李玉洋辛寒曉范學(xué)明劉麗英孫中濤

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018；2. 山東佐田氏生物科技有限公司，濟(jì)南 250000）

水稻惡苗病拮抗菌的篩選、鑒定及其抑菌活性

李玉洋1辛寒曉2范學(xué)明2劉麗英1孫中濤1

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018；2. 山東佐田氏生物科技有限公司，濟(jì)南 250000）

從水稻根際土壤中篩選出拮抗水稻惡苗病的菌株，初步研究其抑菌作用及生防效果。采用平板稀釋法從水稻根際土壤中分離獲得菌株，以水稻惡苗病菌為靶標(biāo)菌采用平板對峙法篩選出拮抗菌；通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析對篩選出的拮抗菌進(jìn)行鑒定；檢測拮抗菌無菌發(fā)酵液對水稻惡苗病菌菌絲生長的影響，同時測定拮抗菌的抑菌譜及進(jìn)行盆栽實驗。分離得到6株拮抗菌，其中有一株對水稻惡苗病菌拮抗作用較強(qiáng)的菌株SH15，經(jīng)鑒定菌株SH15為多粘類芽孢桿菌。菌株無菌發(fā)酵液對水稻惡苗病菌菌絲生長有顯著抑制作用；菌株SH15抑菌譜廣，對水稻惡苗病菌、層出鐮孢菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫病菌、棉花黃萎病、黃瓜黑斑病菌均有一定的抑菌活性。水稻盆栽實驗表明，接種多粘類芽孢桿菌SH15可顯著降水稻惡苗病的發(fā)病指數(shù)，平均防效高達(dá)65.68%。因此，多粘類芽孢桿菌SH15在水稻惡苗病的生物防治方面具有一定的應(yīng)用價值。

水稻惡苗病菌；多粘類芽孢桿菌；無菌發(fā)酵液；拮抗譜

水稻是我國重要的谷物之一，目前我國播種面積約為0.28×108hm2，在糧食作物中居第一位，主要在亞洲和非洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛種植。然而，各種水稻病害的不斷發(fā)生，造成水稻質(zhì)量下降、產(chǎn)量降低。其中，最常見且危害最嚴(yán)重的真菌性病害為水稻惡苗病、水稻稻瘟病、水稻紋枯病。水稻惡苗病又稱徒長病，是串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）侵染引起的世界性水稻病害，中國各稻區(qū)均有發(fā)生。病谷粒播后常不發(fā)芽或不能出土，致使水稻大面積減產(chǎn)、質(zhì)量大幅度下降，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1，2］。

目前控制水稻惡苗病的主要方法仍以化學(xué)殺菌劑為主，但由于化學(xué)殺菌劑容易出現(xiàn)抗藥性和藥物殘留，不僅污染環(huán)境，還嚴(yán)重地威脅人體健康［3］。隨著人們對無公害食品需求的日益增加以及對環(huán)境保護(hù)的日益關(guān)注，生物防治成為了人們控制植物病害的理想途徑［4，5］，篩選出生物活性高、抗菌譜廣的菌株具有重要的意義。目前國內(nèi)外對番茄疫霉根腐?。?］、番茄灰霉?。?］、黃瓜枯萎病［8］等植物病害的生物防治研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，對水稻紋枯病生物防治的報道較多［9-12］，但對水稻惡苗病的生物防治較少［13-15］。本研究從水稻的根際土壤中篩選出一株對水稻惡苗病菌有較強(qiáng)拮抗作用的菌株SH15，對其進(jìn)行生理生化、16S rDNA序列鑒定，并對其抗菌譜及對水稻惡苗病的防治效果進(jìn)行研究，以期為抗病性生物肥料的生產(chǎn)提供新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣及水稻 供試土樣采自山東省臨沂河?xùn)|區(qū)水稻種植區(qū)發(fā)病嚴(yán)重的地塊，選擇健康植株根系部的土壤。供試水稻為松粳12號。

1.1.2 供試菌株和培養(yǎng)基 供試病原菌為水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）、層出鐮孢菌（Fusarium proliferatum）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、棉花黃萎?。╒erticillium alboatrum）黃瓜黑斑病菌（Alternaria cucumerina），均為本實驗保存。

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2，121℃高壓滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、酵母浸粉 5.0 g、NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0，121℃高壓滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然，121℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 土樣采集和處理 從臨沂河?xùn)|區(qū)水稻種植區(qū)發(fā)病嚴(yán)重的地塊，選擇健康植株將其挖出，用力抖落附著的土壤，最后以無菌刮刀刮下的土壤為樣品，用保鮮袋保存。稱取土樣1 g加入到99 mL無菌水中（裝有若干玻璃珠），30℃、180 r/min振蕩30 min，靜置后獲得土壤懸液。

1.2.2 拮抗菌株SH15的篩選 將土壤懸液稀釋成10-5、10-6、10-7濃度，吸取不同稀釋度的土壤懸液100 μL涂布于NA培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)48 h，挑取顏色、形態(tài)等不同的細(xì)菌單菌落并純化、保存。采用平板對峙法測定分離到的細(xì)菌對水稻惡苗病菌的抑菌活性。將水稻惡苗病菌在PDA平板上活化，用打孔器在菌落邊緣打取菌塊（直徑5 mm），接種到PDA平板中央。培養(yǎng)3 d后，在距離水稻惡苗病菌塊2 cm處的4個對接點(diǎn)接種待測細(xì)菌，28℃培養(yǎng)，10 d后觀察抑菌結(jié)果，測定抑菌圈直徑，其中：抑菌圈直徑 = 2×（對照菌落半徑-處理菌落直徑）。每個處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 拮抗菌株SH15的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定：將篩選到的SH15菌株，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、顯微鏡形態(tài)觀察、革蘭氏染色、芽孢染色以及厭氧生長試驗、接觸酶試驗、氧化酶實驗、硝酸還原試驗、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗、V-P試驗、吲哚試驗等生理生化指標(biāo)測定。

（2）分子生物學(xué)鑒定：提取拮抗菌株SH15的基因組DNA，所用試劑盒為上海生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)，按照說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增16S rDNA基因采用通用引物，正向引物為：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物為：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3'PCR。反應(yīng)體系為：TaKaRa Taq（5 U/μL）0.25 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Free）5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTP Mixture（各 2.5 mmol/L）4 μL，模 板 DNA 1 μL，兩種引物各 1 μL，雙蒸水 34.75 μL。PCR 反應(yīng)條件為：96℃ 5 min，94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，30 個循環(huán)；72℃ 5 min，-20℃保存。所得到的樣品序列送由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，利用 NCBI 進(jìn)行 blast 分析，同現(xiàn)有細(xì)菌序列作比對。所用測序儀器為 ABI-PRISM3730，測序試劑為BigDyeterminator v3.1。利用 Mega5.2 軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定所選菌株SH15的種屬。

1.2.4 拮抗菌株SH15的抑菌譜實驗 拮抗菌株SH15對各供試病菌的拮抗作用均采用平板對峙法。各實驗重復(fù)3次。按1.2.2中方法進(jìn)行抑菌試驗，拮抗效果以抑菌圈直徑為指標(biāo)。抑菌圈直徑 = 2×（對照菌落半徑-處理菌落直徑）。

1.2.5 拮抗菌株SH15發(fā)酵液對水稻惡苗病菌菌絲形態(tài)的影響 將水稻惡苗病菌在PDA培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)10 d后，用打孔器打取直徑5 mm的菌塊置于PDA培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中，28℃培養(yǎng)5 d。將培養(yǎng)好的水稻惡苗病菌菌塊用無菌發(fā)酵液處理24 h后，以無菌水處理為對照，挑取菌絲在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)，每個處理重復(fù)3次。

1.2.6 水稻盆栽實驗 將拮抗細(xì)菌SH15接種于LB培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)48 h，然后采用平板培養(yǎng)法測定有效活菌濃度，并將其調(diào)整至1×107cfu/mL，即為SH15菌劑，4℃保存?zhèn)溆?。將水稻惡苗病菌接種于PDA平板中，28℃培養(yǎng)10 d，長滿菌絲后制成孢子懸浮液，孢子濃度為1×107cfu/mL，即為水稻惡苗病菌菌劑，取健康土壤按表1進(jìn)行盆栽實驗，水稻惡苗病菌菌劑、SH15菌劑及50%多菌靈可濕性粉劑（施用量750-900 g/hm2兌水500-600 kg后噴施）在水稻疏苗后噴施，先噴水稻惡苗病菌菌劑，2 d后，噴施SH15菌劑或50%多菌靈可濕性粉劑。水稻苗株高至5 cm時進(jìn)行疏苗，每盆（200 g土）保留5株，每個處理10盆，重復(fù)3次。按常規(guī)方式進(jìn)行管理，觀察記錄發(fā)病株數(shù)和相對病斑高度，并計算病級、病情指數(shù)和防治效果。病害分級標(biāo)準(zhǔn)采用文獻(xiàn)［9］的方法，病級、發(fā)病率、病情指數(shù)及相對防效按下述公式計算。

表1 盆栽實驗設(shè)計

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0，處理間的差異顯著性分析采用Duncan 氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌株的篩選結(jié)果

從健康水稻根際土壤中共分離純化75株細(xì)菌，采用平板對峙發(fā)篩選出6株對水稻惡苗病菌有抑菌活性的拮抗菌（表2），其中菌株SH15抑菌活性最強(qiáng)，菌株SH21無抑菌活性，結(jié)果見圖1。

2.2 拮抗菌株SH15的鑒定

2.2.1 拮抗菌株SH15形態(tài)學(xué)及生理生化指標(biāo) 拮抗菌株SH15在NA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，菌落呈乳白色，圓形、凸起、有光澤、表面光滑、邊緣整齊，具粘性不易挑取，如圖2。鏡檢菌體呈桿狀、革蘭氏染色為陽性，芽孢中生、橢圓形。其他生理生化實驗結(jié)果見表3。

2.2.2 拮抗菌株SH15 16S rDNA序列測定與分析 以菌株SH15基因組DNA為模板，利用16S rDNA細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測到約1 500 bp的條帶（圖3），測序結(jié)果為1 503 bp，將序列通過NCBI的Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA 序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其與多粘類芽孢桿菌16S rDNA序列的相似性高達(dá)99%，初步確定拮抗菌株SH15為多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）。將菌株SH15的16S rDNA序列利用MEGA5.0軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建進(jìn)化樹。

圖1 不同菌株對水稻惡苗病菌的拮抗作用

表2 拮抗細(xì)菌SN15～SH20對水稻惡苗病菌的抑菌能力

圖2 菌株SH15在NA培養(yǎng)基上的菌落

表3 拮抗菌株SH15的生理生化特征

由圖4可知，綜合菌體形態(tài)、生理生化實驗結(jié)果以及16S rDNA序列分析鑒定菌株SH15為多粘類芽孢桿菌。

圖3 菌株SH15 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖4 菌株SH15的16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 拮抗菌株SH15的抑菌譜實驗

為了研究拮抗菌株SH15的生防潛力，采用平板對峙法對其抑菌譜進(jìn)行了測定。由表4可知，拮抗菌株SH15對水稻惡苗病菌抑制效果較好，對層出鐮孢菌、棉花枯萎病菌、棉花黃萎病菌抑制次之，對辣椒疫病菌、黃瓜黑斑病菌拮抗效果較差。

表4 菌株SH15的抑菌譜

2.4 無菌發(fā)酵液對水稻惡苗病菌菌絲形態(tài)的影響

由圖5可知，無菌水處理的水稻惡苗病菌菌絲形態(tài)飽滿，細(xì)胞壁光滑，菌絲能正常生長并擴(kuò)展。經(jīng)拮抗菌株SH15無菌發(fā)酵液處理后，水稻惡苗病菌菌絲形態(tài)發(fā)生明顯變化，菌絲分支增多，菌絲出現(xiàn)打結(jié)點(diǎn)，生長緩慢。

圖5 菌株發(fā)酵液對水稻惡苗病菌菌絲的影響

2.5 水稻盆栽實驗結(jié)果

水稻盆栽實驗結(jié)果如表5和圖6所示。實驗調(diào)查期間，CK1發(fā)病指數(shù)為零，而CK2發(fā)病指數(shù)高達(dá)53.36%-67.73%，說明實驗所采用水稻惡苗病原菌對受試水稻具有較強(qiáng)的致病性。與CK2相比，接種SH15菌劑的處理發(fā)病指數(shù)僅為12.43%-29.75%，平均相對防效高達(dá)65.68%，與50%多菌靈可濕性粉劑相比，防效差異不明顯，表明菌株SH15對水稻惡苗病具有較好的防治效果。盆栽實驗還表明，不同栽培時期，菌株SH15對水稻惡苗病的相對防效差異顯著，栽培前期防效較高，隨著栽培期的延長，防效有所下降。

表5 多粘類芽孢桿菌防治水稻惡苗病的盆栽實驗結(jié)果

3 討論

多粘類芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的重要成員，其在生物防控方面的潛能也逐漸被發(fā)掘。趙德立等［16］研究發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌JW-725對柑橘青霉的防治取得了良好的效果；馬桂珍等［17］研究表明多粘類芽孢桿菌L1-9拮抗番茄早疫病菌，抑菌率高達(dá)79.28%；范磊［18］研究發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌HY96-2對西瓜枯萎病防治效果顯著；馬桂珍等［19］研究表明海洋多粘類芽孢桿菌L1-9對小麥赤霉病的防治有明顯的效果；郭芳芳等［20］分離得到的多粘類芽孢桿菌CF05對番茄猝倒病的防治效果顯著；而本文研究表明多粘類芽孢桿菌SH15對水稻惡苗病防治效果良好。因此，不同的多粘類芽孢桿菌對不同的病菌防治效果不同。為此，開發(fā)多粘類芽孢桿菌菌劑時，應(yīng)著重說明該菌劑針對病害的種類。

多粘類芽孢桿菌在生長過程中，可以產(chǎn)生肽類、蛋白質(zhì)類、酚類等多種抗菌物質(zhì)。其中，Kavitha等［21］發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌VLB16產(chǎn)生的蛋白能抑制稻瘟病菌和稻紋枯病的生長，其分子量為37 kD，并且耐高溫；陳海英等［22］從多粘類芽孢桿菌CP7代謝產(chǎn)物中分離到3種抗革蘭氏陰性菌的小分子多肽，其中組分C1為多粘菌素E1；范磊等［23］從多粘類芽孢桿菌HY96-2發(fā)酵液中分離出一個抗真菌活性化合物-Fusaricidin A，該物質(zhì)對西瓜枯萎病菌、水稻紋枯病菌、灰霉病菌等多種病菌均有較好的抑制作用。本文中多粘類芽孢桿菌SH15發(fā)酵液對水稻惡苗病菌菌絲抑制明顯，表明SH15發(fā)酵液中也含有抗菌物質(zhì)，為此，抗菌物質(zhì)的明確有待進(jìn)一步研究。

水稻惡苗病是水稻常見的病害，目前，主要以化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，李鵬等［24］利用25%氰烯菌酯懸浮劑進(jìn)行水稻惡苗病的田間防治，黃賢夫等［25］采用甲霜·種菌唑拌（浸）種預(yù)防水稻惡苗病，都取得良好的效果，但長期施用化學(xué)藥劑，造成了嚴(yán)重的土壤污染、環(huán)境污染。而本研究篩選到的多粘類芽孢桿菌SH15對水稻惡苗病盆栽平均防效高達(dá)65.68%，且多粘類芽孢桿菌對人或動植物無致病性，對土地和環(huán)境無污染，符合水稻可持續(xù)發(fā)展的需要。

圖6 不同處理對水稻惡苗病的防治效果

4 結(jié)論

本實驗采用平板稀釋法從從水稻根際土壤中，分離得到75株細(xì)菌，經(jīng)平板對峙法篩選到6株對水稻惡苗病菌有拮抗作用的菌株，尤其有一株對水稻惡苗病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株SH15，經(jīng)鑒定為多粘類芽孢桿菌；菌株SH15無菌發(fā)酵液對水稻惡苗病菌菌絲處理后，發(fā)現(xiàn)有顯著抑制作用；菌株SH15對水稻惡苗病菌、層出鐮孢菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫病菌、棉花黃萎病、黃瓜黑斑病菌均有一定的抑菌活性，表明SH15抗菌譜廣。水稻盆栽實驗表明，接種多粘類芽孢桿菌SH15可顯著降水稻惡苗病的發(fā)病指數(shù)，平均防效高達(dá)65.68%，進(jìn)而表明，多粘類芽孢桿菌SH15在水稻惡苗病的生物防治方面具有一定的應(yīng)用價值。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Screening and Identification of an Antagonistic Strain Against Fusarium moniliforme in Rice and Its Antifungal Activity

LI Yu-yang1XIN Han-xiao2FAN Xue-ming2LIU Li-ying1SUN Zhong-tao1
（1. College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018；2. Shandong Zuotianshi Biotechnology Company Limited，Jinan 250000）

This work is to select an antagonistic strain against Fusarium moniliforme in rice from the rhizosphere soil of rice，and study its primary inhibitory effect on plant pathogens and biocontrol effect. The strain was separated from the rhizosphere soil of rice by the plate dilution method，using the F. moniliforme as the indicator strain for the antagonistic strain being screened by plate confrontation method. It was identified based on morphological，physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA phylogenetic analysis. The effects of the sterile fermented liquor of the strain on the hypha growth of F. moniliforme were analyzed，and its antagonistic spectrum was measured，also pot experiment was conducted. Six strains were isolated，and one SH15 presented highly antagonistic effect on F. moniliforme，and was identified as Paenibacillus polymyxa. Sterile fermented liquor of strain SH15 showed significant inhibitory effect on hypha growth of F. moniliforme. Strain SH15 had broad antimicrobial spectrum，antibacterial activity on F. moniliforme，F(xiàn)usarium proliferatum，F(xiàn)usarium oxysporum，Phytophthora capsici，Phytopthora infestans，and Alternaria cucumerina. Rice pot experiments revealed that inoculation of the P. polymyxa SH15 significantly reduced the disease index of Fusarium moniliforme in rice with the average efficiency 65.68%. Therefore，there is certain application value for P. polymyxa SH15 in biological control of rice bakanae disease.

Fusarium moniliforme；Paenibacillus polymyxa sterile；fermented liquid；antagonistic spectrum

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0826

2016-08-31

山東省科技重大專項（2015ZDXX0502B04），山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項目

李玉洋，碩士，研究方向：微生物工程，E-mail：931353121qq.com

孫中濤，副教授，博士，研究方向：微生物工程與酶工程；E-mail：zhtsun@sdau.edu.cn