廖 健, 龍水生, 賀 亮, 郭昱嵩, 劉楚吾, 劉 麗, 王中鐸

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基于基因和D-loop區(qū)部分序列比較雷州半島東、西岸湖棲鰭蝦虎魚群體的遺傳多樣性

廖 健, 龍水生, 賀 亮, 郭昱嵩, 劉楚吾, 劉 麗, 王中鐸

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點實驗室, 廣東湛江524025)

為比較分析雷州半島東、西兩岸湖棲鰭蝦虎魚()遺傳差異, 以基因和D-loop區(qū)部分序列為分子標記, 獲取雷州半島湖棲鰭蝦虎魚群體序列44條(九龍山群體21條, 高橋群體23條)、D-loop序列53條(九龍山群體25條, 高橋群體28條)?；诨虿糠中蛄蟹治鼋Y(jié)果顯示: 619 bp的44條序列中, 統(tǒng)計的變異位點29個; T、C、A、G堿基組成分別為: 27.8%、31.0%、23.7%、17.5%, 且A + T(51.5%)高于C + G(48.5%); 單倍型多樣性比較, 九龍山群體(0.695)>高橋群體(0.324); 遺傳分化分析表明東、西群體分化顯著(= 0. 0.591, 0.01 << 0.05), 基因流()為5.37, 遺傳分化系數(shù)()為0.147, 固定指數(shù)()為0.042(0.001<<0.01), 核苷酸差異數(shù)()為2.547, 核苷酸歧義度()為0.004。而基于D-loop區(qū)部分序列分析結(jié)果表明: 563 bp的53條序列中, 變異位點133個; T、C、A、G堿基組成分別為: 32.3%、14.8%、35.5%、17.4%, A + T(67.8%)明顯高于C + G(32.2%); 單倍型多樣性與分析結(jié)果類似, 九龍山群體(0.797)>高橋群體(0.661); 遺傳分化分析表明東、西群體分化極顯著(= 0.970,< 0.001),為0.315(<0.001),值為0.55,、分別為: 0.157、3.506、0.006; AMOVA分析揭示群體內(nèi)變異程度高于群體間; 聚類分析表明, 基于基因與D-loop區(qū)部分序列構(gòu)建的鄰位鏈接法聚類樹(NJ樹)均存在按照采樣點聚類的現(xiàn)象, 但D-loop更為明顯。綜上, 雷州半島東、西兩岸湖棲鰭蝦虎魚群體出現(xiàn)較為明顯的分化現(xiàn)象。

; D-loop; 湖棲鰭蝦虎魚(); 雷州半島群體; 遺傳分化

湖棲鰭蝦虎魚()隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、蝦虎魚科(Gobiidae)、鰭蝦虎魚屬(), 是暖水性的小型底棲魚類, 無經(jīng)濟價值。其頭、體呈透明狀, 經(jīng)體積分數(shù)為5%的甲醛溶液浸泡后呈現(xiàn)乳白色。成熟個體約為2 cm, 據(jù)FishBase(http: //www.fishbase.org. cn/search.php)記載最長記錄為2.4 cm, 雌魚個體通常較雄魚大。已有文獻及FishBase記載, 目前該物種僅發(fā)現(xiàn)于菲律賓呂宋島的淡水湖泊中, 為該地區(qū)特有種[1]?！吨袊鴦游镏尽酚补囚~綱、鱸形目、蝦虎魚亞目中表明產(chǎn)于中國的鰭蝦虎魚屬僅1種, 即大鱗鰭蝦虎魚()[2]。廖健[3]和柏琴[4]調(diào)查發(fā)現(xiàn)在中國雷州半島沿岸紅樹林海區(qū)及河口地帶可以采集到鰭蝦虎魚屬的湖棲鰭蝦虎魚[3-4]。鑒于日益惡化的全球水域環(huán)境及現(xiàn)有的紅樹林資源狀況, 結(jié)合湖棲鰭蝦虎魚特殊的形態(tài)特征: 魚體終生呈透明狀, 內(nèi)部器官結(jié)構(gòu)清晰可見, 且廣泛存在于雷州半島紅樹林海區(qū), 是篩選雷州半島地方性水域環(huán)境監(jiān)測物種的優(yōu)質(zhì)魚類之一。

線粒體基因組(mtDNA)是脫離于核基因之外的遺傳物質(zhì)之一, 其結(jié)構(gòu)類似于原核生物, 呈環(huán)狀, 具有結(jié)構(gòu)簡單、分子片段短、進化速率較核DNA快、遵循母系遺傳等特征[3, 5-6]。細胞色素氧化酶I基因()位于線粒體DNA中, 是線粒體基因組13種氨基酸編碼序列之一, 受到較大的選擇壓力, 進化速率適中[7]。近十年來,被廣泛應(yīng)用于物種分類及種內(nèi)種間遺傳分化研究。D-loop區(qū)又稱控制區(qū), 是mtDNA上變異頻率較高的一段區(qū)域, 不參與氨基酸的編碼, 選擇壓力處在較低水平, 為線粒體基因組進化速率最快的區(qū)域[8]。D-loop區(qū)也是研究群體多樣性及系統(tǒng)進化的優(yōu)質(zhì)分子標記, 受到了越來越多的群體遺傳研究者的關(guān)注。

目前, 對于湖棲鰭蝦虎魚的研究, 國內(nèi)外僅局限于資源調(diào)查及分類工作[1]。柏琴發(fā)現(xiàn)湖棲鰭蝦虎魚為雷州半島東部紅樹林海區(qū)的優(yōu)勢物種[4]。本研究在此基礎(chǔ)上, 分別以基因、D-loop區(qū)部分序列作為分子標記進一步探討湖棲鰭蝦虎魚雷州半島東部九龍山群體與西部高橋群體之間的遺傳結(jié)構(gòu)及分化情況。從而為湖棲鰭蝦虎魚的種質(zhì)資源保護及合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

實驗用魚利用孔徑149mm的手抄網(wǎng)分別采集于雷州半島東岸的九龍山紅樹林國家濕地公園(N20°39￠51, ” E110°17'13")及西岸的高橋紅樹林保護區(qū)(N21°36'24, ” E109°47'8"), 見圖1。其中用于擴增的44個樣本(高橋群體23尾, 體長在1.15~ 2.05 cm;九龍山群體21尾, 體長在1.38~2.16 cm)采集于2014年4月~2015年4月, 用于D-loop擴增的53個樣本(高橋群體28條, 體長在0.86~2.08 cm; 九龍山群體25條體長在0.95~2.18 cm)采集于2015年8~11月, 采集的樣本利用體積分數(shù)75%的乙醇保存分裝至2 mL EP管后帶回實驗室?40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取、擴增及測序

每個樣本剪取0.5 g肌肉進行基因組DNA的提取, 采用傳統(tǒng)苯酚-氯仿法進行反復(fù)抽提[9]。沉淀的DNA干燥處理后, 溶于50 μL TE緩沖液中?；虻臄U增引物采用硬骨魚類通用引物, Fish F, 5￠-TC AACCAACCACAAAGACAATGGCAC-3￠; Fish R, 5￠- TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3￠[10]。D-loop區(qū)序列擴增參照宋娜等報道的引物序列, Dloop F: 5￠-CCCATCTCTAGCTCCCAAAGC-3￠; Dloop R: 5￠- CTGTAGAGTGAACGCTTGGCATG -3￠[11]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR體系中10× Buffer(含Mg2+)2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、5 μmol/L引物各1 μL、DNA模板1 μL、500 u/L Taq DNA聚合酶0.2 μL, 補充滅菌ddH2O至25 μL?；虻腜CR程序設(shè)置為: 94℃ 1 min 20 s; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 50 s, 35個循環(huán); 72℃ 5 min; 4℃保存。D-loop擴增程序: 94℃ 1 min 20 s, 94℃ 30 s, 54℃ 30 s, 72℃ 50 s, 循環(huán)35次, 72℃ 10 min, 4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測后寄至上海生工生物有限公司進行序列測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測序返回數(shù)據(jù)經(jīng)MEGA6.0進行多序列比對, 人工校正后, 統(tǒng)計變異位點數(shù)、單一突變位點、簡約信息位點、堿基組成、Kimura 2-parameter遺傳距離[12], 利用Modeltest確定最適合的進化模式[13], 鄰位連接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, Bootstrap 置信值重復(fù)抽樣1 000次, 若轉(zhuǎn)換/顛換比值小于2, 另需利用DAMBE進行替代飽和性檢驗, 構(gòu)建進化樹前進行加權(quán)[14]。單倍型數(shù)目、單倍型多樣性、核苷酸多樣度、平均核苷酸差異以及中性檢驗的Tajima’D及Fu - Li D值的統(tǒng)計利用DnaSP v5完成[15], 近鄰統(tǒng)計、Lei模型基因流、遺傳分化系數(shù)、固定指數(shù)、核苷酸差異數(shù)、核苷酸歧義度均由DnaSP v5中基因流和遺傳分化估算得到[16], 分子方差分析(AMOVA)由DnaSP v5分組處理而后由Arlequin3.2.2.5統(tǒng)計得到。

2 結(jié)果分析

2.1 序列分析

基于基因的序列分析結(jié)果表明, 測序所得序列經(jīng)Mega6.0序列比對、人工校正后所得序列長619 bp, 分別與NCBI及BOLD數(shù)據(jù)庫進行比對, 相似度均在98%~100%。分析44條序列結(jié)果顯示, 619 bp中變異位點數(shù)為29個, 包含單一突變位點9個, 簡約信息位點20個。T、C、A、G堿基組成分別為: 27.8%、31.0%、23.7%、17.5%, 其中A + T(51.5%)高于C + G(48.5%), 且堿基在密碼子第1、2和3位的分布并不均勻, 呈現(xiàn)一定的偏倚性, 其中堿基T明顯偏向第1位(41%), 堿基G則在第3位出現(xiàn)頻率最高(29.7%)(表1); 基于D-loop區(qū)序列分析結(jié)果表明, 563bp中變異位點133個, 單一突變位點117個, 簡約信息位點16。T、C、A、G堿基組成為: 32.3%、14.8%、35.5%、17.4%, 同樣A + T(67.8%)高于C+G (32.2%), D-loop區(qū)序列4種堿基在密碼子的1, 2和3位分布較為均勻, 沒有出現(xiàn)明顯的偏倚性。所得序列上傳至GenBank獲取登錄號: KU900420- KU900437, KU900440-KU900465, D-loop區(qū)登錄號為: KU900367-KU900419。

表1 基于COI基因和D-loop部分序列的堿基組成(%)

2.2 遺傳變異

湖棲鰭蝦虎魚兩個群體的基因及D-loop區(qū)部分序列的遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示(表2), 基于基因的44條序列總的單倍型比例、單倍型多樣性、核苷酸多樣度、平均核苷酸差異分別為: 20.45%、0.590、0.004、2.468。基于D-loop區(qū)的53條序列總的單倍型比例、單倍型多樣性、核苷酸多樣度、平均核苷酸差異分別為: 30.19%、0.863、0.005、2.946。

表2 基于COI基因及D-loop區(qū)部分序列的高橋與九龍山群體遺傳多樣性參數(shù)

遺傳分化、基因流表明, 基于基因部分序列的高橋群體和九龍山群體的近鄰統(tǒng)計()值為0.591(0.01<<0.05), 表明湖棲鰭蝦虎魚的雷州半島東岸九龍山群體與西岸高橋群體分化顯著, Lei模型基因流()為5.37, 種群間存在較強的基因交流, 遺傳分化系數(shù)()為0.147, 固定指數(shù)()為0.042 (0.001<<0.01), 核苷酸差異數(shù)()為2.547, 核苷酸歧義度()為0.004。而基于D-loop區(qū)序列的高橋群體和九龍山群體為0.970(<0.001), 表明東、西兩岸的湖棲鰭蝦虎魚群體分化極顯著,值為0.55,為0.157,為0.315(<0.001),、分別為3.506、0.006, 見表3。

基于基因部分序列對雷州半島東、西岸兩個湖棲鰭蝦虎魚群體的分子方差分析(AMOVA)結(jié)果指示, 群體內(nèi)變異(95.825%)程度顯著高于群體間(4.175%)。而基于D-loop區(qū)部分序列的AMOVA分析顯示, 群體內(nèi)遺傳變異(68.488%)同樣高于群體間(31.512%), 且約為2倍關(guān)系, 見表4。

表3 基于COI基因及D-loop區(qū)部分序列的高橋與九龍山群體遺傳分化統(tǒng)計

注 : 左下方為/, 右上方為/

2.3 遺傳距離及系統(tǒng)進化

基于基因部分序列的兩個群體間的Kimura 2-parameter平均遺傳距離為0.0041, 估算轉(zhuǎn)換/顛換值為1.15, 進行替代飽和性分析, 并構(gòu)建轉(zhuǎn)換顛換對TN93校正后的遺傳距離散點圖(圖2), 由圖2可見, 隨著遺傳距離的增加, 轉(zhuǎn)換()、顛換()均在增大, 且呈線性增長關(guān)系, 具有較強的系統(tǒng)發(fā)育信號, 而后進行加權(quán)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析?；贒-loop區(qū)部分序列的平均遺傳距離為0.0144, 轉(zhuǎn)換/顛換值為2.12大于2, 可直接用于建樹分析。以大彈涂魚()為外群構(gòu)建NJ聚類樹可見, 基于基因及D-loop區(qū)部分序列構(gòu)建的NJ樹均未完全聚為兩個支系, 但部分樣本按照采集地點先聚為一支。其中基于基因部分序列的兩個群體聚類情況較D-loop區(qū)分散, 而依據(jù)D-loop區(qū)部分序列的兩個地理種群大部分按采樣點聚類(圖3)。

表4 基于COI基因及D-loop區(qū)部分序列的湖棲鰭蝦虎魚群體AMOVA多樣性分析

注 : 基于基因的=0.042(0.001<<0.01); 基于D-loop序列的=0.315(<0.001)

2.4 中性檢驗及群體擴張

基于基因的高橋群體Tajima’s D test、Fu - Li D test中性檢驗結(jié)果均不顯著, 表明高橋群體符合中性進化假設(shè), 而九龍山的檢測結(jié)果均表現(xiàn)極顯著, 即九龍山群體不符合中性進化?；贒-loop區(qū)序列的高橋群體Tajima’s D檢驗結(jié)果顯著, 不符合中行進化假設(shè), Fu - Li D檢驗顯著, 九龍山群體Tajima’s D、Fu-Li D檢驗結(jié)果均表現(xiàn)不顯著, 表明依據(jù)D-loop區(qū)序列的九龍山群體符合中行進化假設(shè)(表5)。

湖棲鰭蝦虎魚的雷州半島東、西岸兩個群體增長均符合期望值, 且核苷酸不配對分布曲線呈現(xiàn)不明顯的單峰(圖4)。反映湖棲鰭蝦虎魚近期可能經(jīng)歷了群體擴張過程, 說明了湖棲鰭蝦虎魚的高橋群體和九龍山群體存在分化。

3 討論

線粒體基因組中的4種堿基A、T、C和G的分布并不均勻, 而具有明顯的偏倚性。本研究獲取的湖棲鰭蝦虎魚兩個群體共44條基因619bp序列的堿基組成中A + T(51.5%)含量較C + G(48.5%)高, 其他硬骨魚類線粒體基因序列同樣具有類似堿基組成特點, 如銀鯧、鱈魚及鯛屬魚類等[17-20]。53條D-loop區(qū)序列563bp堿基中, A + T(67.8%)含量遠遠高于C + G(32.2%), 這與彭士明[7]研究的野生及養(yǎng)殖銀鯧魚群體結(jié)果相似。

▲. 外群物種大彈涂魚(); ○. 高橋群體; ●. 九龍山群體

▲.; ○. Gaoqiao population; ●. Jiulongshan population

表5 基于COI基因(上行)和D-loop區(qū)(下行)序列的中性檢驗參數(shù)

注 : ns.不顯著; *. 0.01 << 0.05; **. 0.001 << 0.01; ***.< 0.001

A、B. 基于基因的mismatch分布分析; C、D. 基于D-loop區(qū)的mismatch分布分析; Obs-GQ. 高橋觀測值; Obs-JLS.九龍山群體觀測值; Exp. Constant model期望值

A、B. based ongene; C、D. based on control region; Obs-GQ. observed value by the Gaoqiao population; Obs-JLS. observed value by the Jiulongshan population; Exp. expected constant model

線粒體基因組與核基因相比, 具有結(jié)構(gòu)簡單、分子小、進化快等特征而被廣泛應(yīng)用于群體分化及遺傳多樣性的研究[21-22]。依據(jù)D-loop區(qū)構(gòu)建的進化樹絕大部分個體按照采樣點進行聚類, 只有少部分個體出現(xiàn)了東、西群體交錯現(xiàn)象, 這可能是由于海洋環(huán)流或漁船壓艙水等原因致使魚卵、仔稚幼魚運輸帶來的種群交流, 湖棲鰭蝦虎魚魚卵為漂流性卵水體中懸浮于水層中能隨海洋環(huán)流或壓艙水而進行(又稱半浮性卵), 這類魚卵在產(chǎn)于母體后吸水膨脹, 出現(xiàn)較大的卵周隙, 比重略大于水, 在流動的水體中隨著水流遷移, 在靜水中則下沉至底部, 這是湖棲鰭蝦虎魚雷州半島東、西部群體發(fā)生低頻率交流的內(nèi)在原因之一。而依據(jù)基因構(gòu)建的進化樹中, 東、西部群體交錯現(xiàn)象的個體出現(xiàn)得相對多些, 除了湖棲鰭蝦虎魚魚卵特性及海洋環(huán)流及漁船壓艙水造成的影響之外, 一定程度上也由基因本身特性所決定。基因與D-loop相比, 其進化速率相對較慢, 這也是基因作為物種鑒定分子依據(jù)的原因之一[23]。盡管在聚類分析上并沒有如D-loop般明顯的分化現(xiàn)象, 但單倍型多樣性分析結(jié)果顯示, 依據(jù)基因的九龍山群體單倍型多樣性(0.695)>高橋群體單倍型多樣性(0.324), 與基因相似, 基于D-loop區(qū)的九龍山群體單倍型多樣性(0.797)>高橋群體單倍型多樣性(0.661)。同時, 統(tǒng)計各群體的變異位點, 結(jié)果表明, 44條619 bp的基因中存在變異位點29個, 而在53條563bp的D-loop區(qū)序列中檢測到變異位點133個。

綜上說明線粒體基因及D-loop均可用于湖棲鰭蝦虎群體遺傳多樣性分析, 但基因在聚類分析上不及D-loop區(qū)序列敏感, 這與彭士明等[7]基于和D-loop區(qū)研究銀鯧的野生群體和養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的結(jié)果一致。綜合了基因及D-loop區(qū)各參數(shù)數(shù)據(jù)的分析結(jié)果得出結(jié)論: 雷州半島東岸九龍山湖棲鰭蝦虎魚群體與西岸的高橋群體出現(xiàn)了較為明顯的分化, 但也存在海洋物理環(huán)境帶來的種群交流現(xiàn)象?？傊? 九龍山群體遺傳多樣性較高橋群體高。推測原因, 可能與其處在的海域存在一定聯(lián)系。高橋位于半封閉的北部灣東岸雷州半島西部, 海洋環(huán)境相對穩(wěn)定, 而九龍山面臨著廣闊的南海海域, 受到臺灣暖流影響。對環(huán)境適應(yīng)能力較強的群體往往具有較高的遺傳多樣性或遺傳變異, 而長期生活在穩(wěn)定環(huán)境下的遺傳多樣性較低的群體則更容易受到環(huán)境變化的影響。與已經(jīng)報道的魚類比較[24-26], 盡管雷州半島東、西兩岸的湖棲鰭蝦虎魚出現(xiàn)了較為明顯的分化現(xiàn)象, 但兩岸群體的遺傳多樣性仍處在中等水平。這一狀況提示對雷州半島湖棲鰭蝦虎魚資源合理的管理及保護是當務(wù)之急的要務(wù), 同時為后期雷州半島紅樹林海區(qū)水域環(huán)境的監(jiān)測開發(fā)地方性標志魚類提供保障。

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Genetic diversity ofpopulations from western and eastern Leizhou Peninsula based on partial sequences of mitochondrialgene and D-loop

LIAO Jian, LONG Shui-sheng, HE Liang, GUO Yu-song, LIU Chu-wu, LIU Li, WANG Zhong-duo

(Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal of Guangdong higher Education Institutes, Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524025, China)

We compared twopopulations collected from the eastern and western Leizhou Peninsula based ongene and D-loop region.The partial sequences ofgene from 44 individuals (21 from eastern Jiulongshan population and 23 from western Gaoqiao population) and D-loop region from 53 individuals (25 from JLS and 28 from GQ) were cloned. Based ongene, the results were as follows: there were 29 variable sites in 619 bpsequences. The frequencies of T, C, A, and G were 27.8%, 31.0%, 23.7%, and 17.5%, respectively, with more A + T (51.5%) than C + G (48.5%). The haplotype diversity of Jiulongshan population (0.695) was higher than that of Gaoqiao population (0.324). Genetic differentiation analysis indicated that the eastern and western populations were differentiated significantly (= 0.591, 0.01 << 0.05). The correlative values of,,,, andwere 5.37, 0.147, 0.042, 2.547, and 0.004, respectively. However, much more variable sites (133 bp) were observed in D-loop regions with 563 bp length. In addition, there were higher frequencies of A + T (67.8%) than, and the haplotype diversity of Jiulongshan population (0.797) was higher than that of Gaoqiao population (0.661). Geneticdifferentiation of the eastern and western populations was highly significant (= 0.970,< 0.001). The values of,,,, andwere 0.157, 0.315, 3.506, and 0.006, respectively. Analysis of molecular variance revealed that the percentage of variation within populations was higher than that among populations. Cluster analysis showed the presence of clustering phenomenon, which gathered by the collected sites of sample based ongene and D-loop region, but D-loops were more apparent. In summary, a significant differentiation occurred between eastern and western Leizhou Peninsula.

gene; D-loop region;; population of Leizhou Peninsula; genetic differentiation

S917

A

1000-3096(2017)02-0103-08

10.11759//hykx20160319001

2016-03-19;

2016-04-25

國家自然科學(xué)基金項目(31201996); 廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃項目(Yq2013089); 廣東海洋大學(xué)優(yōu)秀學(xué)位論文培育項目(201605)

廖健(1990-), 男, 湖南衡陽人, 碩士研究生, 從事南海經(jīng)濟魚類發(fā)育生物學(xué)研究, 電話: 13078298801, E-mail: liaojiancc@ foxmail.com; 王中鐸, 通信作者, E-mail: aduofa@gmail.com

Mar. 19, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No.31201996; Project of Outstanding Young Teacher Training Program in Colleges and Universities of Guangdong province, No. Yq2013089; Excellent Thesis Breeding Program of Guangdong Ocean University, No. 201605]

(本文編輯: 譚雪靜)