面及等高線圖。由圖可知, 曲面在上樣液質(zhì)量濃度一定的情況下, 對上樣流速與上樣液pH兩因素對吸附率的影響, 兩因素的作用因素極顯著(<0.01)。在上樣液pH一定的前提下, 上樣流速在0.51.5 mL/min范圍內(nèi)變化時樣品吸附率值隨上樣流速的增大呈增大趨勢, 上樣流速為1.5 mL/min時, 樣品吸附率達到最大值; 當(dāng)上樣流速控制一定時, 隨著上樣液pH的增大, 樣品吸附率響應(yīng)值呈先增大后減小的趨勢, 在pH為5~7范圍內(nèi), 取得最大值。通過吸附模型方程的逆矩陣得到吸附率最大預(yù)測值為78.76%, 在此條件下的最佳優(yōu)化工藝為: 上樣液質(zhì)量為3 g/L、上樣流速為1.5 mL/min、上樣液pH為6。使用該優(yōu)化條件下做驗證性實驗, 得到吸附率79.21%±1.02%。而這與預(yù)測值僅相差了0.45%,據(jù)此說明該模型可信度高。

2.2.4 動態(tài)解析實驗響應(yīng)面模型的分析

在對SA-2型陽離子樹脂純化MAAs樣品的單因素實驗基礎(chǔ)上, 采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計解析響應(yīng)面實驗?zāi)Ｐ蚚15]。綜合考察各因素間的相互影響并優(yōu)化純化解析工藝。響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果見表6。

對表6中SA-2樹脂動態(tài)解析響應(yīng)面優(yōu)化數(shù)據(jù)進行多元回歸分析: 得到關(guān)于SA-2型陽離子樹脂對MAAs樣品吸附率的二次多項式回歸模型方程為:

(%) =62.76–4.88–2.56+2.85–2.82+0.32

+2.48–12.212–2.502–5.872

對動態(tài)解析實驗?zāi)Ｐ瓦M行方差分析: 分析結(jié)果見表7, 由表可知, 模型=25.12>0.01, 模型< 0.0002, 表明實驗回歸模型極顯著;失擬=2.69<0.05(9.3),失擬項=0.1818>0.05, 表示模型的失擬度不顯著。模型矯正系數(shù)2Adj0.9322, 這說明有93.22%的響應(yīng)值能用該模型來解釋, 僅有6.78%的變異無法解釋此模型。模型的復(fù)相關(guān)數(shù)2=0.9703, 這進一步說明模型擬合優(yōu)度好。

表6 SA-2型陽離子樹脂動態(tài)解析優(yōu)化實驗設(shè)計與結(jié)果

表7 解析實驗回歸模型方差分析

注 : 復(fù)相關(guān)系數(shù)2=0.9703; 模型矯正系數(shù)2Adj=0.9322; 信噪比=14.739

表8為對解析模型進行的顯著性檢驗, 實驗結(jié)果如表所示: 模型中一次項、二次項2、2、2以及交互相對解析率有極顯著影響。其余項的影響均不顯著。各因素對樣品解析率的影響順序為: 洗脫液pH>洗脫液流速>洗脫液質(zhì)量濃度。模型回歸方程為:

%=62.76–2.41+0.7–1.72–1.332–4.032

圖9為洗脫流速()和洗脫液pH()對解析率影響交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖, 實驗結(jié)果如圖所示, 在洗脫液質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為3%不變的情況下, 洗脫流速在0.5~1.5 mg/mL時, 隨著洗脫流速的增大, 洗脫液對樣品MAAs的解析率呈下降趨勢, 當(dāng)洗脫流速保持不變時, 隨著洗脫液pH的增大, 樣品MAAs的解析率呈先增大后緩慢減小趨勢。

采用Design-Expert 8.0 軟件計算模型方程的逆矩陣, 得到樣品解析率的最大預(yù)測值為65.21%, 此時最佳工藝條件為: 洗脫液體積分?jǐn)?shù)為3%, 洗脫流速為1 g/L, 洗脫液pH為7。選取該工藝條件進行驗證性實驗, 得到樣品MAAs的解析率為64.02%±1.27%, 與預(yù)測值相比, 相對誤差僅為1.19%。說明該工藝條件下解析實驗回歸模型有效。

2.3 MAAs化合物抗紫外輻射活性分析

實驗選用大腸桿菌及金黃色葡萄球菌進行紫外輻照模型, 實驗前首先對MAAs樣品本身是否具有抑菌作用進行驗證性實驗, 實驗結(jié)果見表9。

由表9統(tǒng)計結(jié)果可知, 將MAAs樣品加入到生理鹽水中作為稀釋液涂布大腸桿菌、金黃色葡萄球菌中, 培養(yǎng)48 h后計數(shù)活菌個數(shù)。與對照組相比活菌數(shù)無顯著性差異(>0.05)。說明MAAs化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌本身均無顯著抑制作用, 可進行后續(xù)實驗。

圖10為大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的存活曲線圖。由圖可知, 隨著紫外輻照時間的延長, 大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的存活率顯著降低。而添加了一定濃度MAAs的樣品組較空白對照組相比, 在相同輻照劑量的情況下, 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的存活率明顯高于空白對照組。例如: 以輻照時間10 min為例, MAAs樣品組較空白對照組而言, 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌種存活率分別提高了39.10%、40.58%。由此可知, 樣品MAAs可以有效抑制紫外輻射而造成的損傷, 延緩菌種的失活速度。這可能是由于類菌孢素氨基酸這類物質(zhì)在紫外中波長段UVA (320~400 nm)處及中波長段UVB (275~320 nm)處具有天然的紫外吸收作用, 從而有效的抵抗紫外線的輻射作用[17-18]。這與葉翠芳等人研究的類孢菌素氨基酸具有抗紫外輻射活性作用結(jié)果相一致[19-20]。

表8 解析試驗回歸模型各因素顯著性檢驗

注 : *差異顯著,<0.05; **差異極顯著,<0.01

表9 MAAs對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌作用

注 :>0.05, 差異無顯著性

3 結(jié)論

(1) 本文通過靜態(tài)動力學(xué)比較5種樹脂的吸附率解析率, 篩選出SA-2型陽離子樹脂作為純化紫菜類菌孢素氨基酸MAAs的最佳樹脂。

(2) 采用Design Expert 8.0軟件設(shè)計了SA-2型陽離子樹脂純化MAAs的動態(tài)動力學(xué)吸附于解析工藝模型并優(yōu)化了工藝條件, 對各因素間的交互影響作用建立二次多項式數(shù)學(xué)模型, 通過響應(yīng)面和等高線交互分析確定: 各因素對吸附率的影響因素順序為: 上樣液pH>上樣流速>上樣液質(zhì)量濃度; 吸附的最佳工藝條件為: 上樣液質(zhì)量濃度為3 g/L、上樣流速為1 mL/min、上樣液pH為6的條件下吸附率達79.21%。各因素對解析率的影響因素順序為: 洗脫液pH>洗脫流速>洗脫液體積分?jǐn)?shù); 解析最佳工藝條件為洗脫液體積分?jǐn)?shù)為3%的氨水、洗脫流速為1.5 mL/min、洗脫液pH為6, 在此條件下, 解析率可達64.02%。

(3) 經(jīng)SA-2樹脂純化后的MAAs樣品用于大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的體外抗紫外輻射實驗, 對比在相同輻射劑量處理后菌種的存活率可知, 紫菜中MAAs化合物能有效緩解因紫外線造成的損傷, 具有顯著的抵抗紫外輻射活性。

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Optimization of purification process ofmycosporine-like amino acid fromand study on its anti- ultraviolet activity

YING Rui, ZHANG Zhao-hui, DUAN Xiao-shan, ZHAO Xue, HOU Hu, LI Ba-fang

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266023, China)

Objective: To explore the optimal techniques in the separation of mycosporine-like amino acids (MAAs) inwith cation-exchange resins and the study on its anti-ultraviolet activity after purification.Method: In the screening cation-exchange resin through the static adsorption and desorption analytical experiment, response-surface methodology was employed to establish a mathematical regression model with the dynamic adsorption and desorption in the single-factor experiments for SA-2. The ultraviolet-radiation models (UVA and UVB) when compared with blank samples showed that the survival rates of the MAAs groups ofandincreased; this proved that the MAAs after purification had certain anti-ultraviolet activity.Result: SA-2 was found to be the most suitable resin for the mycosporine-like amino acid purification; the obtained adsorption and desorption rates were 86% and 56.63%, respectively. The optimum conditions for the purification were obtained when the sample containing 3 g/L MAAs at pH 6 was mounted onto a column at a flow rate of 1 mL/min; further, it was eluted with 3% ammoniumhydroxide to pH 6 at a flow rate of 1.0 mL/min. The purification process yielded an adsorption and desorption rate of 79.21% and 64.02%, respectively. After the purification of MAAs sample, it had significant resistance to the ultraviolet radiation and the deactivation rate for.and.decreased to 39.10% and 40.58%, respectively.

; mycosporine-like amino acids; SA-2 resin; purification; response surface; ultraviolet-resistant activity

TS201.2

A

1000-3096(2017)02-0071-10

10.11759/hykx20160811002

2016-08-11;

2016-11-26

國家自然科學(xué)基金(31272705); 海洋公益性行業(yè)科研專項(201505022-5)

應(yīng)銳(1989-), 女, 研究生, 研究方向: 海洋活性物質(zhì), 電話: 18765998051, Email: yingruiouc@163.com ; 張朝輝(1968-), 通信作者, 男, 副教授, 研究方向: 水產(chǎn)化學(xué)、海洋生物活性成分及水產(chǎn)品加工, Email: zhangzhh@ouc.edu.cn

Aug.11, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No.31272705; Public Science and Technology Research Funds projects of ocean, No.201505022-5]

(本文編輯: 康亦兼)