郭曉英，孫 旭，馬曉昱，劉云云，陳 瑤

胃舒康顆粒是海軍青島第二療養(yǎng)院經(jīng)多年臨床研究研制的由丹參、黃芪、黃連、紅花和當(dāng)歸等組成的純中藥制劑，具有行氣活血、溫中祛寒的作用，用于萎縮性胃炎，疣狀性胃炎，胃黏膜脫垂，胃十二指腸球部潰瘍恢復(fù)期等慢性胃病的治療，療效確切。為了進(jìn)一步完善該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，配合醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高，筆者對(duì)該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，采用TLC法對(duì)處方中黃芪、原兒茶醛、黃連、紅花、川芎和當(dāng)歸等進(jìn)行了定性鑒別，建立HPLC法測(cè)定丹參素鈉含量的方法。結(jié)果表明本法結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，能有效控制該制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 薄層層析硅膠G、硅膠G254、硅膠H（青島海洋化工集團(tuán)）；ZF－6型三用紫外分析儀；METTLER AE240電子天平；Agilent 1100高效液相色譜儀；AS－B超聲波清洗儀；HG－B電熱恒溫干燥箱；HH－8電熱恒溫水浴鍋。

1.2 試藥 對(duì)照品黃芪甲苷 （批號(hào)110781－201314）、原兒茶醛 （批號(hào) 110810－201007，純度98.2%）和丹參素鈉 （批號(hào)110855－201311，純度98.1%），對(duì)照藥材黃連（批號(hào) 120913－201310）、紅花 （批號(hào) 120907－201111）、 川芎 （批號(hào) 120918－201110）和當(dāng)歸（批號(hào) 120927－201315），上述對(duì)照品和對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定所；胃舒康顆粒（批號(hào) 20130401、20130902、20140101）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芪的鑒別［1，2］取本品12 g，置索氏提取器中，加甲醇50 ml提取6 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加0.15 mol/L氫氧化鈉溶液飽和的正丁醇萃取3次，20 ml/次，合并正丁醇液，用0.15 mol/L氫氧化鈉溶液洗滌3次，10 ml/次，棄去氫氧化鈉液，正丁醇液置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg溶液，作為對(duì)照品溶液。再取不含黃芪的陰性樣品，按供試品溶液項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取上述3種溶液各5 μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（65∶35∶10）10 ℃以下放置分層的下層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果：供試品色譜與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見圖1A；置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上呈現(xiàn)相同的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1B。

圖1 黃芪鑒別

2.1.2 原兒茶醛的鑒別［1，2］取本品12 g，加水25 ml使溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙醚振搖提取2次，20 ml/次，合并乙醚提取液，水浴蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取原兒茶醛對(duì)照品，加無水乙醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取不含原兒茶醛的陰性樣品，供試品溶液項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取上述三種溶液各5 μl，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－甲酸（8∶6∶1.2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光（254 nm）下檢視，供試品色譜與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上呈現(xiàn)相同的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖2。

圖2 原兒茶醛的鑒別

2.1.3 黃連的鑒別［1，2］取本品 12 g，加甲醇 20 ml，超聲處理，濾過，濾液濃縮至1 ml，作為供試品溶液。另取黃連對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇10 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至1 ml，作為對(duì)照品溶液。再取不含黃連的陰性樣品，按供試品溶液項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法 （《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取上述三種溶液各5 μl，點(diǎn)于同一硅膠G254薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲醇－異丙醇－水 （6∶3∶1.5∶1.5∶0.3）為展開劑（同時(shí)在展開箱中放入一小燒杯與展開劑等體積的濃氨試液飽和15 min），展開，取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視。供試品色譜與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖3。

圖3 黃連的鑒別

2.1.4 紅花的鑒別［1，2］取本品 12 g，加 80%丙酮溶液 30 ml，密塞，振搖 15 min，靜置，取上清液，作為供試品溶液。另取紅花對(duì)照藥材0.5 g，加80%丙酮溶液5 ml，按供試品溶液項(xiàng)下方法制成對(duì)照藥材溶液。再取不含紅花的陰性樣品，按供試品溶液項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法 （《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取上述三種溶液各5～10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯－甲酸－水－甲醇（7∶2∶3∶0.4）為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖4。

2.1.5 川芎、當(dāng)歸的鑒別［1，2］取本品 12 g，加濃氨試液 2 ml，乙醇 50 ml，搖勻，靜置 30 min，超聲處理15min，濾過，濾液濃縮至1ml，作為供試品溶液。另分別取川芎、當(dāng)歸對(duì)照藥材各0.5 g，各加濃氨試液2 ml，乙醇25 ml，按供試品溶液項(xiàng)下方法制成對(duì)照藥材溶液。再取不含川芎、當(dāng)歸的陰性樣品，按供試品溶液項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取上述三種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯（5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365nm）下檢視。結(jié)果供試品色譜與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，結(jié)果見圖5。

圖4 紅花的鑒別

圖5 川芎、當(dāng)歸的鑒別

2.2 丹參素鈉的含量測(cè)定［2－4］

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇－1%醋酸溶液 （2∶98）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫為25℃；流速1.0 ml/min；丹參素鈉峰保留時(shí)間為12.848 min，分離度為2.21，理論板數(shù)為2322。陰性對(duì)照、對(duì)照品以及供試品的HPLC色譜圖見圖6A，6B和6C。

圖6陰性對(duì)照、對(duì)照品以及供試品的HPLC色譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取丹參素鈉對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度為1.017 mg/ml的對(duì)照品溶液 （對(duì)照品儲(chǔ)備液），精密量取1 ml置25 ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得濃度為40.69 μg/ml的對(duì)照品溶液。

正確的監(jiān)測(cè)分析方法是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。每一種監(jiān)測(cè)分析方法的靈敏度和準(zhǔn)確度要能滿足要求，方法成熟，抗干擾能力強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便。在常規(guī)監(jiān)測(cè)中，分光光度法用得較多，可測(cè)定多種金屬和非金屬離子或化合物；原子吸收法主要用于多種微量、痕量金屬元素的測(cè)定；容量法主要用于DO、COD、BOD5等的測(cè)定。審核時(shí)主要關(guān)注一些新監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和方法有沒有進(jìn)行及時(shí)更新。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取胃舒康顆粒6 g，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇30 ml，超聲處理30 min，放冷，濾過，取續(xù)濾液5 ml至10 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備 取缺制丹參的樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備成陰性對(duì)照品溶液。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2.2.2”項(xiàng)下丹參素鈉對(duì)照品貯備液適量，用50%甲醇稀釋，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。含丹參素鈉分別為 10.17、20.35、40.69、81.38、162.77 μg/ml，分別取 20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。 以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo) （X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得回歸方程，Y=13.671X+5.8542，R2=0.9998。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丹參素鈉在10.17～162.77 μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.5”項(xiàng)下40.69 μg/ml對(duì)照品溶液 20 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，計(jì)算RSD （n=6）為0.15%。說明儀器的精密度良好。

2.2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取胃舒康顆粒 （批號(hào)20130401），按“2.2.3”項(xiàng)下方法分別制備 6份供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μl，記錄丹參素鈉峰面積值，計(jì)算RSD（n=6）為0.13%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取胃舒康顆粒 （批號(hào)20130401），按“2.2.3”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣 20 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定丹參素鈉的峰面積，計(jì)算RSD為0.37%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 胃舒康顆粒中丹參素鈉加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.2.10 樣品含量測(cè)定 按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取“2.2.2”、“2.2.3”項(xiàng)下溶液各 20 μl，照 2015年版《中國(guó)藥典》四部通則0512，進(jìn)樣胃舒康顆粒樣品（批號(hào) 20130401、20130902、20140101），每批樣品測(cè)定2份，以外標(biāo)法計(jì)算各個(gè)樣品中丹參素鈉的含量，結(jié)果詳見表2。

表2 胃舒康顆粒中丹參素鈉含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 TLC鑒別 該文通過試驗(yàn)制定了黃芪、黃連、原兒茶醛、紅花、川芎和當(dāng)歸的TLC鑒別方法，該方法特征斑點(diǎn)明顯，色譜分離清晰，可作為胃舒康顆粒中黃芪、黃連、原兒茶醛、紅花、川芎和當(dāng)歸［1，3，4］的專屬性鑒別。

3.2 樣品溶液的制備 該實(shí)驗(yàn)在前處理過程中進(jìn)行了不同提取溶劑的比較［2，5－11］，如酸處理－乙酸乙酯萃取或50%甲醇回流提取，結(jié)果表明采用顆粒直接加50%甲醇超聲30 min提取制備丹參素鈉含量測(cè)定樣品溶液，可有效提取所含丹參素鈉；該方法簡(jiǎn)便、可靠、重現(xiàn)性好，縮短了檢驗(yàn)流程，避免了回流提取萃取分離的繁瑣操作，節(jié)省了人力物力。

3.3 流動(dòng)相選擇 該實(shí)驗(yàn)亦比較了不同比例流動(dòng)相對(duì)峰型、分離度的影響，如甲醇－1%HAc（2∶98），甲醇－1%HAc（4∶96），甲醇－1%HAc（6∶94），最終確定流動(dòng)相為甲醇－1%HAc（2∶98）時(shí)丹參素鈉峰型及分離度較好。

該實(shí)驗(yàn)建立的含量測(cè)定方法，經(jīng)方法學(xué)研究結(jié)果表明簡(jiǎn)便、可行、快捷，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度、靈敏度及重現(xiàn)性好，可用于胃舒康顆粒的質(zhì)量控制。

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