郭文捷, 趙 瑾, 齊宏濤, 姜 鵬, 李富超, 李榮貴

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南海冷泉區(qū)貽貝()附生菌的分離培養(yǎng)與多樣性分析

郭文捷1, 2, 3, 趙 瑾2, 3, 齊宏濤1, 姜 鵬2, 3, 李富超2, 3, 李榮貴1

(1. 青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室, 山東青島 266071; 2. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋生物學(xué)重點實驗室, 山東青島 266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室, 山東青島 266071)

以采集后適應(yīng)培養(yǎng)0~24 h 以及添加甲烷和硫化鈉培養(yǎng)24~240 h的南海冷泉區(qū)深海貽貝()為材料, 取其鰓部, 分析附生菌的多樣性與適應(yīng)性變化狀況。共分離鑒定出貽貝附生菌270 株, 對菌株的16S rDNA進(jìn)行聚類分析, 結(jié)果表明所分離菌株主要分布在4個門, 21個屬, 其中變形菌的數(shù)量最多且多樣性高。分析發(fā)現(xiàn)原位新采集的貽貝鰓部附生菌的多樣性較高, 6 h后附生菌的多樣性明顯降低。分別添加甲烷和硫化鈉對深海貽貝進(jìn)行培養(yǎng), 甲烷組與碳代謝有關(guān)的假單胞菌的數(shù)量逐漸增多, 且在甲烷組240 h中發(fā)現(xiàn)2株食烷菌屬菌株。硫化鈉組的芽孢桿菌屬所占比例升高。此外還發(fā)現(xiàn)4株潛在的新種。本研究實現(xiàn)了深海冷泉區(qū)貽貝的實驗室培養(yǎng), 并對貽貝鰓部附生菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析, 豐富了海洋極端環(huán)境微生物資源庫, 并為深入解析貽貝與其附生菌之間的相互作用關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

南海; 冷泉區(qū); 貽貝; 附生菌; 多樣性

冷泉(cold seep)是由于海底天然氣滲漏, 富含水、碳?xì)浠衔?甲烷和石油)、硫化氫等化合物的流體在大陸邊緣海底噴溢形成[1], 海底冷泉的溫度與周邊海水溫度相近。對深海冷泉生態(tài)系統(tǒng)的研究是繼20世紀(jì)末對熱液生態(tài)系統(tǒng)研究熱潮以來的又一個重要領(lǐng)域[2]。冷泉區(qū)繁衍著管狀蠕蟲、蛤類、貽貝類、海星、海膽、海蝦、珊瑚等生物[3]。這些生物的體內(nèi)和體表存在大量的微生物, 微生物與宿主之間具有高度相互依賴的共附生關(guān)系[4]。共附生微生物參與宿主的物質(zhì)吸收和能量代謝過程, 可為宿主提供營養(yǎng)物質(zhì)或清除宿主體內(nèi)的有害代謝產(chǎn)物[5], 具有多種特殊的功能基因和酶, 是一種很有潛力的生物資源。

貽貝是深海冷泉區(qū)廣泛分布的海洋無脊椎動物, 屬于軟體動物門, 雙殼綱。目前已有人對貽貝內(nèi)共生菌進(jìn)行了研究。Duperron等[6]利用16S rRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析以及FISH的方法對墨西哥灣冷泉區(qū)貽貝內(nèi)共生菌進(jìn)行多樣性分析, 結(jié)果表明貽貝內(nèi)共生菌主要包括硫氧化菌和甲烷氧化菌。這些共生菌可以將環(huán)境中的硫化物和甲烷轉(zhuǎn)化為貽貝所需要的營養(yǎng)物質(zhì)[7-9]。但目前對貽貝附生菌的研究尚為空白, 對于共生菌群落結(jié)構(gòu)與化學(xué)環(huán)境之間的關(guān)系以及響應(yīng)機(jī)制也缺乏針對性的研究。

本研究首先實現(xiàn)了深海冷泉貽貝的實驗室培養(yǎng), 并對其鰓部附生菌進(jìn)行了分離純化, 通過16S rDNA 序列分析, 對分離得到的附生菌進(jìn)行了多樣性分析。進(jìn)一步將所采集的貽貝置于不同的化學(xué)刺激條件下, 分析附生菌群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。為深入解析貽貝與其附生菌之間的相互作用關(guān)系, 以及對深海新基因、新化合物的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)[5]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

樣品于2014年4月“科學(xué)”號冷泉調(diào)查航次獲得, 由“發(fā)現(xiàn)”號ROV采集。采樣點位于臺灣西南的南海冷泉區(qū)(22°06′57.144″N, 119°17′6.580″E), 水深1 113 m(圖1[10])。貽貝取回甲板后, 放入過濾海水中, 適應(yīng)0、6、12、24 h后分別取貽貝的鰓。適應(yīng)24 h 后開展現(xiàn)場培養(yǎng)實驗?，F(xiàn)場培養(yǎng)實驗分為甲烷組和硫化鈉組。其中甲烷實驗組每天充甲烷0.5 h, 用過濾海水培養(yǎng); 硫化鈉實驗組母液質(zhì)量濃度為25 g/L,蠕動泵按50 μL/min添加。對照組直接用過濾海水培養(yǎng)?，F(xiàn)場培養(yǎng)24、72和240 h分別取貽貝的鰓。本研究中深海冷泉區(qū)貽貝為深海偏頂蛤()[10]。

1.2 菌株的分離與培養(yǎng)

在厭氧培養(yǎng)箱中將凍存管中貽貝的鰓用滅菌海水200mL 洗滌5次, 然后分別取50mL 均勻涂布在2216E、HM、142-A、M1四種海水培養(yǎng)基上, 培養(yǎng)基配方見表1。然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1~7 d。挑取不同形態(tài)單菌落至對應(yīng)的固體平板, 劃線純化、保種。

1.3 DNA提取及16S rDNA序列聚類分析

DNA提取采用的是CTAB法[11]進(jìn)行總DNA提取。16S rDNA的擴(kuò)增參照Li等[12]的方法, 所用引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR 反應(yīng)體系: Dream Taq Green PCR Master Mix(2x)(Thermo 公司), 20mL; 引物27F(10mmol/L)、1 492R(10mmol/L), 各2mL; 模板, 2mL; dd H2O補(bǔ)足40mL體系。PCR 反應(yīng)程序: 預(yù)變性 94℃ 10 min; 之后為30個循環(huán): 變性 94℃ 50 s, 退火55℃ 50 s, 延伸 72℃ 1 min 30 s,最后72℃, 5 min。

表 1 培養(yǎng)基的組成

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海桑尼進(jìn)行16S rDNA序列測定。將得到的序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對。將GenBank中獲得的海洋來源的海水、沉積物以及魚、珊瑚等動物的高同源性序列作為參考序列。然后利用Clustal X軟件[13]進(jìn)行比對分析, 截齊后應(yīng)用MEGA 4.0[14]軟件, 采用鄰位相接法[15](Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 進(jìn)行菌株的聚類及系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貽貝附生菌多樣性的分析

本研究共分離得到270 株純培養(yǎng)的深海貽貝附生細(xì)菌(表2)。經(jīng)16S rDNA 序列聚類分析, 如圖2所示, 所分離的菌株分屬于變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)4個門, 21個屬。

在門水平上, 變形菌門的菌株在分離菌株中占大部分(243株, 90%)。其次是厚壁菌門(21株, 8%), 放線菌門(3株, 1%), 擬桿菌門(3株, 1%)。Lampert等[16]對珊瑚可培養(yǎng)的共附生菌多樣性的研究中, 共分離得到24株細(xì)菌, 其中γ變形菌占35%, 是珊瑚共附生菌的優(yōu)勢類群。Webster等[17]對海綿的34株相關(guān)共附生菌的研究中, 發(fā)現(xiàn)γ變形菌占41%。陳忠等[3]對海膽可培養(yǎng)的共附生微生物多樣性的研究中, 共分離到31個菌株, 其中γ變形菌占分離菌株的大部分(20株, 65%)。本研究結(jié)果也表明γ變形菌是貽貝附生菌的優(yōu)勢類群, 這與其他海洋無脊椎動物的共附生細(xì)菌具有相似之處。

表 2 深海貽貝附生菌的信息表

注: 菌種編號后的數(shù)字代表同一處理組同一培養(yǎng)基分離的菌株數(shù)目, 只分離到一株的, “1”省略

Note: The figure behind the strain ID indicates the number of bacteria strains isolated from the same sample by using the same medium. When there is only one strain isolated, “1” is omitted

在屬的水平上, 假交替單胞菌屬占比例最高。假交替單胞菌屬能夠生存在貧營養(yǎng)的海洋環(huán)境中, 在多數(shù)情況下它們附生于海鞘、甲殼動物、珊瑚、無脊椎動物幼蟲等表面。這種附生關(guān)系有助于我們研究微生物與宿主之間相互作用的機(jī)制[18]。

在所分離的菌株中, 發(fā)現(xiàn)有4個菌株(CS083、CS395、CS578、CS650)的16S rDNA序列與GeneBank中已有序列比對的相似性低于97%, 可能是新種(圖2)。在這4個潛在新種中, CS083分離自適應(yīng)性培養(yǎng)0 h組, 屬于厚壁菌門, 與分離自海洋細(xì)菌的sp. B20Ydz-xm的16S rDNA 部分序列相似度最高, 相似性為96%, 可能是芽孢桿菌屬的一個潛在新種。CS395、CS578和CS650均屬于變形菌門。其中CS395是分離自適應(yīng)性培養(yǎng)12 h 組, 與來自珊瑚中sp.PmeaMuc1的16S rDNA 部分序列相似度為96%; CS578是分離自現(xiàn)場培養(yǎng)實驗中硫化鈉24 h組, 與從海水中分離出的sp.anaA.si.2 的16S rDNA 部分序列相似度為93%; CS650菌株是分離自現(xiàn)場培養(yǎng)實驗中甲烷72 h組, 它與分離自海洋細(xì)菌中的sp. ERGCD 的16S rDNA 部分序列相似度為97%。后續(xù), 我們將參照Colwell提出的多相分類學(xué)[19]方法對這4株潛在新種進(jìn)行物種鑒定, 并分析其生態(tài)功能及與貽貝之間的相互作用關(guān)系。

2.2 適應(yīng)性培養(yǎng)過程中貽貝附生菌群落結(jié)構(gòu)的變化

將深海冷泉區(qū)采集的貽貝在實驗室可控條件下進(jìn)行培養(yǎng)。原位新鮮采集的貽貝的鰓部附生菌多樣性較高, 所占比例最多的門為變形菌門, 所占比例最多的屬為假交替單胞菌屬。適應(yīng)性培養(yǎng)6 h后, 貽貝的鰓部附生菌的多樣性明顯降低(圖3)。

現(xiàn)場培養(yǎng)實驗的甲烷組中, 隨著甲烷處理時間的延長, 假交替單胞菌屬所占比例逐漸減少, 而與碳分解過程相關(guān)的假單胞菌屬的比例逐漸增多[20-21]。在甲烷組240 h 中發(fā)現(xiàn)2株食烷菌屬的菌株, 該屬能夠以直鏈和支鏈的烷烴為唯一的碳源和能源, 該屬是海洋專性烷烴降解菌, 可以用于治理海洋中的石油污染[22]。在硫化鈉組24~240 h, ?？曝愄厥暇鷮?)和芽孢桿菌屬的數(shù)量逐漸增多, 而且芽孢桿菌屬在硫化鈉240 h組達(dá)到最多, 芽孢桿菌通過自養(yǎng)亞硝化和自養(yǎng)反硝化的脫氮作用, 將含氮有機(jī)物轉(zhuǎn)化成貽貝吸收利用的小分子物質(zhì), 從而促進(jìn)貽貝的生長與繁殖[23](圖4)。

3 結(jié)論

本研究對南海冷泉區(qū)貽貝鰓中附生菌進(jìn)行分離培養(yǎng)與鑒定, 初步的實驗結(jié)果顯示貽貝附生菌包括4個門21個屬, 附生菌多樣性高。其中變形菌門在所有門類中所占比例最高。在適應(yīng)培養(yǎng)過程中, 原位新鮮采集的貽貝的鰓部附生菌多樣性較高, 培養(yǎng)6 h后, 貽貝的鰓部附生菌的多樣性明顯降低?，F(xiàn)場培養(yǎng)過程中, 隨著甲烷處理時間的延長, 與碳分解過程相關(guān)的假單胞菌屬的比例增多。在硫化鈉處理組24~240 h, ?？曝愄厥暇鷮俸脱挎邨U菌屬的數(shù)量逐漸增多, 而且芽孢桿菌屬在硫化鈉240 h 組達(dá)到最多。另外, 本研究純化得到了2株可開發(fā)用于治理海洋石油污染的食烷菌屬菌株, 并發(fā)現(xiàn)了4株潛在的深海微生物新種, 為深海極端環(huán)境微生物新資源的發(fā)掘和利用奠了基礎(chǔ)。

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Isolation and phylogenetic analysis of epiphytic bacteria from mussels collected from the cold seep

GUO Wen-jie1, 2, 3, ZHAO Jin2, 3, QI Hong-tao1, JIANG Peng2, 3, LI Fu-chao2, 3, LI Rong-gui1

(1. Laboratory of Molecular Biology, College of Life Sciences, Qingdao University, Qingdao 266071, China; 2. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3. Laboratory of Marine Biology and Biotechnology, National Laboratory of Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China)

Epiphytic bacteria play an important role in substance absorption and metabolism of mussels. Gills of mussels in different experimental groups were collected at different times, and the epiphytic bacteria were cultured and separated. A total of 270 strains were obtained. Four strains, which might be new species, were discovered. The diversity of epiphytic bacteria decreased sharply in 6 h sterile-seawater cultivation. In the methane treatment group, the number ofincreased gradually. In the group treated with Na2S,associated with sulfur circulation increased gradually. It is important to study the interaction between mussels and epiphytic bacteria and to explore the biological resources in extreme deep sea environments.

South China Sea; cold seep; mussel; epiphytic bacteria; diversity

Q938

A

1000-3096(2017)02-0089-07

10.11759/hykx20160930003

2016-09-30;

2017-01-06

中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(XDA11030404); 國家自然科學(xué)基金(31300365)

郭文捷(1991-), 女, 山東聊城人, 碩士, 主要從事深海極端環(huán)境微生物群落多樣性研究, 電話: 17854299753, E-mail: 17854299753@ 163.com。通信作者: 李富超, 053282898500, lifuchao@qdio.ac.cn

Sep.30, 2016

[Special Fund for Strategic Leading Science and Technology Chinese Academy of Sciences, No.XDA11030404; National Natural Science Foundation of China, No.31300365]

(本文編輯: 張培新)