馮小艷 張樹珍

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所，?？?571101）

綜述與專論

RNAi作用機制及應用研究進展

馮小艷 張樹珍

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所，海口 571101）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由小非編碼RNA（small non-coding RNA，sncRNA）誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，廣泛存在于真核生物中。RNAi現(xiàn)象自發(fā)現(xiàn)以來，很快成為生物學研究的熱點，并取得了一定成果。就RNAi的作用機制、作用過程的關鍵因子及其應用的研究進展進行綜述，以期為RNAi的進一步研究提供參考。

RNAi；作用機制；dicer；argonaute蛋白家族；RdRP

狹義的RNA干擾（RNA interference，RNAi），是指由長雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）產(chǎn)生的小RNA介導序列特異性mRNA降解，進而引發(fā)基因沉默的現(xiàn)象。廣義的RNAi，是指由小非編碼RNA（Small non-coding RNA，sncRNA）誘導mRNA降解、抑制翻譯或促使異染色質形成等，進而引發(fā)基因沉默的現(xiàn)象［1-3］。本文所描述的RNAi指的是廣義RNAi。

1998年，F(xiàn)ire和Mello等［4］在線蟲（Caenorhabditis elegans）的研究中首次描述了RNAi現(xiàn)象。他們在研究反義RNA作用的過程中發(fā)現(xiàn)，正義RNA和反義RNA的混合物，即dsRNA對基因的沉默作用遠遠強于任一單鏈RNA，并將dsRNA（實際是由dsRNA產(chǎn)生的小RNA）引起的基因沉默現(xiàn)象稱為RNAi。此后，人們在果蠅（Drosophila melanogaster）、錐蟲（Trypanosoma）、渦蟲（Planaria）、水螅（Hydra）、斑馬魚（Barchydanio rerio）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、青蛙（Rana nigromaculata）、小鼠及人類等多種真核生物中均發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象［5，6］。RNAi是真核生物獨有的基因沉默現(xiàn)象，普遍存在于真核生物中，是真核生物調控內源基因表達及抵御外源核酸入侵的高效自我保護系統(tǒng)［7，8］。本文從廣義的角度對RNAi的作用機制、作用過程的關鍵因子及其應用的研究進展進行綜述，以期為RNAi的進一步深入研究提供參考。

1 RNAi的作用機制

RNAi由長度為20-30 nt的sncRNA觸發(fā)，根據(jù)sncRNA生物合成和作用機制的不同，可將其分為siRNA（small interfering RNA）、miRNA（microRNA）和piRNA（PIWI-interacting RNA）3種［9］。

1.1 siRNA的作用機制

siRNA的作用機制見圖1。由于RNA病毒入侵、基因組中反向重復序列轉錄、轉座子轉錄、自退火轉錄或實驗轉染等原因，使得細胞中出現(xiàn)內源性或外源性的dsRNA，核酸內切酶Dicer識別dsRNA，并將其剪切成長度為21-25 nt、5'端含有一個磷酸基團、3'端含有一個羥基并且突出2 nt的siRNA［9-12］。siRNA的這一結構對于RNAi是必要的，缺乏5'端磷酸化的siRNA或平端siRNA無論在細胞內外都無法啟動RNAi［13］。人工導入的siRNA需要經(jīng)過細胞質中的激酶Clp1加工成5'端磷酸化的siRNA才能參與誘導靶基因沉默［14］。具有一定結構的siRNA隨后在Dicer的幫助下與AGO2等結合，構成siRNA誘導沉默復合體（siRNA-induced silencing complex，siRISC），siRISC中 的 siRNA經(jīng)AGO2作用分解成兩條單鏈，正義鏈被釋放出去，反義鏈則留在siRISC中。僅含反義鏈的siRISC被激活，在反義鏈的引導下通過堿基互補配對原則與靶基因結合，進而誘導靶基因的沉默。沉默發(fā)生后，靶基因被釋放，使得siRISC能與另一個靶基因結合，開始誘導新一輪的基因沉默［10，15，16］。

siRISC誘導基因沉默的具體方式包括以下3種：（1）反義siRNA與靶mRNA完全互補配對（一般發(fā)生在mRNA的編碼區(qū)或開放閱讀框中），siRISC中具有核酸內切酶活性的AGO2剪切靶mRNA，啟動靶mRNA的降解，一旦最初降解形成，細胞中的核酸外切酶就會攻擊剩余片段以完成整個降解過程，從而導致靶基因沉默，這是siRISC的主要作用方式［17-20］。（2）反義siRNA與靶mRNA不完全配對（一般發(fā)生在mRNA的3'非編碼區(qū)），此時的siRISC將抑制靶mRNA的翻譯或引發(fā)靶mRNA的降解。siRISC通過與翻譯起始復合物競爭mRNA的5'帽子結構、影響核糖體大小亞基的聚合等作用在翻譯的起始階段抑制翻譯，或者通過減緩核糖體在翻譯中的移動速度、促進核糖體的提早解離等作用在翻譯的其他階段抑制翻譯。siRISC還可以促進脫帽酶切除mRNA的5'帽子結構，脫腺苷酶切除mRNA的3'端poly（A）尾巴，使mRNA失去5'和3'端的保護而被核酸外切酶攻擊，最終導致mRNA的降解［21-23］。（3）除了作用于mRNA在轉錄后水平調控基因表達外，siRISC也可作用于DNA在轉錄水平調控基因的表達。siRISC通過激活甲基化酶或抑制去甲基化酶的作用，引發(fā)DNA的甲基化，DNA的甲基化進一步導致染色質蛋白的甲基化、乙?；?、磷酸化和泛素化等，從而促進異染色質的形成，引發(fā)基因沉默［21，24-26］（圖1）。

雙鏈siRNA進入siRISC后，經(jīng)AGO2作用解開成兩條單鏈，反義鏈留在siRISC中引導siRISC沉默靶基因，正義鏈被釋放出去。被釋放的正義鏈可能很快被降解，也可能作為引物，在RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）的催化下以靶mRNA為模板擴增得到dsRNA，dsRNA又被Dicer降解成siRNA進入RNAi循環(huán)，從而使得RNAi的效果級聯(lián)放大［10，27-29］。

1.2 miRNA的作用機制

與siRNA主 要 來 自 外 源 性dsRNA不同，miRNA主要源于生物自身的基因組［31］。細胞核內編碼miRNA的基因在RNA聚合酶II或聚合酶III（polymerase II/ polymerase III，Pol II/Pol III）的作用下轉錄得到pri-miRNA，pri-miRNA是一個具有帽子結構、poly（A）尾巴、一個或多個莖環(huán)結構的大分子RNA，長度從數(shù)百到數(shù)萬個堿基不等。primiRNA經(jīng)Drosha或Mirtron作用，去除帽子結構和poly（A）尾巴，得到長度約為70 nt的pre-miRNA，pre-miRNA通常具有莖環(huán)結構，且其3'端突出2 nt。pre-miRNA被轉運蛋白Exportin 5轉運到細胞質中，在細胞質中被Dicer剪切成長度約為22 nt的miRNA：miRNA*雙鏈［21，32］。這種雙鏈miRNA的分子結構與siRNA相似，同樣是5'端具有磷酸基團，3'端具有羥基且突出2 nt，不同的是siRNA的兩條鏈完全互補配對，而miRNA的兩條鏈只是部分互補配對［33］。miRNA：miRNA*雙鏈很快與AGO（AGO1-4，主要是AGO1）等結合形成miRNA誘導沉默復合體（miRNA-induced silencing complex，miRISC），隨后miRNA：miRNA*雙鏈中5'端堿基配對穩(wěn)定性較強的正義鏈miRNA*迅速被降解，5'端堿基配對穩(wěn)定性較弱的反義鏈miRNA則保留在miRISC中。僅含反義鏈的miRISC被激活，在反義鏈miRNA的引導下通過堿基互補配對原則識別靶基因，誘導靶基因沉默［9，21］（圖1）。

圖1 RNAi作用機制示意圖［10，30］

siRNA主要通過完全互補配對的方式與靶基因結合，并通過直接剪切作用誘發(fā)靶基因的降解，從而保護體內基因組不受轉座子活動或病毒感染等外源性因素的影響。與之不同，miRNA主要通過不完全配對的方式與靶mRNA結合，抑制靶mRNA的翻譯或引發(fā)靶mRNA的降解，從而內源性的調控體內基因的表達［34，35］。miRNA與靶mRNA不完全配對時的具體作用機制與siRNA與靶mRNA不完全配對時的具體作用機制類似，亦是通過與翻譯起始復合物競爭5'帽子結構或影響核糖體的正常功能等作用抑制靶mRNA的翻譯，以及通過促進相應酶切除mRNA的5'和3'端保護結構等作用誘發(fā)靶基因的降解［21，36-38］。與siRNA一致，miRNA也可以與靶基因完全互補配對，通過直接剪切作用誘發(fā)靶基因的降解［39］。此外，miRNA也能作用于DNA，通過誘導DNA甲基化，促進異染色質的形成，從而在轉錄水平調控基因的表達［40］（圖1）。

1.3 piRNA的作用機制

RNAi過程中，3種sncRNA均與Argonaute蛋白家族結合，Argonaute蛋白家族包括AGO和PIWI兩類亞家族，siRNA和miRNA與AGO亞家族結合，而piRNA則與PIWI亞家族結合［41，42］。piRNA途徑是動物特有的，主要存在于動物的生殖細胞中［43］。piRNA的具體作用機制尚未闡明，目前對piRNA的認識尚處于初級階段。

基因間的重復序列、活躍的轉座子基因或piRNA基因簇轉錄得到的單鏈piRNA前體，經(jīng)具有核酸酶活性的PIWI蛋白加工，得到長度約為24-32 nt的piRNA。與siRNA和miRNA不同，piRNA的生成不需要Dicer的參與。piRNA的生物合成涉及初級加工和次級加工兩條途徑。初級加工途徑產(chǎn)生初級piRNA，初級piRNA經(jīng)次級加工途徑（亦稱ping-pong循環(huán)）擴增。初級加工及初級piRNA與PIWI蛋白的結合發(fā)生在細胞質中，但初級加工過程所需的因子尚未清楚。在ping-pong循環(huán)中，初級piRNA依次被PIWI蛋白MILI和MIWI2（即PIWIL2和PIWIL4）剪切其5'端，由此決定piRNA的5'端結構，決定piRNA 3'端結構的核酸酶目前未知［30，44］。piRNA可以通過直接剪切靶mRNA或者促進異染色質的形成等方式誘導基因沉默，從而在轉錄后水平或轉錄水平調控基因的表達［45，46］。

2 RNAi過程的關鍵因子

RNAi過程中有多個關鍵因子參與，其中最為重要的是Dicer、Argonaute蛋白家族和RdRP。

2.1 Dicer

Dicer是一個高度保守的ATP依賴的核酸內切酶，隸屬于RNaseIII家族。在RNAi途徑中，siRNA和miRNA的生成依賴Dicer的剪切活性。Dicer的分子量在200 kD左右，具有4個特征結構域，從N端到C端依次為DEXD/H解旋酶結構域、PAZ結構域、兩個串聯(lián)的RNaseIII（RNaseIIIa和RNaseIIIb）結構域及dsRBD結構域，其中PAZ結構域有助于識別底物，dsRBD結構域結合底物，DEXD/H解旋酶結構域使底物解螺旋，RNaseIII結構域則參與了底物的剪切。Dicer的作用底物為dsRNA，為了剪切dsRNA的兩條鏈，需要兩個Dicer共同起作用，形成二聚體。Dicer二聚體中含有4個復合的剪切活性中心（RNaseIII活性中心），但在剪切過程中，僅兩個活性中心發(fā)揮作用，另外兩個活性中心失活，因為兩個活性中心間隔22 nt，因此Dicer剪切產(chǎn)生的siRNA和miRNA的長度為22 nt。然而，Dicer結構的微小改變會導致剪切活性中心間隔的變化，從而使得剪切產(chǎn)物的長度略有差異［1，29，47］。

2.2 Argonaute蛋白家族

Argonaute是RNAi過程中的核心組分，siRNA、miRNA或piRNA錨定在Argonaute上引導Argonaute作用于靶基因，從而引發(fā)靶基因沉默。Argonaute蛋白家族包括AGO和PIWI兩類亞家族。AGO亞家族在各組織中均表達，它與siRNA或miRNA結合，主要通過影響mRNA的穩(wěn)定或抑制翻譯在轉錄后水平調控基因表達。PIWI亞家族主要在動物的生殖細胞中表達，它與piRNA一起作用誘導轉座子沉默［48-50］。Argonaute的分子量約為100 kD，具有PAZ和PIWI兩個特征結構域。其中，PAZ結構域與Dicer共享，能直接契合Dicer剪切形成的RNA 3'端突出2 nt；PIWI結構域具有類似RNase H的催化核心結構，能對靶mRNA進行剪切，但在進化過程中，部分Argonaute家族成員由于PIWI 結構域中的氨基酸序列發(fā)生變化而使其喪失了原有的核酸內切酶活性［21，51，52］。在人類的4個AGO蛋白（AGO1-4）中，僅AGO2具有剪切活性，但在果蠅中，所有的AGO蛋白和PIWI蛋白均具有剪切活性。除了PIWI結構域介導的剪切，Argonaute還可與其他蛋白因子相互作用，通過誘導翻譯抑制、mRNA降解、異染色質形成等方式沉默基因［30，53］。

2.3 RdRP

RdRP是RNAi信號擴增的核心分子。它可以RISC釋放出的正義siRNA為引物，靶mRNA為模板，通過“下降PCR”的方式合成dsRNA；還可通過非引物依賴的方式，以一些異常的單鏈mRNA為模板合成dsRNA。這些dsRNA被加工成新的siRNA進入RNAi循環(huán)，如此反復從而使RNAi效應放大。參與RNAi的RdRP同系物存在于真菌、線蟲和植物中，目前還未在果蠅和哺乳動物體內發(fā)現(xiàn)RdRP同系物，其體內缺失的參與RNAi的RdRP同系物可由其他RdRP替代，如一些病毒RdRP的水平轉移。實際上，有證據(jù)表明果蠅和脊椎動物中存在RdRP類似物，但是這些物質是否參與及如何參與RNAi過程仍有待研究［1，29，54］。

3 RNAi的應用

3.1 在基因功能研究中的應用

隨著分子生物學的發(fā)展，人們完成了眾多生物的全基因組測序工作，對這些全基因組序列進行基因功能分析相當重要。通過RNAi特異沉默基因表達，比較基因沉默前后生物表型的變化，可以闡明基因的功能。與傳統(tǒng)的基因敲除手段相比，RNAi技術具有快速、高效、特異性強、操作簡易等優(yōu)點，已成為研究基因功能的強有力工具，在后基因組時代中發(fā)揮重要作用［55］。

Kimber等［56］利用RNAi技術沉默馬鈴薯白線蟲（Globodera pallida）的FMRF酰胺類多肽（FMRFamide-like peptides，F(xiàn)LP）基因發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯白線蟲的運動功能受到了阻礙，表明flp對馬鈴薯白線蟲的正常運動功能是必須的。Zhang等［57］鑒定了東亞飛蝗（Locusta migratoria manilensis）幾丁質合成酶1基因（Chitin synthase 1 gene，LmCHS1）的2個可變剪接體LmCHS1A和LmCHS1B，并利用RNAi技術對它們的功能進行了分析，結果顯示注射LmCHS1、LmCHS1A和LmCHS1B dsRNA的幼蟲死亡率分別為95%、88%和51%，其中，注射LmCHS1A和LmCHS1 dsRNA的幼蟲表型相似，均表現(xiàn)為發(fā)育遲緩，蛻皮過程中舊角質層無法脫離，蛻皮之后新的角質層薄，后腿彎曲，無法行走，身體扭曲，而注射LmCHS1B dsRNA的幼蟲表皮褶皺，無法完成蛻皮，以上結果表明，LmCHS1的可變剪接體在東亞飛蝗的生長和發(fā)育過程中均發(fā)揮重要作用。Dong等［58］克隆了番茄（Solanum lycopersicum）的MADS-box基因SlMADS1，為了進一步探討SlMADS1的功能，他們利用RNAi技術沉默該基因發(fā)現(xiàn)，SlMADS1沉默的番茄果實成熟時間縮短，參與果實成熟的乙烯合成基因和乙烯應答基因表達水平均上調，乙烯產(chǎn)量比野生型增加近2-4倍，這些結果提示SlMADS1是番茄果實成熟的重要負調控因子。

3.2 在信號傳導通路研究中的應用

信號傳導是一個十分復雜的過程，傳統(tǒng)的缺失突變技術和RNAi技術相結合可以方便確定信號傳導通路中各個基因的上下游關系［59］。Clemens等［60］用dsRNA干擾果蠅細胞系來研究胰島素信號傳導通路，得到的結果與已知胰島素信號傳導通路完全一致，表明RNAi技術可用于分析復雜的信號傳導通路。轉染是研究信號傳導通路的傳統(tǒng)方法，但該方法具有重組蛋白非生理聚集及轉染效率不高的缺點，RNAi技術克服上述缺點，并且具有簡單、快速、重復性好等優(yōu)勢，是研究信號傳導通路的有力手段［59］。

3.3 在疾病治療中的應用

RNAi技術能高效、特異地下調靶基因的表達，是一種十分有前景的疾病治療方法。與其他治療方法相比，RNAi治療效果持續(xù)時間長，使得治療費用降低，且治療所需的sncRNA劑量小，降低或消除了不良反應的發(fā)生。目前，基于RNAi的治療研究主要針對癌癥、病毒感染和眼部疾病等［10］。

polo樣激酶1（polo-like kinase 1，PLK1）和紡錘體驅動蛋白（Kinesin spindle protein，KSP）是必要的細胞周期蛋白，與癌癥的發(fā)生密切相關。抑制PLK1和KSP的活性將誘導有絲分裂阻滯和癌細胞凋亡，因此，PLK1和KSP可以作為癌癥治療的靶點。研究者對靶向PLK1和KSP的siRNA進行化學修飾，并將修飾的siRNA通過靜脈注射到小鼠腫瘤模型中，結果顯示，siRNA有效沉默了靶基因，抑制了PLK1和KSP的生物學活性，引起廣泛的有絲分裂受阻和腫瘤細胞凋亡，從而有力抵抗了癌癥［61］。人類細小病毒B19（Human parvovirus B19，B19V）可引發(fā)急性和慢性心肌炎，并伴隨內皮功能紊亂，目前還沒有治療B19V感染的有效方法。Brandt等［62］將靶向B19V結構蛋白VP2基因的短發(fā)卡RNA（Short hairpin RNA，shRNA）經(jīng)腺病毒載體介導進入感染了B19V的UT7/Epo-S1細胞中，結果顯示，VP2的mRNA水平顯著降低，B19V的復制受到明顯抑制，提示靶向結構B19-VP2基因的RNAi技術可用于治療B19V感染。艾滋病是一種嚴重威脅人類生命安全的傳染病，由人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）引起。HIV主要攻擊人體T淋巴細胞，破壞免疫系統(tǒng)，從而使人體感染各種疾病，最終導致艾滋病。高效抗逆轉錄病毒療法（Highly active antiretroviral therapy，HAART） 是治療艾滋病的常用方法，但該方法具有耐藥性等缺陷，因此仍然需要尋找更好的治療手段［63］。將靶向HIV-1 Nef 的siRNA導入人類T細胞中，有效抑制了細胞中HIV-1的復制，表明RNAi介導的基因療法是治療艾滋病的潛在手段，值得深入研究［64，65］。眼部因其具有局限的密閉空間，便于局部用藥，因此成為RNAi治療的理想靶器官［66］。整合素連接激酶（Integrin linked kinase，ILK）具有調節(jié)細胞增生、分化、遷移和凋亡的作用。Zheng等［67］將靶向ILK的siRNA通過慢病毒載體介導進入視網(wǎng)膜Müller細胞后，細胞中ILK的mRNA和蛋白水平均顯著下降，α-平滑肌肌動蛋白應力纖維減少，細胞遷移和細胞介導的凝膠收縮明顯受到抑制，這提示RNAi可以作為與Müller細胞分化相關的眼部纖維增生性疾病的治療新方法。

4 結語

RNAi技術具有高效、簡捷、特異性強等優(yōu)點，是研究基因功能、信號傳導通路和治療疾病的有力工具，但目前仍存在一些無法完滿解決的問題，如RNAi的詳盡作用機制，包括RISC的具體組分及各組分的結構和功能、piRNA初級加工過程所需因子、決定piRNA 3'端結構的核酸酶等都尚未清楚，以及RNAi應用過程中存在的脫靶效應［68］。相信隨著研究的不斷深入，這些問題將逐漸得到解決，RNAi技術將更好地為人們所用。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Advances on RNAi Mechanism and Its Application

FENG Xiao-yan ZHANG Shu-zhen
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101）

RNA interference（RNAi）is a gene silencing phenomenon induced by small non-coding RNA（sncRNA），which is widely found in eukaryotes. RNAi has become the focus of biological research with some achievements since its discovery. In order to provide some references for the further study of RNAi，the mechanism of RNAi，the key factors involved in RNAi and the application of RNAi are reviewed in this paper.

RNAi；mechanism；dicer；argonaute protein family；RdRP

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.001

2016-10-20

國家自然科學基金項目（31371687）

馮小艷，女，碩士，研究實習員，研究方向：植物分子育種；E-mail：fengxiaoyan@itbb.org.cn

張樹珍，女，博士，研究員，研究方向：甘蔗生物技術；E-mail：zhangshuzhen@itbb.org.cn