齊心潔王玥，2王彥晟方國(guó)康黃迎春，2

（1. 北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2. 生物質(zhì)廢棄物資源化利用北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100023）

技術(shù)與方法

等溫滴定量熱法在蛋白質(zhì)-配體相互作用中的應(yīng)用

齊心潔1王玥1，2王彥晟1方國(guó)康1黃迎春1，2

（1. 北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2. 生物質(zhì)廢棄物資源化利用北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100023）

等溫滴定量熱法（ITC）近年來迅速發(fā)展并廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域的研究分子相互作用的生物物理技術(shù)，它是在恒定溫度下唯一能夠直接測(cè)量復(fù)合物形成過程中的熱量變化的方法。它可以簡(jiǎn)單地通過測(cè)量?jī)蓚€(gè)溶液相互作用時(shí)吸收或放出的熱量來提供分子相互作用的重要信息，如結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、自由能、焓和熵。綜述了ITC的工作原理、技術(shù)特點(diǎn)，以及在蛋白質(zhì)-配體相互作用方面的最新應(yīng)用和未來的發(fā)展方向，表明ITC數(shù)據(jù)結(jié)果的有效性及其在該領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。

等溫滴定量熱法；熱力學(xué)；相互作用；蛋白質(zhì)；小分子

生物分子的生物活性是通過分子之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)的，因此研究生物分子之間的相互作用對(duì)于揭示生命現(xiàn)象發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)具有重要的意義。所有生物過程的一個(gè)基本原則是分子的組成和識(shí)別［1］。對(duì)蛋白質(zhì)-其他分子相互作用的分子基礎(chǔ)進(jìn)行更深入理解的前提是復(fù)合物形成的熱力學(xué)特征和能量的量化。量熱技術(shù)是獲取體系中分子間相互作用熱力學(xué)信息的直接方法，能夠揭示分子間相互作用的存在和相互作用的性質(zhì)［2，3］。在相互作用的過程中我們通常把一方稱為受體，把另一方稱為配體。而在等溫滴定量熱法（Isothermal titration calorimetry，ITC）實(shí)驗(yàn)中，注入注射器中的反應(yīng)物通常被稱為配體。ITC可以直接提供蛋白質(zhì)-配體相互作用的完整熱力學(xué)特性，是近10年間在蛋白質(zhì)科學(xué)研究中發(fā)展最快的技術(shù)之一［3-6］。與其他方法不同的是，ITC不需要蛋白質(zhì)的固定化和/或修飾，因?yàn)闊崃康奈栈蜥尫攀菐缀跛械纳锘瘜W(xué)反應(yīng)的固有性質(zhì)［3-6］。

目前，等溫滴定量熱技術(shù)在蛋白質(zhì)-配體相互作用研究領(lǐng)域日益普及的原因主要有以下4點(diǎn)：（1）實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行，只需極少量蛋白就能獲得大量的熱力學(xué)數(shù)據(jù)；（2）在某些情況下，測(cè)量一系列蛋白質(zhì)-配體相互作用的結(jié)合常數(shù)可能是相近的或不好區(qū)分的［7］，但是，通過它們的焓變值和熵變值就可以進(jìn)一步區(qū)分；（3）雖然ITC實(shí)驗(yàn)不能夠直接提供蛋白質(zhì)-配體相互作用時(shí)熱力學(xué)信息與復(fù)合體結(jié)構(gòu)之間的相互關(guān)系，但是可以通過比較蛋白質(zhì)發(fā)生構(gòu)象變化前后的數(shù)據(jù)從而得到合理的結(jié)論；（4）恒壓熱容與蛋白質(zhì)界面內(nèi)表面變化的關(guān)系已被證明是解釋蛋白質(zhì)-配體相互作用中結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)兩方面的有用工具［8，9］，ITC在不同的實(shí)驗(yàn)溫度下均可直接測(cè)定恒壓熱容的精確值。隨著高靈敏度儀器的發(fā)展。例如，MicroCal公司的VP-ITC和ITC-200滴定熱量計(jì)，將有助于我們更好地解釋蛋白質(zhì)-配體相互作用在各種生命現(xiàn)象［3-6］中的重要作用。等溫滴定量熱技術(shù)可用于幾乎所有類型的蛋白質(zhì)-配體的相互作用，以往的研究大多數(shù)集中在蛋白質(zhì)-DNA/ RNA相互作用、蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用、抗原-抗體相互作用和酶動(dòng)力學(xué)等［10-12］。本文參考國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的文獻(xiàn)對(duì)ITC在蛋白質(zhì)-配體相互作用中的應(yīng)用及ITC技術(shù)在蛋白質(zhì)科學(xué)領(lǐng)域的研究成果以及未來的發(fā)展進(jìn)行總結(jié)，表明ITC數(shù)據(jù)結(jié)果的有效性及其在該領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。

1 ITC方法概述

1.1 ITC的滴定原理

生物大分子如蛋白質(zhì)有序空間結(jié)構(gòu)或復(fù)合物的形成都是可逆的熱驅(qū)動(dòng)過程，不論是分子內(nèi)或分子間的生化反應(yīng)，在反應(yīng)前后都會(huì)有一定程度的熱量改變。等溫滴定量熱法利用的是功率補(bǔ)償原理，通過單次濃度掃描能夠準(zhǔn)確得到體系在較寬的濃度組成范圍內(nèi)發(fā)生的分子間相互作用的焓變，直接測(cè)量蛋白質(zhì)-配體反應(yīng)的熱量變化，擬合計(jì)算結(jié)合熱力學(xué)參數(shù)［13］。簡(jiǎn)單地說，就是指將一種反應(yīng)物配制成澄清溶液放在一個(gè)溫控樣品池（Sample cell）中，通過一個(gè)熱電偶回路與參比池（Reference cell）偶聯(lián)，另一種反應(yīng)物作為配體置于注射器（Syringe）中。其中，樣品池和參比池通過絕熱裝置隔開，但保持環(huán)境條件相同。在恒定溫度下，注射器以一定速度向樣品池中不斷滴加配體，注射器還具有攪拌功能，反應(yīng)一定時(shí)間，儀器測(cè)量樣品池的熱量變化并使其與參比池平衡，顯示為一個(gè)吸熱或放熱的峰［13-15］。放熱反應(yīng)觸發(fā)恒溫功率的負(fù)反饋，而吸熱反應(yīng)則觸發(fā)恒溫功率的正反饋來保持溫度恒定［13］。實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。

圖1 等溫滴定量熱原理

用儀器自帶的軟件對(duì)兩反應(yīng)物相互作用模式進(jìn)行擬合，可以直接計(jì)算溶液中兩個(gè)或多個(gè)分子之間反應(yīng)結(jié)合焓（ΔH）、定壓熱容（ΔCp）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）、結(jié)合平衡常數(shù)（Ka）和動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)（如酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)Km和催化速度常數(shù)Kcat）［5］，從而得出反應(yīng)吉布斯自由能（ΔG）和熵變（ΔS）［5］。它們之間的關(guān)系式如下：

其中，R是摩爾氣體常數(shù)，T是熱力學(xué)溫度。

ITC測(cè)量的Ka范圍在102-109L/mol，且反應(yīng)的ΔG與體系中因復(fù)合形成而導(dǎo)致非極性表面的包埋呈一定的正相關(guān)關(guān)系，通過計(jì)算結(jié)合過程的希爾常數(shù)還可以確定蛋白質(zhì)-小分子的反應(yīng)類型。根據(jù)Ross和Subramanian的觀點(diǎn)［16］可知體系中存在兩類結(jié)合反應(yīng)。第一類結(jié)合：ΔH0＞ 0（吸熱），ΔS0＞ 0（熵增），TΔS0＞ ΔH0熵增效應(yīng)較大并決定該過程的ΔG0＜0，故表現(xiàn)為熵驅(qū)動(dòng)過程，疏水相互作用是熵驅(qū)動(dòng)的主要推動(dòng)力。第二類結(jié)合：ΔH0＜ 0（放熱），ΔS0＞ 0（熵增），|ΔH0| ＞ |TΔS0|，放熱和熵增效應(yīng)均導(dǎo)致該過程的ΔG0＜ 0，故表現(xiàn)為以焓驅(qū)動(dòng)為主的焓-熵補(bǔ)償驅(qū)動(dòng)過程，氫鍵、靜電相互作用是焓-熵補(bǔ)償驅(qū)動(dòng)的主要推動(dòng)力。在原則上，焓驅(qū)動(dòng)的優(yōu)化更有利于形成高特異性化合物，然而實(shí)際卻極難實(shí)現(xiàn)。這是因?yàn)殪仳?qū)動(dòng)主要由于疏水性相互作用推動(dòng)，更容易實(shí)現(xiàn)。

1.2 ITC的特點(diǎn)

生物分子之間的相互作用是生命現(xiàn)象發(fā)生的基礎(chǔ)，因此研究生物分子之間的相互作用可以闡明生物反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制，揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)。近年來，研究生物分子相互作用的技術(shù)不斷出現(xiàn)，在表1中比較了近年來常見的幾種研究蛋白質(zhì)-配體相互作用的方法。

表1 研究蛋白質(zhì)-配體相互作用方法的比較

1.3 ITC技術(shù)新發(fā)展

隨著蛋白質(zhì)科學(xué)研究的不斷深入，一些新的ITC技術(shù)隨之發(fā)展，如ITC的反向滴定和置換滴定法。通常，小分子應(yīng)當(dāng)被注入注射器中，目標(biāo)蛋白質(zhì)應(yīng)該在樣品池中。但有時(shí)用反向滴定（Reverse titration），即互換高分子和配位體來測(cè)定二者的結(jié)合模式更為合適［13，24］。另外，在藥物開發(fā)設(shè)計(jì)對(duì)目標(biāo)蛋白具有高結(jié)合親和力的配位體和抑制劑時(shí)，一旦相互作用的結(jié)合親和力接近或超過納摩爾級(jí)水平，對(duì)其精確測(cè)定將變得十分困難。ITC可以通過置換滴定法（Displacement titration）確定皮摩爾范圍的配體的完整結(jié)合熱力學(xué)信息，這是ITC發(fā)展史上一個(gè)新的、重要的進(jìn)展［13］。近年來，這種置換滴定方法已經(jīng)被成功應(yīng)用在超高/超低親和系統(tǒng)的量熱學(xué)上［13，25］。這種方法的基本原理是當(dāng)另一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性配體存在時(shí)，結(jié)合反應(yīng)的配體結(jié)合性質(zhì)被改變。

2 ITC在蛋白質(zhì)-配體相互作用中的應(yīng)用

2.1 ITC在蛋白質(zhì)-活性小分子相互作用中的應(yīng)用

金屬離子在許多生命過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，研究金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用是生命科學(xué)的重要內(nèi)容，是化學(xué)和生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。許多人類的疾病與金屬離子-蛋白質(zhì)的異常相互作用相關(guān)，通過ITC實(shí)驗(yàn)獲得蛋白質(zhì)-金屬離子相互作用的熱力學(xué)信息便于人們更好地理解二者的結(jié)合模式，并且有利于對(duì)相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理作出合理的解釋［26］。Makowska等［27］用等溫滴定量熱技術(shù)和熒光猝滅分析方法研究了Cu2+與FBP28蛋白（甲酸精結(jié)合蛋白）N'端WW結(jié)構(gòu)域Tyr-Lys-Thr-Ala-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr-NH2（D9）及其突變體Tyr-Lys-Thr-Ala-Asn-Gly-Lys-Thr-Tyr-NH2（D9_M）的相互作用，ITC測(cè)得Cu2+-D9與Cu2+-D9_M復(fù)合體的化學(xué)計(jì)量比約為1∶1，用D9的突變體D9_M替換D9并不影響化學(xué)計(jì)量比但會(huì)降低對(duì)Cu2+的親和力。這種熱力學(xué)穩(wěn)定性的改變是由于Asn（D9_M）替換了D9肽段的中間部分的Asp15殘基，表明肽環(huán)中特殊結(jié)合位點(diǎn)的改變使之與Cu2+產(chǎn)生了特異性結(jié)合反應(yīng)。由實(shí)驗(yàn)所測(cè)熱力學(xué)參數(shù)可得該過程為吸熱反應(yīng)（ΔH ＞0），熵增過程（ΔS ＞ 0）且TΔS0＞ ΔH0熵增效應(yīng)較大并決定該過程的ΔG0＜ 0，故表現(xiàn)為熵驅(qū)動(dòng)過程，離子相互作用是該過程的主要推動(dòng)力。此外，還研究了Cu2+與鏈球菌屬G-蛋白B3結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)突變體Asp-Val-Ala-Thr-Tyr-Thr-NH2（J1）和Glu-Val-Ala-Thr-Tyr-Thr-NH2（J2）之間的相互作用，ITC結(jié)果顯示J1和J2對(duì)Cu2+的親和力信號(hào)較弱，說明J1和J2不能與Cu2+相互作用，或者ITC技術(shù)不適合研究這種弱相互作用的結(jié)合。

金屬離子-蛋白質(zhì)相互作用的熱力學(xué)特性對(duì)理解金屬離子在生物系統(tǒng)中的作用十分關(guān)鍵［27］。蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合有利于其催化活性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能調(diào)節(jié)，等溫滴定量熱法結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)為二者結(jié)合的潛在的分子機(jī)制提供了大量的基礎(chǔ)信息。根據(jù)Irving-Williams系列［28］，二價(jià)金屬離子配體的親和力大小順序?yàn)镸n2+＜ Fe2+＜ Co2+＜ Ni2+＜ Cu2+＜ Zn2+，有時(shí)會(huì)因蛋白質(zhì)金屬結(jié)合位點(diǎn)不同而有所改變，但總體趨勢(shì)大致相同［29］。此外，金屬離子對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊十分重要，金屬離子的動(dòng)態(tài)平衡與蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)、構(gòu)象變化之間的相互關(guān)系可以通過許多神經(jīng)退行性疾病表現(xiàn)出來，其中最明顯的有卷發(fā)綜合征、威爾遜氏病，阿茨海默癥和帕金森氏?。?0］。

近年來，對(duì)無機(jī)物和混合有機(jī)-無機(jī)化合物的生物活性研究和測(cè)定其功效的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用越來越多［31］。硼團(tuán)簇作為硼中子俘獲療法（Boron neutron capture therapy，BNCT）［32，33］的硼化合物藥劑，這是一種針對(duì)惡性腫瘤的有效放療方法。研究發(fā)現(xiàn)含有硼團(tuán)簇的雜合分子為HIV-1蛋白酶（HIV-1 protease）、環(huán)氧合酶（Cyclooxygenase）、絲氨酸蛋白酶（Serine protease）和蛋白激酶C（Protein kinase C）的酶活性抑制劑。Losystkyy等［34］將穩(wěn)態(tài)和時(shí)間分辨熒光蛋白猝滅技術(shù)與等溫滴定量熱法相結(jié)合研究了一系列閉合型硼酸鹽及其官能團(tuán)衍生物與人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）和溶菌酶（Lysozyme）的相互作用。研究結(jié)果表明化合物K2［B10H10］及其芳基胺衍生物都能與HSA相互作用，結(jié)合常數(shù)分別為1.4×103M-1和1.2×103M-1，吉布斯自由能分別為-17.9 kJ/mol和-17.5 kJ/mol。然而，芳基胺衍生物（4∶1）形成的復(fù)合體比K2［B10H10］（2∶1）有更高的結(jié)合比，增強(qiáng)了分子間相互作用，降低了復(fù)合物形成時(shí)的疏水相互作用。該研究結(jié)果將有利于理解陰離子硼酸鹽與作為血液中小分子載體的血清蛋白的相互作用方式，為未來開發(fā)硼化合物藥劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.2 ITC在蛋白質(zhì)-單寧酸相互作用中的應(yīng)用

前花青素是植物體內(nèi)的復(fù)雜多酚類次生代謝產(chǎn)物，它并非單一的化合物，而是由一系列的化合物所組成，包括了大分子量和小分子量的化合物，其中小分子量的有兒茶素（焦性兒茶酚和表兒茶素）、二聚體（原花青素B系列）、三聚體（原花青素C系列）；大分子量為單寧及其聚合物［35］。其中單寧進(jìn)入口腔后可結(jié)合蛋白質(zhì)干擾消化酶的活性。高單寧食品入口感覺干澀，口腔黏膜會(huì)有褶皺感［36］。因此緩和單寧的澀味對(duì)酒類飲品十分關(guān)鍵，可以加入適當(dāng)?shù)牡鞍壮吻鍎ilmister等［37］用等溫滴定量熱法研究從可可豆中分離純化的前花青素與牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）的相互作用。利用前花青素和蛋白質(zhì)沉淀模型［38］對(duì)不同分子量的前花青素低聚物與蛋白的相互作用進(jìn)行研究。研究表明分子量較大的前花青素比分子量小的分子表面積更大，蛋白質(zhì)-單寧-蛋白質(zhì)交聯(lián)的機(jī)會(huì)也更大，當(dāng)形成三元復(fù)合物時(shí)則生成了沉淀。文章還討論了單寧與球蛋白相互作用可能涉及到多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，二者結(jié)合是隨機(jī)的，發(fā)生在蛋白質(zhì)表面疏水性區(qū)和親水性區(qū)，并沒有明確表現(xiàn)出特定的結(jié)合位點(diǎn)。這種非特異性結(jié)合結(jié)果把結(jié)合等溫線分成了兩個(gè)不同的部分，其中每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都有不同的結(jié)合常數(shù)和ΔH。滴定曲線上溫度和NaCl的影響表明兩者相互作用的吸熱的疏水作用與放熱的氫鍵作用同時(shí)發(fā)生，吸熱和放熱的結(jié)合反應(yīng)計(jì)算出的ΔH是兩個(gè)截然相反的ΔH值。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，二者相互作用的ΔS值很容易受系統(tǒng)誤差的影響。這些數(shù)據(jù)都指出等溫滴定量熱技術(shù)用于向前花青素這樣成分不單一的混合物間相互作用的研究目前還存在一些問題需要解決。

2.3 ITC在蛋白質(zhì)-糖類相互作用中的應(yīng)用

分子間的特異性識(shí)別是生命過程的核心。蛋白質(zhì)與碳水化合物的相互作用是很多細(xì)胞識(shí)別過程的基礎(chǔ)。細(xì)胞表面的糖基和蛋白質(zhì)是細(xì)胞識(shí)別外來分子的主要途徑，這種相互作用在很多生理和病理過程中扮演重要角色，如細(xì)胞黏附、病原體感染、植物與病原菌相互作用、豆科植物與根瘤菌共生過程、細(xì)胞凋亡、受精過程、癌細(xì)胞異常增生及轉(zhuǎn)移和免疫反應(yīng)等［39］。此外，糖類作為配體修飾藥物載體，具有干擾糖-蛋白之間相互作用的能力，能夠阻止細(xì)胞識(shí)別和吸附過程［40］。蛋白質(zhì)-碳水化合物相互作用在食品科學(xué)及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛研究空間，近年來，越來越受到科研人員的關(guān)注。

賴氨酸結(jié)構(gòu)域（LysM domain）是目前已知的細(xì)菌和真核生物中的一種碳水化合物結(jié)合蛋白區(qū)域。Patra等［41］用等溫滴定量熱法和熒光滴定方法研究殼寡糖與恥垢分枝桿菌結(jié)合蛋白（包含一個(gè)外源凝集素（MSL）和一個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域）的相互作用，證明每個(gè)二聚MSL-LysM分子均有兩個(gè)親和力不同的結(jié)合位點(diǎn)，且分子的親和力與殼聚糖糖鏈的長(zhǎng)度有關(guān)，且二者相互作用表現(xiàn)為負(fù)協(xié)同效應(yīng)。顯然，連接LysM和MSL結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)肽鏈的彈性對(duì)分子識(shí)別有促進(jìn)作用。雖然植物和細(xì)菌的LysM結(jié)構(gòu)域有差別，但是對(duì)肽聚糖片段和幾丁質(zhì)聚合物有同樣的識(shí)別能力。并且，該研究表明只需要兩個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域就足夠與肽聚糖結(jié)合，這與先前文獻(xiàn)報(bào)道的需要3個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域才足夠與枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌蛋白結(jié)合不一致［42-45］。同時(shí)，MSL-LysM分子對(duì)殼寡糖的親和力遠(yuǎn)高于LysM分子對(duì)殼寡糖的親和力。

Hadian等［46］研究了β-乳球蛋白與水溶性波斯膠（Water-soluble fraction of Persian gum，WPG）在pH、蛋白多糖混合比、濃度、離子種類、離子強(qiáng)度和溫度等條件下的相互作用。ITC結(jié)果表明溫度對(duì)熱力學(xué)參數(shù)的影響是顯著的，通過對(duì)溫度的影響分析說明靜電相互作用、氫鍵和疏水作用是二者相互作用的主要推動(dòng)力。

2.4 ITC在蛋白質(zhì)-納米粒子相互作用中的應(yīng)用

隨著納米技術(shù)的進(jìn)步，開發(fā)出了不同性質(zhì)的納米材料（Nanomaterials，NMs），并擁有廣泛的應(yīng)用空間。常見的納米材料主要有納米金（Gold nanoparticles，AuNPs）［47］、金屬氧化物（ZnO，CuO和Fe3O4）［48-51］，聚合物（聚苯乙烯、殼聚糖和共聚物）［52-55］。生物分子通過納米材料表面和界面張力驅(qū)動(dòng)與之產(chǎn)生吸附作用，隨后發(fā)生相互作用。研究生物分子和納米材料的相互作用有利于納米材料的應(yīng)用和理解其毒理學(xué)機(jī)制［56］，并確定不同種類納米顆粒涂層的生物分子［57］。因此，測(cè)量和比較生理?xiàng)l件下不同生物分子與相同納米材料的親和性，或相同生物分子與不同納米粒子的親和性，了解納米粒子覆蓋在生物分子后的穩(wěn)定性和功能就變得尤為重要［58，59］。

近年來，ITC技術(shù)在構(gòu)成納米材料的雙親分子自組裝性質(zhì)和相互作用機(jī)理的研究中表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：該技術(shù)可以通過單次濃度掃描就能夠準(zhǔn)確測(cè)得反應(yīng)體系一定濃度范圍內(nèi)分子間相互作用的焓變（如相變或假性相變焓），同時(shí)還能夠通過能量突變所對(duì)應(yīng)的混合表面活性劑的摩爾比確定反應(yīng)體系的相界，使得等溫量熱滴定方法成為研究分子間弱相互作用最有效的實(shí)驗(yàn)手段之一［60］。ITC通過測(cè)定結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)揭示了生物分子-納米材料相互作用的機(jī)制（比如驅(qū)動(dòng)力、親和力和化學(xué)計(jì)量）、不同納米粒子（如尺寸、形狀和表面化學(xué)）對(duì)生物分子理化性質(zhì)的影響，對(duì)于理解納米材料在生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)中的應(yīng)用以及納米材料的毒理作用十分重要。同時(shí)，通過與其他技術(shù)聯(lián)用有利于更好地理解納米顆粒-生物分子相互作用。

2.5 ITC在膜蛋白-受體中的應(yīng)用

膜蛋白是指能夠結(jié)合或整合到細(xì)胞或細(xì)胞器的膜上的蛋白質(zhì)的總稱。膜蛋白具有廣泛的功能，是人體生長(zhǎng)發(fā)育所必須的蛋白質(zhì)，從離子轉(zhuǎn)運(yùn)到代謝調(diào)控過程均有膜蛋白的參與［61］?？梢院?jiǎn)單地把膜蛋白理解為細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)世界之間的“協(xié)調(diào)員和管理員”，當(dāng)膜蛋白發(fā)生改變時(shí)會(huì)引發(fā)一系列的疾病。人類基因組30%的編碼基因是膜蛋白，人們目前只了解很少一部分膜蛋白的分子機(jī)制和相互作用機(jī)制，直到2009年人們才得到完整的哺乳動(dòng)物膜蛋白的實(shí)驗(yàn)熱力學(xué)特性［61］。等溫滴定量熱法是測(cè)量可溶性蛋白與配體相互作用的常用工具，所以ITC可以用來探討膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物結(jié)合，以及研究結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和底物特異性。

許多膜蛋白的通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體都是高活性蛋白，擁有復(fù)雜的構(gòu)象。等溫滴定量熱法可以為這種復(fù)雜的構(gòu)象關(guān)系提供有用信息。Reyes等［62］研究ITC技術(shù)用于確定離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的耦合離子數(shù)量，以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與底物的耦合機(jī)制，該方法可應(yīng)用到不同的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)子和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究。Chavan等［63］用ITC技術(shù)研究ATP/ADP與ATP偶聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的熱力學(xué)關(guān)系。用ITC技術(shù)研究G-偶聯(lián)受體蛋白（G-protein coupled receptors，GPCRs）與抑制劑、拮抗劑和其他效應(yīng)物的偶聯(lián)關(guān)系目前研究還比較少［64，65］。此外，ITC還可研究脂類對(duì)膜蛋白的影響，包括磷脂雙分子層和特殊脂類，這對(duì)于理解配基門控離子通道和受體結(jié)合導(dǎo)致跨膜結(jié)構(gòu)域的改變有著特殊意義［66］。等溫滴定量熱技術(shù)用于膜蛋白的研究還有一個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)是熱容測(cè)定，而這些信息很難從其他途徑獲得［67］。迄今為止，ITC用于膜蛋白的研究潛力還未完全發(fā)掘出來，因此還有大量的生物學(xué)信息將會(huì)被更廣泛的應(yīng)用。

2.6 ITC在酶動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用

大量文獻(xiàn)表明，ITC是研究許多酶學(xué)反應(yīng)的理想方法，因其不像其他酶測(cè)定方法需要顯色、熒光或放射性同位素標(biāo)記的配體［68，69］。Sotoft 等［68］通過ITC實(shí)驗(yàn)利用固定化脂肪酶催化甲醇/乙醇與菜籽油與的酯交換反應(yīng)，比傳統(tǒng)的高效液相色譜法分析更為快速準(zhǔn)確。雙環(huán)霉素（Bicyclomycin）是唯一的依賴ρ（Rho）因子終止的天然抑制劑，Rho因子是由6個(gè)亞基組成的解旋酶。Rho因子結(jié)合在新生的RNA鏈上，借助水解ATP獲得能量推動(dòng)其沿著RNA鏈移動(dòng)，但移動(dòng)速度比RNA聚合酶慢，當(dāng)RNA聚合酶遇到終止子時(shí)便發(fā)生暫停，Rho因子得以趕上酶。Rho因子與RNA聚合酶相互作用，導(dǎo)致釋放RNA，并使RNA聚合酶與該因子一起從DNA上釋放下來。Brogan等［69］通過ITC實(shí)驗(yàn)確定雙環(huán)霉素-rho類似物的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，合成的5a-（3-formylphenylsulfanyl）-dihydrobicyclomycin雙環(huán)霉素配體比雙環(huán)霉素更有效地抑制rho因子。

2.7 ITC在蛋白質(zhì)-其他物質(zhì)相互作用中的應(yīng)用

柯衣定（Chrysoidine）是工業(yè)上廣泛使用的一種偶氮染料，具有潛在的毒性［70-72］。Sun 等［73］用熒光猝滅技術(shù)和等溫滴定量熱等方法研究柯衣定與人血清白蛋白的相互作用。ITC結(jié)果（圖2）顯示，柯衣定可以通過氫鍵自發(fā)地結(jié)合人血清白蛋白，二者相互作用的化學(xué)計(jì)量比約為1.5∶1，反應(yīng)為放熱過程。另外，ΔH 和ΔS均為負(fù)值表明柯衣定與HSA相互作用的主要推動(dòng)力是氫鍵和范德華力。熒光猝滅結(jié)果顯示，柯衣定與HSA相互作用時(shí)Trp-214殘基的微環(huán)境和HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。分子對(duì)接結(jié)果表明，柯衣定分子與Gln-211殘基形成氫鍵（1.80 ?）。此外，隨著柯衣定的不斷滴加導(dǎo)致HSA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，對(duì)人體造成毒性傷害。該研究結(jié)果提供柯衣定在體內(nèi)的運(yùn)輸機(jī)制和毒性機(jī)制，有利于更好地理解人類接觸柯衣定的風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)語

綜上所述，任何結(jié)合反應(yīng)只要能夠產(chǎn)生足夠的結(jié)合熱均能通過量熱法測(cè)量。但是由于不同生物系統(tǒng)的限制，目前蛋白質(zhì)-配體相互作用的研究大多數(shù)為蛋白質(zhì)-多肽、蛋白質(zhì)-核酸、蛋白質(zhì)-多糖、蛋白質(zhì)-脂質(zhì)、蛋白質(zhì)-金屬離子、蛋白質(zhì)-抑制劑、蛋白質(zhì)-底物、蛋白質(zhì)-輔因子等，但這并不意味著其他配體不能與蛋白質(zhì)相互作用或其相互作用無法測(cè)量。等溫滴定量熱法是測(cè)定溶液體系中分子間相互作用的有效技術(shù)手段，對(duì)分子結(jié)合反應(yīng)提供有價(jià)值的熱力學(xué)信息，ITC甚至可以用于固體材料如納米顆粒，形成均勻的懸浮液。此外，ITC還可用于三元體系中，其中一個(gè)配體已結(jié)合到大分子上，用另一個(gè)配體滴定，如底物結(jié)合到酶-輔因子系統(tǒng)［74］。本綜述主要介紹了近年來等溫滴定量熱技術(shù)在蛋白質(zhì)-配體相互作用中的應(yīng)用，通過科學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可更好地理解ITC數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。

圖2 在288 K，pH7.4條件下柯衣定滴定HAS［73］

分子相互作用時(shí)，由于稀釋、膠束形成/解離、構(gòu)象變化、聚合、相變或結(jié)合現(xiàn)象都可能發(fā)生吸熱/放熱反應(yīng)。因此正如其他分析儀器一樣，ITC也更適合于研究相對(duì)簡(jiǎn)單明確的系統(tǒng)，因?yàn)閺?fù)雜的多組分系統(tǒng)中的焓變很難解釋。同時(shí)，當(dāng)檢測(cè)到任何焓變信號(hào)時(shí)它也很難精確地標(biāo)識(shí)發(fā)生起點(diǎn)。此外，由于受到設(shè)備條件等因素限制較少與其他儀器聯(lián)用而缺乏特異性。因此，ITC與其他分析方法聯(lián)用，將有利于解決上述缺點(diǎn)。例如，光散射法可用于提供關(guān)于聚集體形成的信息，光譜法可用于提供構(gòu)象變化的全面信息，離子選擇性電極法可用于提供有關(guān)離子結(jié)合變化方面的信息。同時(shí)，ITC結(jié)合X射線晶體學(xué)和核磁共振光譜將有助于對(duì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)有更深了解。

等溫滴定量熱法目前已被作為測(cè)量分子相互作用的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”［75］。大量研究證明該技術(shù)可對(duì)從簡(jiǎn)單到復(fù)雜相互作用的熱力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。近年來，ITC越來越多的用來研究大分子復(fù)合物的形成，相互作用的化學(xué)計(jì)量學(xué)，結(jié)合界面面積構(gòu)象變化的相關(guān)參數(shù)，同時(shí)也憑借其高靈敏度和非特異性的獨(dú)特性質(zhì)在藥物研究過程中得到了長(zhǎng)足發(fā)展。有理由相信，該分析技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，更好的應(yīng)用其非特異性結(jié)合特性，確保其結(jié)果的有效性及其應(yīng)有的應(yīng)用價(jià)值，將有助于它在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用將更加趨向多樣化。

［1］Perozzo R, Folkers G, Scapozzaa L. Thermodynamics of proteinligand interactions：history, presence, and future aspects［J］. J Recept Signal Transduct Res, 2004, 24（1-2）：1-52.

［2］Hansen LD, Fellingham GW, Russell DJ. Simultaneous determination of equilibrium constants and enthalpy changes by titration calorimetry：Methods, instruments, and uncertainties［J］. Anal Biochem, 2011, 409（2）：220-229.

［3］Ghai R, Falconer RJ, Collins BM. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research—survey of the literature from 2010［J］. J Mol Recognit, 2012, 25（1）：32-52.

［4］Roselin LS, Lin MS, Lin PH, et al. Recent trends and some applications of isothermal titration calorimetry in biotechnology［J］. Biotechnol J, 2010, 5（1）：85-98.

［5］Liang Y. Applications of isothermal titration calorimetry in protein science［J］. Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai）, 2008, 40（7）：565-576.

［6］Myslinski JM, DeLorbe JE, Clements JH, et al. Protein-ligand interactions：thermodynamic effects associated with increasing nonpolar surface area［J］. J Am Chem Soc, 2011, 133（46）：18518-18521.

［7］Baker BM, Murphy KP. Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry［J］. Biophys J, 1996, 71（4）：2049-2055.

［8］Connelly PR, Varadarajan R, Sturtevant JM, et al. Thermodynamics of protein-peptide interactions in the ribonuclease S system studied by titration calorimetry［J］. Biochemistry, 1990, 29（25）：6108-6114.

［9］Spolar RS, Record MT Jr. Coupling of local folding to site-specific binding of proteins to DNA［J］. Science, 1994, 263（5148）：777-784.

［10］Zhou YL, Liao JM, Chen J, et al. Macromolecular crowding enhances the binding of superoxide dismutase to xanthine oxidase：implications for protein-protein interactions in intracellular environments［J］. Int J Biochem Cell Biol, 2006, 38（11）：1986-1994.

［11］Campagne S, Saurel O, Gervais V, et al. Structural determinants of specific DNA-recognition by the THAP zinc finger［J］. Nucleic Acids Res, 2010, 38（10）：3466-3476.

［12］Campagne S, Muller I, Milon A, et al. Towards the classification of DYT6 dystonia mutants in the DNA-binding domain of THAP1［J］. Nucleic Acids Res, 2012, 40（19）：9927-9940.

［13］Velazquez-Campoy A, Freire E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands［J］. Nat Protoc, 2006, 1（1）：186-191.

［14］Okhrimenko O, Jelesarov I. A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry［J］. J Mol Recognit, 2008, 21（1）：1-19.

［15］Falconer RJ, Penkova A, Jelesarovl I, et al. Survey of the year 2008：applications of isothermal titration calorimetry［J］. J Mol Recognit, 2010, 23（5）：395-413.

［16］Ross PD, Subramanian S. Thermodynamics of protein association reactions：forces contributing to stability［J］. Biochemistry, 1981, 20（11）：3096-3102.

［17］Furukawa A, Konuma T, Yanaka S, et al. Quantitative analysis of protein-ligand interactions by NMR［J］. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc, 2016, 96（6）：47-57.

［18］ Veliká B, Tome?ková V, Fodor K, et al. （E）-2-Benzylidenecycloalkanones XII. * Kinetic measurement of bovine and human serum albumine interaction with selected chalcones and their cyclic chalcone analogues by UV spectrophotometry［J］. Spectral Analysis Review, 2015, 3（1）：1-8.

［19］López-Lorente áI, Mizaikoff B. Mid-infrared spectroscopy for protein analysis：potential and challenges［J］. Anal Bioanal Chem, 2016, 408（11）：2875-2889.

［20］Vachali PP, Li B, Bartschi A, et al. Surface plasmon resonance（SPR）-based biosensor technology for the quantitative characterization of protein-carotenoid interactions［J］. Arch Biochem Biophys, 2015, 572（15）：66-72.

［21］Schuck P. Analytical ultracentrifugation as a tool for studying protein interactions［J］. Biophys Rev, 2013, 5（2）：159-171.

［22］Smits AH, Vermeulen M. Characterizing protein-protein interactions using mass spectrometry：Challenges and opportunities［J］. Trends Biotechnol, 2016, 34（10）：825-834.

［23］Fernandes F, Coutinho A, Prieto M, et al. Electrostatically driven lipid-protein interaction：Answers from FRET［J］. Biochim Biophys Acta, 2015, 1848（9）：1837-1848.

［24］Vander Meulen KA, Saecker RM, Record MT Jr. Formation of a wrapped DNA-protein interface：experimental characterization and analysis of the large contributions of ions and water to the thermodynamics of binding IHF to H’ DNA［J］. J Mol Biol, 2008, 377（1）：9-27.

［25］Velázquez Campoy A, Freire E. ITC in the post-genomic era…？Priceless［J］. Biophys Chem, 2005, 115（2-3）：115-124.

［26］Bou-Abdallah F, Giffune TR. The thermodynamics of protein interactions with essential first row transition metals［J］. Biochim Biophys Acta, 2016, 1860（5）：879-891.

［27］Makowska J, ?amoj? K, Wyrzykowski D, et al. Binding of Cu（II）ions to peptides studied by fluorescence spectroscopy and isothermal titration calorimetry［J］. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2016, 153：451-456.

［28］Irving H, Williams R. Order of stability of metal complexes［J］. Nature, 1948, 162（4123）：746-747.

［29］McCall KA, Fierke CA. Probing determinants of the metal ion selectivity in carbonic anhydrase using mutagenesis［J］. Biochemistry, 2004, 43（13）：3979-3986.

［30］Valko M, Jomova K, Rhodes CJ, et al. Redox- and non-redox-metal-induced formation of free radicals and their role in human disease［J］. Arch Toxicol, 2016, 90（1）：1-37.

［31］Rak J, Dejlová B, Lampová H, et al. On the solubility and lipophilicity of metallacarborane pharmacophores［J］. Mol Pharm, 2013, 10（5）：1751-1759.

［32］Barth RF, Coderre JA, Vicente MG, et al. Boron neutron capture therapy of cancer：current status and future prospects［J］. Clin Cancer Res, 2005, 11（11）：3987-4002.

［33］Hawthorne MF, Lee MW. A critical assessment of boron target compounds for boron neutron capture therapy［J］. J Neurooncol, 2003, 62（1-2）：33-45.

［34］Losytskyy MY, Kovalska VB, Varzatskii OA, et al. An interaction of the functionalized closo-borates with albumins：The protein fluorescence quenching and calorimetry study［J］. J Lumin, 2016, 169：51-60.

［35］Zhang L, Wang Y, Li D, et al. The absorption, distribution, metabolism and excretion of procyanidins［J］. Food Funct, 2016, 7（3）：1273-1281.

［36］Barbehenn RV, Peter Constabel C. Tannins in plant-herbivore interactions［J］. Phytochemistry, 2011, 72（13）：1551-1565.

［37］Kilmister RL, Faulkner P, owney MO, et al. The complexity of condensed tannin binding to bovine serum albumin--An isothermal titration calorimetry study［J］. Food Chem, 2016, 190：173-178.

［38］Harbertson JF, Kilmister RL, Kelm MA, et al. Impact of condensed tannin size as individual and mixed polymers on bovine serum albumin precipitation［J］. Food Chem, 2014, 160：16-21.

［39］ 黃毅, 黃金花, 謝青季, 等. 糖-蛋白質(zhì)相互作用［J］. 化學(xué)進(jìn)展, 2008, 98（6）：942-950.

［40］Disney MD, Seeberger PH. The use of carbohydrate microarrays to study carbohydrate-cell interactions and to detect pathogens［J］. Chem Biol, 2004, 11（12）：1701-1707.

［41］Patra D, Mishra P, Vijayan M, et al. Negative cooperativity and high affinity in chitooligosaccharide binding by a mycobacterium smegmatis protein containing LysM and lectin domains［J］. Biochemistry, 2016, 55（1）：49-61.

［42］Koharudin LM, Viscomi AR, Montanini B, et al. Structure-function analysis of a CVNH-LysM lectin expressed during plant infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae［J］. Structure, 2011, 19（5）：662-674.

［43］Lecoq L, Bougault C, Hugonnet JE, et al. Dynamics induced by β-lactam antibiotics in the active site of Bacillus subtilis L, D-transpeptidase［J］. Structure, 2012, 20（5）：850-861.

［44］Liu T, Liu Z, Song C, et al. Chitin-induced dimerization activates a plant immune receptor［J］. Science, 2012, 336（6085）：1160-1164.

［45］Sánchez-Vallet A, Saleem-Batcha R, Kombrink A, et al. Fungal effector Ecp6 outcompetes host immune receptor for chitin binding through intrachain LysM dimerization［J］. Elife. 2013, 2：e00790.

［46］Hadian M, Hashemhosseini SM, Farahnaky A, et al. Isothermal titration calorimetric and spectroscopic studies of β-lactoglobulinwater-soluble fraction of Persian gum interaction in aqueous solution［J］. Food Hydrocoll, 2016, 55：108-118.

［47］Zhou J, Ralston J, Sedev R, et al. Functionalized gold nanoparticles：synthesis, structure and colloid stability［J］. J Colloid Interface Sci, 2009, 331（2）：251-262.

［48］Chatterjee T, Chakraborti S, Joshi P, et al. The effect of zinc oxide nanoparticles on the structure of the periplasmic domain of the Vibrio cholerae ToxR protein［J］. FEBS J, 2010, 277（20）：4184-4194.

［49］Liu S, Han Y, Qiao R, et al. Investigations on the interactions between plasma proteins and magnetic iron oxide nanoparticles with different surface modifications［J］. J Phys Chem C, 2010, 114（49）：21270-21276.

［50］Chakraborti S, Joshi P, Chakravarty D, et al. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin［J］. Langmuir, 2012, 28（30）：11142-11152.

［51］Rabbani G, Khan MJ, Ahmad A, et al. Effect of copper oxide nanoparticles on the conformation and activity of β-galactosidase［J］. Colloids Surf B Biointerfaces, 2014, 123：96-105.

［52］Lindman S, Lynch I, Thulin E, et al. Systematic investigation of the thermodynamics of HSA adsorption to N-iso-propylacrylamide/N-tert-butylacrylamide copolymer nanoparticles. Effects of particle size and hydrophobicity［J］. Nano Lett, 2007, 7（4）：914-920.

［53］Baier G, Costa C, Zeller A, et al. BSA adsorption on differently charged polystyrene nanoparticles using isothermal titration calorimetry and the influence on cellular uptake［J］. Macromol Biosci, 2011, 11（5）：628-638.

［54］Koppolu BP, Smith SG, Ravindranathan S, et al. Controllingchitosan-based encapsulation for protein and vaccine delivery［J］. Biomaterials, 2014, 35（14）：4382-4389.

［55］Winzen S, Schoettler S, Baier G, et al. Complementary analysis of the hard and soft protein corona：sample preparation critically effects corona composition［J］. Nanoscale, 2015, 7（7）：2992-3001.

［56］Gagner JE, Shrivastava S, Qian X, et al. Engineering nanomaterials for biomedical applications requires understanding the nano-bio interface：a perspective［J］. J Phys Chem Lett, 2012, 3（21）：3149-3158.

［57］Monopoli MP, Aberg C, Salvati A, et al. Biomolecular coronas provide the biological identity of nanosized materials［J］. Nat Nanotechnol, 2012, 7（12）：779-786.

［58］Nel AE, M?dler L, Velegol D, et al. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface［J］. Nat Mater, 2009, 8（7）：543-557.

［59］Shemetov AA, Nabiev I, Sukhanova A. Molecular Interaction of proteins and peptides with nanoparticles［J］. ACS Nano, 2012, 6（6）：4585-4602.

［60］De M, You CC, Srivastava S, et al. Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles：a thermodynamic study［J］. J Am Chem Soc, 2007, 129（35）：10747-10753.

［61］Rajarathnam K, R?sgen J. Isothermal titration calorimetry of membrane proteins - progress and challenges［J］. Biochim Biophys Acta, 2014, 1838（1）：69-77.

［62］Reyes N, Oh S, Boudker O. Binding thermodynamics of a glutamate transporter homolog［J］. Nat Struct Mol Biol, 2013, 20（5）：634-640.

［63］Chavan H, Li F, Tessman R, et al. Functional coupling of ATP-binding cassette transporter Abcb6 to cytochrome P450 expression and activity in liver［J］. J Biol Chem, 2015, 290（12）：7871-7886.

［64］Boudker O, Oh S. Isothermal titration calorimetry of ion-coupled membrane transporters［J］. Methods, 2015, 76：171-182.

［65］Langelaan DN, Ngweniform P, Rainey JK. Biophysical characterization of G-protein coupled receptor-peptide ligand binding［J］. Biochem Cell Biol, 2011, 89（2）：98-105.

［66］Finger S, Kerth A, Dathe M, et al. The efficacy of trivalent cyclic hexapeptides to induce lipid clustering in PG/PE membranes correlates with their antimicrobial activity［J］. Biochim Biophys Acta, 2015, 1848（11）：2998-3006.

［67］Pozzi N, Chen R, Chen Z, et al. Rigidification of the autolysis loop enhances Na+binding to thrombin［J］. Biophys Chem, 2011, 159（1）：6-13.

［68］Sotoft LF, Westh P, Christensen KV, et al. Novel investigation of enzymatic biodiesel reaction by isothermal calorimetry［J］. Thermochim Acta, 2010, 501（1-2）：84-90.

［69］Brogan AP, Widger WR, Bensadek D, et al. Development of a technique to determine bicyclomycinrho binding and stoichiometry by isothermal titration calorimetry and mass spectrometry［J］. J Am Chem Soc, 2005, 127（8）：2741-2751.

［70］Lei H, Liu J, Song L, et al. Development of a highly sensitive and specific immunoassay for determining chrysoidine, a banned dye, in soybean milk film［J］. Molecules, 2011, 16（12）：7043-7057.

［71］Gui WJ, Xu Y, Shou LF, et al. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of chrysoidine in yellow-fin tuna［J］. Food Chem, 2010, 122（4）：1230-1234.

［72］Yang BJ, Hao F, Li JR, et al. Characterization of the binding of chrysoidine, an illegal food additive to bovine serum albumin［J］. Food Chem Toxicol, 2014, 65：227-232.

［73］Sun H, Liu Y, Li M, et al. Toxic effects of chrysoidine on human serum albumin：isothermal titration calorimetry and spectroscopic investigations［J］. Luminescence, 2016, 31（2）：335-340.

［74］Bradrick TD, Beechem JM, Howell EE. Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein［J］. Biochemistry, 1996, 35（35）：11414-11424.

［75］Rehman AA, Ahsan H, Khan FH. Identification of a new alpha-2-macroglobulin：Multi-spectroscopic and isothermal titration calorimetry study［J］. Int J Biol Macromol, 2016, 83：366-375.

（責(zé)任編輯 李楠）

Applications of Isothermal Titration Calorimetry in Protein-ligand Interactions

QI Xin-jie1WANG Yue1，2WANG Yan-sheng1FANG Guo-kang1HUANG Ying-chun1，2
（1. Biochemical Engineering College，Beijing Union University，Beijing 100023；2. Beijing Key Laboratory of Biomass Wastes Resource Utilization，Beijing 100023）

Isothermal titration calorimetry（ITC）is a biophysical technique widely used to study molecular interactions in molecular biology and these related fields，it is the sole direct method to measure the heat change during complex formation at constant temperature. We may obtain much important information about molecular interactions（such as binding constant，number of binding sites，free energy，enthalpy，and entropy）simply by measuring the heat absorbed or released during an interaction between two liquid solutions. This review concentrates on the principle and features of ITC，the new applications of ITC in protein-ligand interactions，and potential development direction，it has been shown that it plays an important role in the elucidation of binding mechanisms and the validity of the data.

isothermal titration calorimetry；thermodynamics；interaction；protein；small molecule

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.006

2016-11-07

北京市中青年教師國(guó)外訪學(xué)計(jì)劃（067135300100），北京市自然科學(xué)基金（5112011）

齊心潔，女，碩士研究生，研究方向：生物活性物質(zhì)制備及生理功能；E-mail：qixinjie2014@126.com

黃迎春，女，博士，研究方向：生物活性物質(zhì)制備及生理功能；E-mail：ldhych@buu.edu.cn