李 霞， 常利紅， 黃子真， 王志遠， 陳賢珍， 王 君， 張革化

(中山大學附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科， 廣東 廣州 510630)

IL-19及其受體與慢性鼻-鼻竇炎組織重塑的相關性研究*

李 霞， 常利紅， 黃子真， 王志遠， 陳賢珍， 王 君， 張革化△

(中山大學附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科， 廣東 廣州 510630)

目的： 探討白細胞介素19(interleukin-19，IL-19)及其受體 (IL-20R1/IL-20R2)在不同類型慢性鼻-鼻竇炎[慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉 (chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)和慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)]患者中表達的差異，并分析其與慢性鼻-鼻竇炎組織重塑的相關性。方法: 研究共分3組：CRSwNP組(30例)、CRSsNP組(15例)和對照組(鼻中隔偏曲患者15例)。實時熒光定量PCR檢測IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)和組織重塑因子基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)-1的 mRNA相對表達量；免疫組化檢測IL-19及其受體的蛋白表達量；ELISA檢測MMP-9、TIMP-1的蛋白表達量。結(jié)果: CRSwNP組IL-19、IL-20R1、IL-20R2和MMP-9的mRNA和蛋白表達量高于CRSsNP組和對照組(P<0.05)，CRSsNP組TIMP-1的mRNA和蛋白的表達量均高于CRSwNP組和對照組 (P<0.05)； MMP-2的mRNA和蛋白的表達量在各組無顯著差異。CRSwNP組IL-19、IL-20R1和IL-20R2均與MMP-9的mRNA相對表達量呈正相關(P<0.05)；IL-19及其受體與TIMP-1的mRNA相對表達量無明顯相關。結(jié)論: IL-19及其受體的mRNA在CRSwNP中高表達，且與MMP-9 mRNA表達呈正相關，提示二者可能存在交互作用，可能參與慢性鼻-鼻竇炎的組織重塑。

慢性鼻-鼻竇炎； 組織重塑； 白細胞介素19； 基質(zhì)金屬蛋白酶9； 金屬蛋白酶組織抑制物1

慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是鼻腔及鼻竇的慢性炎性疾病,其發(fā)病與多種因素相關，機制復雜。目前臨床上將CRS分為慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)和慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP) 2種類型[1]。研究認為不同類型CRS的炎癥反應類型及組織重塑特性不同：CRSwNP以假性囊腫形成、炎癥細胞浸潤和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成降低為特征；CRSsNP則以間質(zhì)纖維化、膠原沉積和ECM合成增加為特征[2]。ECM的合成和降解失衡是決定CRS病變性質(zhì)和預后的重要因素。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是調(diào)節(jié)ECM平衡的主要因子，MMPs/TIMPs失衡可能是導致組織重塑的機制之一[3]。新近研究發(fā)現(xiàn)，IL-19在多種慢性炎癥性及自身免疫性疾病中表達，發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥和免疫的作用，并最終影響組織重塑[4-6]。然而目前國內(nèi)外關于IL-19及其受體在CRS中的研究較少，其與組織重塑及MMPs、TIMPs間的關系亦不明確。因此，本研究旨在觀察IL-19及其受體與CRS組織重塑的關系，為進一步探討CRS發(fā)病機制提供實驗資料。

材 料 和 方 法

1 標本采集和處理

標本采自于2013年7月～2015年1月在我科住院的患者，研究組45例CRS，其中CRSwNP 30例(男21例，女9例；年齡17～75歲)，CRSsNP 15例(男9例，女6例；年齡26～71歲)；對照組15例，為同期住院行鼻中隔手術的患者(男11例，女4例；年齡19～57歲)；各組患者年齡及性別構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學意義。術中采集CRSwNP組的息肉組織，CRSsNP組的竇口鼻道復合體黏膜，對照組下鼻甲黏膜。排除標準：(1)有下列疾病患者：自身免疫性疾病、阿司匹林不耐受三聯(lián)征，原發(fā)性纖毛運動功能障礙和囊性纖維化；(2)有下列藥物近期用藥史患者：術前1個月內(nèi)使用抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素類藥物治療。所有患者均簽署知情同意書。

新鮮標本離體后用生理鹽水清洗表面的黏液和血漬，分為3份，2份置于-80℃凍存；另一份用10%甲醛溶液固定。

2 主要儀器和試劑

熒光定量PCR儀(ABI7500)；生物顯微鏡(Leica)；酶標儀(Thermo)；TRIzol(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR定量 PCR 試劑盒(TaKaRa)；羊抗人IL-19(Santa Cruz)；鼠抗人IL-20R1(R&D)；兔抗人IL-20R2(Abcam)； HRPⅡ抗(Bioworld)；山羊血清(北京博奧森公司)；兔血清(NQBB)；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑(北京中杉金橋公司)；MMP-9和TIMP-1 ELISA試劑盒(武漢華美公司)；蛋白酶抑制劑(MCE)；所用引物由英濰捷基公司合成，具體序列見表1。

表1 引物序列表

F: forward； R： reverse.

3 主要方法

3.1 RT-qPCR檢測組織中IL-19、IL-20R1、IL-20R2、MMP-9、MMP-2和TIMP-1的mRNA相對表達量 TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。10 μL PCR反應體系：cDNA 1μL，引物0.2 μmol/L，ROX DyeⅡ，SYBR Premix Ex Taq。IL-19、IL-20R1和IL-20R2反應條件：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 15 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，45個循環(huán)；MMP-2、MMP-9和TIMP-1反應條件：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min， 45個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算相對表達量。

3.2 免疫組織化學染色 S-P二步法進行染色。新鮮組織經(jīng)10%甲醛溶液固定、石蠟包埋后連續(xù)4 μm切片。60 ℃烤片1 h，常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟復水、枸櫞酸鹽溶液高壓熱修復5 min，3% H202阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。Ⅰ抗4 ℃孵育過夜(羊抗人IL-19抗體1∶100，鼠抗人IL-20R1抗體1∶20，兔抗人IL-20R2抗體1∶50)，Ⅱ抗37 ℃孵育1 h， DAB顯色，顯微鏡下觀察染色至適度終止。蘇木素復染，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯溶液透明，封片。

免疫組織化學染色結(jié)果判定標準： 2位病理學專家雙盲獨立評分。100倍顯微鏡下按切片染色強度評分：無色為0分, 淡黃色為1分, 棕黃色為2分, 棕褐色為3分。400倍顯微鏡下隨機選取5個上皮細胞富集的視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性染色細胞百分比，按5個視野陽性細胞百分比的平均值計分：0為0分, 1%～25%為1分, 26%～50%為2分, 51%～75%為3分, 76%～100%為4分。將以上2項得分相加(總分0～7分)，<3分為(-)，3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分為(+++)。

3.3 ELISA 液氮中研磨組織成粉狀，每100 mg組織干粉加1 mL蛋白提取緩沖液(含蛋白酶抑制劑的PBS)，4 ℃ 10 000 r/min 離心組織勻漿液10 min后取上清，置于-80℃冰箱保存待用。ELISA檢測組織勻漿上清中MMP-9和TIMP-1的蛋白含量，繪制標準曲線，計算被測蛋白的濃度。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0進行分析。多組比較采用Kruskal-WallisH檢驗，置信區(qū)間采用Bonferroni校正；兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。相關性分析采用Spearman檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)的mRNA及蛋白表達水平

CRSwNP組IL-19、 IL-20R1和IL-20R2的mRNA表達水平高于CRSsNP組和對照組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of IL-19, IL-20R1 and IL-20R2 in human CRS and control tissues. CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps (n=30); CRSsNP: chronic rhinosinusitis without nasal polyps (n=15); control：n=15.*P<0.05，**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCRSsNP.

圖1 CRS和對照組IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)的mRNA表達水平

IL-19、IL-20R1和IL-20R2蛋白均主要表達在鼻黏膜上皮細胞和黏膜下炎癥細胞中，表達位置具有一致性。IL-19、IL-20R1和IL-20R2陽性染色主要定位于細胞質(zhì)和細胞膜，且CRSwNP組陽性率高于CRSsNP組和對照組，見圖2。

2 組織重塑因子(MMP-2、MMP-9和TIMP-1)mRNA及蛋白的表達水平

CRSwNP組MMP-9的mRNA表達水平高于CRSsNP組和對照組(P<0.05)；CRSsNP組TIMP-1的mRNA表達水平高于CRSwNP組和對照組(P<0.05)；MMP-2 mRNA在3組間的表達無顯著差異，見圖3。

CRSwNP組MMP-9蛋白水平高于CRSsNP組和對照組(P<0.05)， CRSsNP組TIMP-1蛋白水平高于CRSwNP組和對照組(P<0.05)，見圖4。

3 IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)與組織重塑因子的相關性分析

在CRSwNP中，IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2) mRNA表達水平與MMP-9 mRNA表達水平呈正相關(P<0.05)；CRSsNP和對照組中，IL-19及其受體與MMP-9 mRNA無明顯相關。IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)mRNA表達水平與TIMP-1 mRNA表達水平無明顯相關，見圖5。

討 論

CRS是鼻腔及鼻竇的異質(zhì)性慢性炎性疾病，發(fā)病機制至今尚不明確，以往研究認為該類疾病的發(fā)生可能是多種致病因素參與、多種信號通路調(diào)節(jié)的結(jié)果[7]。組織重塑是氣道慢性炎癥的主要病理特征，是決定 CRS 病變性質(zhì)和預后的重要因素。MMPs是以細胞外基質(zhì)蛋白為主要底物的一組鈣離子活化鋅離子依賴的肽鏈內(nèi)切酶總稱。TIMPs是MMPs的天然組織抑制物，TIMP-1可以抑制所有MMPs的活性。MMPs和TIMPs之間的平衡在細胞外基質(zhì)和基底膜成分更新和穩(wěn)態(tài)維持的過程中發(fā)揮重要作用，是調(diào)節(jié)組織重塑的關鍵因素之一[3]。與以往對CRS組織上清的研究[8]一致，本研究發(fā)現(xiàn)在mRNA和蛋白水平，CRSwNP組中MMP-9表達明顯高于CRSsNP和對照組，TIMP-1在CRSsNP組中表達明顯高于CRSwNP和對照組，提示MMP-9/TIMP-1參與了CRS的組織重塑過程。

Figure 2.The expression of IL-19, IL-20R1 and IL-20R2 in human CRS and control tissues (immunohistochemical staining，×400). CRSwNP： chronic rhinosinusitis with nasal polyps (n=15)； CRSsNP： chronic rhinosinusitis without nasal polyps (n=15)； control：n=10.**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCRSsNP.

圖2 CRS和對照組IL-19及其受體的蛋白表達水平

Figure 3.The mRNA expression of MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 in human CRS and control tissues. CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps (n=30); CRSsNP: chronic rhinosinusitis without nasal polyps (n=15); control：n=15.*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsCRSsNP.

圖3 CRS和對照組組織重塑因子MMP-2、MMP-9和TIMP-1的mRNA表達水平

Figure 4.The protein expression of MMP-9 and TIMP-1 in human CRS and control tissues detected by ELISA. CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps (n=15); CRSsNP: chronic rhinosinusitis without nasal polyps (n=15); control：n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsCRSsNP.

圖4 CRS和對照組組織重塑因子MMP-9和TIMP-1的蛋白表達水平

Figure 5.Correlations between the expression of IL-19, IL-20R1 or IL-20R2 and tissue remodeling factor MMP-9 in CRSwNP (chronic rhinosinusitis with nasal polyps). A: IL-19 was positively correlated with MMP-9 (rs=0.421，P=0.020); B: IL-20R1 was positively correlated with MMP-9 (rs=0.385，P=0.039); C: IL-20R2 was positively correlated with MMP-9 (rs=0.435，P=0.018).

圖5 CRSwNP組IL-19及其受體與組織重塑因子MMP-9的相關性分析

IL-20亞家族成員(IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26)通過與細胞表面特異性受體的結(jié)合，在多種慢性炎癥性疾病的組織重塑中發(fā)揮重要作用[4]。本研究結(jié)果顯示：IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)主要在鼻黏膜上皮中表達；在CRS中表達高于對照組，尤其是CRSwNP組的鼻黏膜上皮中。有研究也發(fā)現(xiàn)IL-19在歐洲人群CRSwNP中高表達，但并未對IL-19受體表達進行研究[9]。本研究還發(fā)現(xiàn)CRSwNP鼻黏膜組織中IL-19和MMP-9在mRNA水平呈正相關，提示IL-19在CRSwNP鼻黏膜組織中的作用可能為與其受體結(jié)合后促進MMP-9的表達，進而導致ECM降解組織水腫。然而目前對MMP-2在CRS的表達尚存在爭議，有研究認為MMP-2在以水腫為特征的CRSwNP組增高[10]，也有研究[11]與本研究結(jié)果一致，MMP-2在各組表達無顯著差異，可能與MMP-2表達量低而樣本量有限，因此，不能真實體現(xiàn)其表達水平，或與標本的取材位置有關。

鼻黏膜與下氣道黏膜具有延續(xù)性，IL-19在CRS組織重塑中的調(diào)控機制可能與其誘導下氣道慢性炎癥具有相似的途徑。研究發(fā)現(xiàn)在哮喘患者氣道上皮細胞、在肺黏膜上皮細胞及浸潤的免疫細胞中高表達的IL-19及其受體IL-20R1、IL-20R2，可通過激活T細胞促進Th2型細胞因子產(chǎn)生，還可通過結(jié)合其特異性受體激活STAT1、STAT3通路提高氣道高反應性并促進哮喘的炎癥反應，而Th2細胞因子IL-4、IL-13聯(lián)合IL-17A可通過NF-κB及STAT6通路正向反饋上調(diào)IL-19的表達[12-13]。IL-20亞家族參與其它慢性炎癥性疾病的組織重塑研究中發(fā)現(xiàn)：IL-20可促進椎間盤突出患者椎間盤細胞中MMP-3的表達[14]；也有研究發(fā)現(xiàn)IL-20可以促進肝纖維化，抗IL-20、抗IL-20R1治療后小鼠肝臟TGF-β1、 TIMP-3和TIMP-4減少，同時MMP-2、MMP-3和MMP-13合成增加，進而抑制細胞外基質(zhì)的募集，促進I型膠原沉積，導致肝纖維化減輕[15]。

本研究證實在國人CRSwNP中存在IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)和MMP-9的高表達及TIMP-1的低表達，且IL-19及其受體與MMP-9在mRNA水平呈正相關關系，提示IL-19及其受體可能參與了CRS組織重塑的發(fā)生發(fā)展, 其具體的分子機制還有待進一步研究。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Correlation of IL-19 and its receptors with tissue remodeling in chronic rhinosinusitis

LI Xia, CHANG Li-hong, HUANG Zi-zhen, WANG Zhi-yuan, CHEN Xian-zhen, WANG Jun, ZHANG Ge-hua

(DepartmentofOtorhinolaryngology，Head&NeckSurgery,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:gehuazh@hotmail.com.cn)

AIM: To explore the differential expression of interleukin-19 (IL-19) and its receptors (IL-20R1/IL-20R2) in the samples of chronic rhinosinusitis (CRS) with or without nasal polyps (CRSwNP and CRSsNP), and to investigate the correlation of IL-19 and its receptors with tissue remodeling factors, including matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1 in CRS. METHODS: The polyps from CRSwNP patients (n=30), the sinus mucosa from CRSsNP patients (n=15) and the inferior turbinal mucosa of nasal septum de-viation patients (n=15) were collected. The expression of IL-19 and its receptors (IL-20R1/IL-20R2) in each group was detected by real-time RT-PCR and immunohistochemistry. The expression of tissue remodeling factors MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 in different groups was detected by real-time RT-PCR and ELISA. RESULTS: Increased mRNA and protein expression levels of IL-19, IL-20R1, IL-20R2 and MMP-9 were observed in CRSwNP group compared with CRSsNP and control group (P<0.05), while elevated expression level of TIMP-1 was observed in CRSsNP group compared with CRSwNP and control group (P<0.05). The relative expression of MMP-2 among the 3 groups showed no obvious difference. The expression of IL-19 and its receptors showed significantly positive correlations with MMP-9 in CRSwNP (P<0.05). No significant correlation between IL-19 and/or its receptors with TIMP-1 in CRSwNP group was observed. CONCLUSION: The high expression levels of IL-19, IL-20R1 and IL-20R2 and their positive correlations with MMP-9 in CRSwNP indica-te that IL-19 and its receptors may be involved in the tissue remodeling of chronic rhinosinusitis.

Chronic rhinosinusitis; Tissue remodeling; Interleukin-19; Matrix metalloproteinase-9; Tissue inhibitor of metalloproteinase-1

1000- 4718(2017)05- 0919- 06

2017- 01- 09

2017- 03- 20

國家自然科學基金資助項目(No.81371073; No.81670913)； 廣東省自然科學研究計劃項目(No. 2013B021800081)

R765

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.025

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