張曉慧 韓榕

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 植物分子與環(huán)境脅迫響應(yīng)山西省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，臨汾 041000）

兩種瞬時(shí)表達(dá)體系研究擬南芥Profilin-1的亞細(xì)胞定

張曉慧 韓榕

（山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 植物分子與環(huán)境脅迫響應(yīng)山西省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，臨汾 041000）

使用兩種瞬時(shí)表達(dá)方法研究Profilin-1（PRF1）的亞細(xì)胞定位，并比較了2種瞬時(shí)表達(dá)體系在亞細(xì)胞定位研究中的優(yōu)缺點(diǎn)。利用擬南芥幼葉作為材料，提取葉片的RNA，采用特異性引物RT-PCR的方法克隆PRF1基因，連接到pCAMBIA1300-GFP的改造載體上，成功的構(gòu)建pCAMBIA1300-GFP-PRF1的表達(dá)載體。然后分別利用PEG轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體、農(nóng)桿菌浸染煙草葉片兩種技術(shù)進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）融合蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果表明，將PRF1基因?qū)霐M南芥的原生質(zhì)體和煙草表皮細(xì)胞后，融合蛋白綠色熒光均能被觀察到，PRF1基因與GFP融合蛋白的產(chǎn)物在煙草表皮細(xì)胞中主要定位在細(xì)胞質(zhì)和外周細(xì)胞器中，在擬南芥的原生質(zhì)體中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有定位。兩種不同的瞬時(shí)表達(dá)體系中PRF1蛋白的定位出現(xiàn)了不同，這可能與同源或異源表達(dá)的植物的特性相關(guān)。

擬南芥；PRF1；瞬時(shí)表達(dá)；原生質(zhì)體；GFP

轉(zhuǎn)基因是一種非常重要的手段去研究植物的分子生物學(xué)，并且它可以被用來研究植物中基因的功能和遺傳學(xué)上的進(jìn)展［1］。然而，在轉(zhuǎn)基因株系中穩(wěn)定的基因的表達(dá)是相對昂貴和費(fèi)時(shí)的，并且對大規(guī)模的植物基因的分析是有限制的。瞬時(shí)表達(dá)研究變得越來越便捷，簡單，安全和有效，并且與長期穩(wěn)定表達(dá)的系統(tǒng)相比瞬時(shí)表達(dá)有很高的表達(dá)水平［2］。如今瞬時(shí)基因表達(dá)已經(jīng)被廣泛的用于蛋白質(zhì)功能的研究，如蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位和運(yùn)輸、蛋白與蛋白之間的相互作用、蛋白的穩(wěn)定和降解以及蛋白的活力。普通的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的方法包括基因槍轟擊法，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（農(nóng)桿菌滲入法），聚乙二醇（聚乙二醇）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。雖然，離子轟擊的方法可以被用于大部分的植物物種中［3］，但是它是具有挑戰(zhàn)性的，使用這種方法會改變許多類型的葉綠體靶向蛋白［4］。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)具有操作簡單、價(jià)格低，易操作的特點(diǎn)［5］。使用各種不同的轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒的DNA分子轉(zhuǎn)染到原生質(zhì)體中有很多方法，如PEG介導(dǎo)法、電穿孔法和顯微注射法。而PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)染表達(dá)有很高的轉(zhuǎn)染效率，可以直接作用于單個(gè)細(xì)胞，從而可以更直接地研究外源基因在細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)，所以它被很廣泛的應(yīng)用于植物分子生物學(xué)研究中［6，7］。

前纖維蛋白（Profilin）是一個(gè)分子量為12-15 kD的肌動蛋白結(jié)合蛋白，它在動植物中廣泛存在［8，9］。1997年，Profilin主要在動物細(xì)胞的提取液中作為抑制微絲體外聚合的組分被提取出來，植物中Profilin是在1991年作為赤楊花粉中的致敏源而被發(fā)現(xiàn)的［10］，經(jīng)過多年的研究，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種Profilin的異構(gòu)體。如玉米中已確定的Profilin的異構(gòu)體有6種［11］，在模式生物擬南芥中至少有5種Profilin的異構(gòu)體［12］，在這些Profilin異構(gòu)體中，其中Profilin-1在調(diào)控植物細(xì)胞的生長中扮演著重要的作用，如頂端生長的細(xì)胞-根毛和彌散生長的細(xì)胞-下胚軸表，當(dāng)缺失Profilin-1時(shí)，就會導(dǎo)致根毛變短和下胚軸變短。相反的，當(dāng)過表達(dá)Profilin-1時(shí)，就會導(dǎo)致根毛和下胚軸變長［13］。為了對Profilin-1的分布進(jìn)行研究，我們利用了綠色熒光蛋白的方法，去觀察Profilin-1的分布。熒光蛋白是在發(fā)光的水母（Aequorea victoria）中發(fā)現(xiàn)的小分子蛋白，當(dāng)使用UV光去激發(fā)GFP蛋白是就表現(xiàn)出了熒光特性［14］。GFP的最大激發(fā)波長為395 nm，發(fā)射光波長為509 nm，采用帶有濾波器的熒光顯微鏡可以很容易的被觀察到［15］。GFP能夠一直的維持熒光亮度。它是一種很好的熒光標(biāo)簽去檢測蛋白與蛋白之間的相互作用，蛋白的跨膜和亞細(xì)胞定位。然而，直到現(xiàn)在還沒有報(bào)道使用帶有GFP報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)去研究Profilin-1的定位。在本實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了GFP∶PRF1融合基因，利用瞬時(shí)表達(dá)的方法將融合基因分別導(dǎo)入到擬南芥原生質(zhì)體和煙草的表皮細(xì)胞中，使用激光共聚焦顯微鏡觀察PRF1在細(xì)胞中的定位，旨在為后期瞬時(shí)表達(dá)體系的建立和其它功能基因的導(dǎo)入奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 擬南芥哥倫比亞生態(tài)型被用于本次實(shí)驗(yàn)的研究，使用1%的次氯酸鈉消毒后用蒸餾水沖洗種子，然后用0.1%的瓊脂粉懸浮種子點(diǎn)種在MS培養(yǎng)基上，4℃冰箱放置72 h后轉(zhuǎn)移至生長室中，生長室的條件如下：溫度，22±1℃；光照強(qiáng)度，50-55 mmol photons m-2s-1；光周期，16∶8 h（光∶黑暗）；相對濕度，70%。

本氏煙草用于此次研究中，并且所選用的植物是4-5周的植物，光周期為14∶10 h（光∶黑暗）。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒及試劑 農(nóng)桿菌GV3101、大腸桿菌DH5α均為本實(shí)驗(yàn)室所有，質(zhì)粒小提試劑盒，DNA回收試劑盒，T4 DNA連接酶和DNA marker均來購自TaKaRa（Japan）公司，限制性內(nèi)切酶和Q5高保證酶均購自NEB（Beijing）有限公司，纖維素酶和果膠酶均購自日本Yakult公司。

1.1.3 儀器 激光共聚焦掃描顯微鏡（OLYMPUS CONFOCAL FV1000）。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 選取葉片完全伸展的2周的擬南芥葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，然后將幼苗轉(zhuǎn)移到液氮中，用預(yù)冷的研磨棒將葉片研磨成粉狀，使用Trizol試劑來提取RNA后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA質(zhì)量合格后，使用PrimeScipt?RTReagent Kit（TaKaRa，Japan）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后將cDNA儲存在 -80℃的冰箱中，以便用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 PRF1基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)擬南芥微絲結(jié)合蛋白PRF1的全長進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)引物如下：上游引物：5'-CGCGGATCCATGTCTTGGCAATCATACG-3'；下游引物：5'-CGGGGTACCGAG TTCAGACTCGATAAGG-3'。以上引物的劃線部分分別為BamH I和Kpn I兩個(gè)內(nèi)切酶的酶切識別位點(diǎn)，前面斜體為保護(hù)堿基。然后使用此引物擴(kuò)增得到目的基因profilin-1，使用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測并回收目的片段。將回收后的片段連接到表達(dá)載體上，然后轉(zhuǎn)染到大腸桿菌感受態(tài)中，選擇陽性單克隆菌株，搖菌，提質(zhì)粒，酶切鑒定，送往北京華大公司測序。

1.2.3 原生質(zhì)體的分離和轉(zhuǎn)染 選取3周齡的擬南芥葉片用于提取原生質(zhì)體，原生質(zhì)體的提取方法如下［16］，略有改動。酶溶液的制備含有1%的纖維素酶R-10，0.25%的離析酶R-10，20 mmol/L MES、0.4 mol/L甘露醇和20 mmol/L KCl，酶溶液放置在水浴鍋中55℃ 10 min。然后移到室溫環(huán)境中放涼，然后添加0.1% BSA、10 mmol/LCaCl2和5 mmol/L β-ME（β-巰基乙醇），使用0.45 μm的過濾器過濾，儲存，為后續(xù)的使用，使用雙面刀片按與主莖面垂直的方向切成1 mm的細(xì)條狀。這些細(xì)條被快速的放在酶解液中（0.4-0.5 g/10 mL），然后在25℃暗處酶溶液中孵育3 h。在消化后，用W5（20 mmol/L MES，154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，pH5.8）把酶解液稀釋成同等的體積。并且均勻的混合在一起，然后使用200目的尼龍網(wǎng)過濾。離心1 000 r/min 2 min，上清液去除，把原生質(zhì)體重懸在W5溶液中，接下來取靜置10 h后的原生質(zhì)體以終濃度為25 mol/L的熒光素二乙酸酯（Fluoresceindiacetate，F(xiàn)DA）室溫處理10 min，在熒光顯微鏡下鏡檢，鑒定原生質(zhì)體的活力。

接下來，進(jìn)行擬南芥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，向原生質(zhì)體中加入MMg溶液［0.4 mol/L甘露醇、15 mmol/L MgCl2和4 mmol/L MES（pH5.7）］，重懸原生質(zhì)體，接下來在1.5 mL離心管中加入100 μL的重懸的原生質(zhì)體和25 μL的重組載體，再加入125 μL的PEG溶液（40% PEG-4000，0.2 mol/L甘露醇和0.1 mol/L CaCl2），輕輕搖勻，在23℃培養(yǎng)箱中，避光靜置30 min。接下來加入4倍體積的W5溶液混勻，室溫100×g離心1 min，移除PEG，在加入100 μL的W5溶液重懸原生質(zhì)體，將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體放在22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-18 h，用熒光顯微鏡下觀察鑒定。

1.2.4 PRF1在煙草細(xì)胞中的表達(dá) 將GFP：PRF1載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101的感受態(tài)細(xì)胞中，涂板，放在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16 h后挑取單克隆菌株于YEB液體培養(yǎng)基中，于搖床中 28℃ 200 r/min 過夜搖培24-36 h，測OD600的值為0.8-1時(shí)，結(jié)束培養(yǎng)，5 000×g，離心5 min，倒掉上清液，使用重懸液（1 mol MgCl2，0.5 mol MES，100 mol/L AS（乙酰丁香酮）懸菌，使其終濃度達(dá)到0.4，室溫靜置3 h后，使用沒有針頭的1 mL的注射器吸取菌液，注射3-4周長勢較好煙草。接種2 d后，使用激光共聚焦對煙草葉片表面接種部位進(jìn)行觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 PRF1的擴(kuò)增和DNA的構(gòu)建

對擬南芥葉片進(jìn)行總RNA的提取，通過1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，然后以此RNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增得到一條長約396 bp的片段（圖1-A），可以進(jìn)行到下一步的連接實(shí)驗(yàn)。然后，將目的基因片段PRF1與帶GFP標(biāo)簽的表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切3 h后，使用1%的瓊脂糖進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖1-B所示。接下來將質(zhì)粒送往北京華大進(jìn)行測序，測序正確，這個(gè)構(gòu)建好質(zhì)?？梢员挥糜诮酉聛淼乃矔r(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

圖1 PRF1的擴(kuò)增（A）和重組質(zhì)粒雙酶切（B）結(jié)果

2.2 原生質(zhì)體活力的檢測和PRF1在原生質(zhì)體中的瞬時(shí)表達(dá)

高質(zhì)量的原生質(zhì)體對于隨后的研究和分析十分重要，尤其是原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。首先，用3周齡的擬南芥幼苗葉片作為材料進(jìn)行原生質(zhì)體的提取，擬南芥葉肉原生質(zhì)體為表面十分光滑的球狀體（圖2-B）。其次，開花前的幼苗比整株幼苗更可以提取到比較好的原生質(zhì)體（圖2-A）。對原生質(zhì)體活力的鑒定采用熒光指示劑FDA標(biāo)記法，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在488 nm激發(fā)下，大部分原生質(zhì)體仍顯示綠色熒光，表明原生質(zhì)體始終保持很高的活性，可以用于接下來的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)（圖2-C）。

圖2 原生質(zhì)體的提取

為了可以形象直觀的看到PRF1蛋白的亞細(xì)胞定位，我們構(gòu)建了帶有GFP標(biāo)簽的融合表達(dá)載體，通過PEG轉(zhuǎn)化法將融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體中，融合蛋白在原生質(zhì)體中的胞質(zhì)和質(zhì)體的定位，且較清晰（圖3A-C）。

圖3 為轉(zhuǎn)化表達(dá)載體后的擬南芥原生質(zhì)體

2.3 PRF1在煙草葉片中的定位

使用健康的至少有兩個(gè)大葉的煙草植株作為實(shí)驗(yàn)材料，因?yàn)樾∪~子很難滲透并且明顯的降低了轉(zhuǎn)化效率。利用農(nóng)桿菌GV3101，將pCAMBIA1300-GFP載體與PRF1基因的融合表達(dá)載體（pCAMBIA1300-GFP-PRF1）轉(zhuǎn)入到煙草葉片中，獲得了高效瞬時(shí)的表達(dá)，在475 nm藍(lán)光的激發(fā)下綠色熒光蛋白產(chǎn)生了509 nm的綠色熒光。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PRF1和GFP的融合蛋白在胞質(zhì)中產(chǎn)生綠色熒光（圖4-A），并且也聚集在顆粒狀細(xì)胞器外周，在對照組中，GFP則可進(jìn)入核孔復(fù)合物中擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞核，從而我們在細(xì)胞核中觀察到了GFP的綠色熒光信號（圖4-B）。

圖4 PRF1在煙草葉片中的亞細(xì)胞定位

3 討論

前纖維蛋白（Profilin）是一種幾乎存在于所有的真核細(xì)胞的一種蛋白，可以與細(xì)胞內(nèi)其它大分子如磷脂酰肌醇二磷酸，富含脯氨酸的蛋白質(zhì)等共同作用。經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)Profilin在生命活動過程有非常重要的作用，如參與了細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、真核細(xì)胞中亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的運(yùn)動等過程。除此之外，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了profilin基因在細(xì)胞伸長、細(xì)胞形態(tài)的維持、根毛的極性生長、開花時(shí)間等方面起著重要的作用［18］。同時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，使用UV-B輻射小麥時(shí)，小麥根尖的體細(xì)胞中的染色體發(fā)生了異常的分裂［19］，為了研究這種機(jī)制，我們使用Profilin抗體進(jìn)行標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，在染色體異常分裂的同時(shí)還伴隨著Profilin的異常的分布，從而推測Profilin可能參與了染色體的分裂過程。而不同的Profilin的異構(gòu)體在細(xì)胞中分別執(zhí)行著各自不同的功能，其中PRF1在調(diào)控植物細(xì)胞的生長中扮演著重要的角色，所以Profilin-1在細(xì)胞內(nèi)的分布以及動態(tài)值得研究。在本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用擬南芥瞬時(shí)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)PRF1定位在擬南芥原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，這與Wang［20］使用穩(wěn)定表達(dá)體系獲得PRF1定位的結(jié)果相一致，說明這個(gè)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)適合于定位信號的研究。

近幾年來，瞬時(shí)表達(dá)已經(jīng)陸續(xù)地被運(yùn)用到生物學(xué)研究中，如利用該系統(tǒng)進(jìn)行基因功能的鑒定分析、蛋白質(zhì)互作、亞細(xì)胞定位等。在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用了PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)染和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法來研究PRF1的亞細(xì)胞定位，從結(jié)果中可以看出PRF1在煙草表皮細(xì)胞中主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，在擬南芥原生質(zhì)體中主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。對兩種體系所獲得的不同結(jié)果表明，應(yīng)用不同體系研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位可能出現(xiàn)不同的結(jié)果，這可能是異源的細(xì)胞產(chǎn)生偏差的結(jié)果。從兩種體系操作過程中發(fā)現(xiàn)，煙草生長周期短，轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟，易操作，不需要酶解細(xì)胞壁等優(yōu)點(diǎn)，因此農(nóng)桿菌注射煙草葉片的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率比較高，能夠獲得大片的陽性細(xì)胞，且能夠比較清楚的看到PRF1在葉表皮的定位。但是由于受到物種和農(nóng)桿菌親和性的原因，農(nóng)桿菌注射的方法更適用于細(xì)胞中生物分子相互作用的研究。而擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系周期短，易獲得活力強(qiáng)的原生質(zhì)體細(xì)胞，通過PEG轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的方法能夠清晰的看到瞬時(shí)表達(dá)目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位。

4 結(jié)論

在本研究中，我們通過使用兩種不同的瞬時(shí)表達(dá)的方法，研究了PRF1的定位，結(jié)果表明將PRF1基因?qū)霐M南芥的原生質(zhì)體和煙草表皮細(xì)胞后，融合蛋白綠色熒光均能被觀察到，PRF1基因與GFP融合蛋白的產(chǎn)物在煙草表皮細(xì)胞中主要定位在細(xì)胞質(zhì)和外周細(xì)胞器中，在擬南芥的原生質(zhì)體中主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。在本實(shí)驗(yàn)中所使用的兩種瞬時(shí)表達(dá)體系，均得到了一定的結(jié)果，但是相對于煙草的瞬時(shí)表達(dá)體系，擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)能夠很好的研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Subcellular Localization of Profilin-1 from Arabidopsis Utilizing Two Transient Expression Systems

ZHANG Xiao-hui HAN Rong
（Higher Education Key Laboratory of Plant Molecular and Environmental Stress Response，College of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen 041000）

Here we study the subcellular localization of profilin-1（PRF1）using two transient expression methods and compare the advantages and disadvantages of two transient expression methods in the subcellular localization. Using the leaves of Arabidopsis thaliana as material，the total RNA from the leaves was extracted，and PRF1 gene was cloned using specific primers by RT-PCR and then ligated to pCAMBIA1300-GFP vectors，finally one plant expression vector pCAMBIA1300- GFP-PRF1 was constructed successfully. Two transient expression systems，agroinfiltration of tobacco leaves，and PEG transformation of protoplasts isolated from the leaves of Arabidopsis thaliana were adopted. The expression of the fusion proteins was observed by a confocal laser scanning microscopy. The results showed that the green fluorescence of the fusion protein was observed when the PRF1 gene was introduced into the protoplasts of A. thaliana and tobacco epidermal cells，the product of PRF1 gene and GFP fusion protein was mainly localized in the cytoplasm of tobacco epidermal cells，and there was also an expression in the nuclear cell organelle. PRF1 was localized in the nucleus and cytoplasm of Arabidopsis thaliana. The localization of PRF1 protein was different in two different transient expression systems，which may be related to the characteristics of the plants that are homologous or heterologous expression.

Arabidopsis thaliana；PRF1；transient expression；protoplasts；GFP

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.008

2016-11-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30671061），山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20041101，2008011059-1）

張曉慧，女，碩士研究生，研究方向：植物細(xì)胞學(xué)；E-mail：zhangxiaohuifig@163.com

韓榕，男，博士，教授，研究方向：環(huán)境植物學(xué)；E-mail：hhwrsl@163.com