胡 梅， 宋楊達(dá)▲， 劉思雪， 宋銥航， 沈溪明， 黃花榮， 鐘英強(qiáng)△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1消化內(nèi)科， 2病理科， 3兒科， 廣東 廣州 510120)

CCR5第一、二胞外環(huán)特異性結(jié)合的拮抗短肽對(duì)TNBS誘導(dǎo)SD大鼠結(jié)腸炎的治療作用*

胡 梅1， 宋楊達(dá)1▲， 劉思雪1， 宋銥航1， 沈溪明2， 黃花榮3△， 鐘英強(qiáng)1△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1消化內(nèi)科，2病理科，3兒科， 廣東 廣州 510120)

目的： 研究C-C趨化因子受體5(CCR5)膜外第一、二胞外環(huán)(ECL1和ECL2)特異性結(jié)合的拮抗短肽對(duì)三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型大鼠的治療作用與機(jī)制。方法: 采用100 mg/kg TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎SD大鼠模型；用不同劑量的2條拮抗短肽(ECL1： 25、35和45 mg/kg； ECL2：15、25和35 mg/kg)分別作用于模型大鼠，觀察其對(duì)大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)、結(jié)腸大體損傷指數(shù)(CMDI)和組織病理學(xué)改變的影響，采用real-time PCR和Western blot法分別檢測(cè)結(jié)腸組織TNF-α和COX-2的mRNA與蛋白表達(dá)水平。結(jié)果: 與模型組相比，有效劑量的ECL2拮抗短肽HY治療組大鼠疾病活動(dòng)程度、腸道潰瘍及病理組織學(xué)損傷均有明顯減輕，各評(píng)分指數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TNF-α和COX-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯下降(P<0.05)。ECL1拮抗短肽GH作用的大鼠結(jié)腸炎癥狀評(píng)分及TNF-α和COX-2炎癥因子表達(dá)無(wú)明顯改變。結(jié)論: ECL2拮抗短肽可能通過(guò)下調(diào)結(jié)腸黏膜TNF-α 和COX-2的表達(dá)來(lái)緩解TNBS誘導(dǎo)的SD大鼠結(jié)腸炎，而ECL1拮抗短肽的作用不明顯。

C-C趨化因子受體5； 拮抗肽； 炎癥性腸病

近年來(lái)，我國(guó)炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。C-C趨化因子受體5(C-C chemokine receptor 5，CCR5)是一種G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)，與配體結(jié)合后通過(guò)調(diào)節(jié)多種炎癥細(xì)胞在體內(nèi)的遷移與定位，參與多種免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，IBD與CCR5關(guān)系密切[1-2]；CCR5主要表達(dá)在腸黏膜固有層炎性細(xì)胞、固有腺體上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿或胞膜上[3]。我們還通過(guò)噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)淘選與大鼠CCR5特異性結(jié)合的活性短肽并進(jìn)行了體外功能的初步鑒定[4]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究CCR5膜外第一、二胞外環(huán)特異性結(jié)合的活性短肽(GH和HY)對(duì)三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的SD大鼠結(jié)腸炎的治療作用與機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

健康成年雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠，體重(200±10) g，6～7周齡，購(gòu)買(mǎi)并飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)。本項(xiàng)目經(jīng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2 主要試劑與儀器

CCR5的2條模擬短肽[5]由吉爾生化有限公司合成，純度為95%； 5% (W/V) TNBS購(gòu)自Sigma，與無(wú)水乙醇按1∶1體積配成灌腸液；糞便隱血試劑盒(雙聯(lián)法)購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；TRIzol? RNA 提取試劑、Premix Taq PCR試劑盒及real-time PCR試劑盒均購(gòu)自TaKaRa；BCA-100法蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物醫(yī)學(xué)研究所；兔抗鼠TNF-α抗體購(gòu)自Novus；兔抗鼠COX-2抗體購(gòu)自CST；HRP標(biāo)記羊抗鼠 II 抗購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司；LightCycler 480 Real-Time PCR System為Roche產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1 TNBS誘導(dǎo)SD大鼠結(jié)腸炎模型的構(gòu)建 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，正常自由飲食。大鼠結(jié)腸炎模型的誘導(dǎo)方法參照文獻(xiàn)[5]稍加改動(dòng)，具體方法為：大鼠禁食不禁水24 h，稱質(zhì)量后10%水合氯醛(0.03 mL/kg)腹腔麻醉，用16號(hào)大鼠灌胃針將灌腸液緩慢灌入大鼠結(jié)腸末端(距肛門(mén)端約8 cm)，繼續(xù)保持大鼠倒立姿勢(shì)30 min，仰臥歸籠，自然蘇醒，自由飲食。

3.2 TNBS造模劑量的篩選 選取27只SD大鼠，分4組，正常組3只，造模組每組8只，依照文獻(xiàn)[5]的TNBS造模劑量，選取80 mg/kg、100 mg/kg和120 mg/kg的灌腸液劑量造模，根據(jù)大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分及死亡率篩選TNBS建立炎癥性腸病的最佳造模劑量，再利用最適劑量建模并進(jìn)行后續(xù)研究。

3.3 CCR5兩條模擬短肽干預(yù)實(shí)驗(yàn)的分組給藥 選取40只SD大鼠，每組5只，分為正常對(duì)照組(normal組)、TNBS/乙醇造模組(model組)、TNBS/乙醇造模+GH短肽治療組(GH組)和TNBS/乙醇造模+HY短肽治療組(HY組)。在造模后第3天治療組大鼠分別予以GH短肽和HY短肽尾靜脈注射治療，模型組大鼠尾靜脈給予等體積的無(wú)菌PBS溶液注射，每天1次，連續(xù)7 d(至造模后第9天)。其中，2個(gè)短肽給藥組分別設(shè)立3個(gè)濃度梯度，GH短肽治療組為25 mg/kg、35 mg/kg和45 mg/kg，HY短肽治療組為15 mg/kg、25 mg/kg和35 mg/kg。經(jīng)疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)、結(jié)腸大體損傷指數(shù)(colon macroscopic damage index， CMDI)及組織學(xué)分級(jí)結(jié)果選擇最適有效給藥濃度。隨后，對(duì)最適給藥濃度組大鼠結(jié)腸組織行TNF-α和COX-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平測(cè)定。

3.4 大鼠DAI評(píng)分 每天記錄大鼠的體重下降程度、大便性狀(正常、稀便或腹瀉)以及糞便潛血或便血進(jìn)行DAI評(píng)分，DAI為體重下降分?jǐn)?shù)、糞便性狀分?jǐn)?shù)和隱血分?jǐn)?shù)三者之和的平均數(shù)，具體方法參照文獻(xiàn)[6](表1)進(jìn)行。糞便潛血通過(guò)匹拉米洞化學(xué)法檢測(cè)。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)

DAI = (combined score of weight loss, stool consistency and bleeding)/3.*Normal stools: well-formed pellets; loose: pasty stools which do not stick to the anus; diarrhea: liquid stools that stick to the anus.

3.5 大鼠CMDI評(píng)分 造模后第21天，用10%水合氯醛(0.06 mL/kg)腹腔過(guò)量麻醉處死大鼠。取大鼠結(jié)腸沿腸系膜打開(kāi)，用預(yù)冷生理鹽水沖洗掉糞便，清理粘連組織。對(duì)各組結(jié)腸進(jìn)行CMDI評(píng)分，該評(píng)分包括結(jié)腸和周?chē)M織的粘連程度、潰瘍及炎癥的嚴(yán)重程度，具體方法參照文獻(xiàn)[7](表2)進(jìn)行。

表2 結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)

3.6 大鼠結(jié)腸炎的組織學(xué)分級(jí)評(píng)分 大體損傷評(píng)分后，迅速取炎癥最嚴(yán)重的結(jié)腸組織，用4%的多聚甲醛固定，5 mm切片后HE染色。每張結(jié)腸切片隨機(jī)選取10個(gè)100倍的鏡下視野，按照文獻(xiàn)[8](表3)組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。其中，每個(gè)視野的“炎癥、深度、隱窩損傷或再生”程度評(píng)分后，乘以各自的累及范圍，得出各項(xiàng)評(píng)分(即炎癥和深度評(píng)分范圍是0～12分，再生或隱窩損傷評(píng)分范圍是0～16分)，最終組織學(xué)評(píng)分為各部分之和。

3.7 Real-time PCR法檢測(cè)結(jié)腸組織TNF-α 和COX-2的mRNA表達(dá)水平 采用TRIzol法提取結(jié)腸組織總RNA。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，用cDNA模板1 μL對(duì)大鼠內(nèi)參照β-actin、COX-2及TNF-α(具體引物序列見(jiàn)表4)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系含1 μL cDNA、5 μL 2×Premix Type試劑、0.4 μL上游引物和0.4 μL下游引物，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足至10 μL。PCR儀擴(kuò)增參數(shù)為： 95 ℃ 30 s， 95 ℃5 s， 60 ℃ 20 s， 40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)結(jié)束后，電腦自動(dòng)分析熒光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換為COX-2和TNF-α的起始拷貝數(shù)及循環(huán)閾值(Ct)。最后，用2-ΔΔCt方法計(jì)算各個(gè)基因表達(dá)的相對(duì)變化[9]。

3.8 Western blot法檢測(cè)結(jié)腸組織TNF-α和COX-2的蛋白表達(dá)水平 將結(jié)腸組織稱重，按1∶4的比例加入細(xì)胞裂解液，冰上勻漿，裂解30 min后，4 ℃下14 000×g離心5 min取上清，用BCA比色法按說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)樣品蛋白濃度，并計(jì)算60 μg所需的上樣體積。樣品加入SDS上樣緩沖液混勻后加熱5 min使蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE(恒壓60 V～110 V，約2.5 h)，用PDVF膜進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜(恒流250 mA，90 min)，用50 g/L脫脂奶粉封閉液封閉1 h，后分別加入抗COX-2(1∶1 000)、β-actin(1∶1 500)和TNF-α(1∶1 000)的單抗4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST洗膜10 min×3次后，加入 II 抗(1∶3 000)孵育1 h，用TBST洗膜10 min×3次，使用電腦凝膠成像系統(tǒng)曝光。采用ImageJ軟件，對(duì)每組COX-2和TNF-α與β-actin積分吸光度的比值進(jìn)行半定量分析。

表3 結(jié)腸炎的組織學(xué)分級(jí)

表4 引物序列

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 12.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TNBS建立結(jié)腸炎大鼠的最適造模劑量

120 mg/kg TNBS造模組在第5、6天各死亡1只，在第10天死亡2只，死亡率達(dá)50%，造模后大鼠少動(dòng)，精神萎靡、無(wú)進(jìn)食等，體質(zhì)量顯著下降，持續(xù)6～10 d，血樣黏液便可持續(xù)7～9 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)束見(jiàn)大便潛血，平均DAI評(píng)分約為2，該劑量組模型鼠癥狀過(guò)重且死亡率過(guò)高。100 mg/kg TNBS造模組在第14天死亡1只，造模后大鼠抱團(tuán)、少動(dòng)、進(jìn)食少等，體重持續(xù)下降5～7 d，血樣黏液便可持續(xù)3～6 d，大便潛血可持續(xù)9～14 d。80 mg/kg TNBS造模組，在第10天死亡1只，造模后大鼠精神稍差，懶動(dòng)，部分大鼠于造模后第6天恢復(fù)到造模前體重，部分大鼠造模后無(wú)明顯血便，部分造模后第6天大便潛血即為陰性，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)平均DAI評(píng)分約為0.33，該劑量組模型鼠結(jié)腸炎癥狀偏輕且持續(xù)時(shí)間過(guò)短。因此，100 mg/kg為T(mén)NBS建立結(jié)腸炎大鼠的最適造模劑量，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The DAI in groups with different doses of TNBS. Mean±SEM.n=8.

圖1 不同TNBS劑量組的疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

2 CCR5拮抗短肽對(duì)疾病活動(dòng)指數(shù)的影響

結(jié)腸炎大鼠經(jīng)2條短肽治療后，HY拮抗短肽組的DAI評(píng)分在造模后第6天均較model組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后大鼠糞便恢復(fù)正常的時(shí)間比model組提前。而GH拮抗短肽組與模型組在第6、10、21天DAI評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表5。

3 CCR5拮抗短肽對(duì)大體形態(tài)損傷指數(shù)的影響

與model組相比，HY2組的CMDI顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，該組大鼠結(jié)腸肉眼可見(jiàn)炎癥損傷明顯減輕，潰瘍面積縮小，并可見(jiàn)愈合瘢痕。GH短肽組的潰瘍病變則均無(wú)明顯改善，與model組比較，CMDI差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2、表6。

表5 GH短肽和HY短肽對(duì)結(jié)腸炎大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分的影響

Table 5.The effects of GH peptide and HY peptide on the DAI in the colitis rats (Mean±SEM.n=5)

GroupDaysafterTNBSenema61021Model2.27±0.161.07±0.160.47±0.13GH1(25mg/kg)2.00±0.211.20±0.130.67±0.00GH2(35mg/kg)1.40±0.070.67±0.000.20±0.13GH3(45mg/kg)1.80±0.251.07±0.160.40±0.16HY1(15mg/kg)1.53±0.13*0.80±0.130.13±0.13HY2(25mg/kg)1.46±0.13*0.67±0.130.07±0.13HY3(35mg/kg)1.60±0.68*0.93±0.160.20±0.13

*P<0.05νsmodel group.

Figure 2.The pathological changes of the colons in each group.

圖2 各組結(jié)腸肉眼變化

4 CCR5拮抗短肽對(duì)組織學(xué)損傷評(píng)分的影響

與模型組相比，HY2組的病理學(xué)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；余下各劑量組及GH組的病理學(xué)評(píng)分差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。病理見(jiàn)模型組結(jié)腸組織內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), 甚至累及全層，上皮部分壞死脫落，黏膜腺體減少，黏膜下層結(jié)構(gòu)疏松水腫明顯，HY2短肽結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，黏膜下層結(jié)締組織稍疏松，結(jié)腸組織處于完全自身修復(fù)狀態(tài)，GH2短肽結(jié)腸組織仍可見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),腺體紊亂數(shù)量減少，見(jiàn)圖3、表6。

Figure 3.Histological changes of colonic mucosa in each group (×100).

圖3 各組結(jié)腸黏膜組織學(xué)改變

表6 GH短肽和HY短肽對(duì)結(jié)腸大體損傷指數(shù)和組織學(xué)評(píng)分的影響

Table 6.The effects of GH peptide and HY peptide on CMDI and histological scores in different groups (Mean±SEM.n=5)

GroupCMDIHistologicalscoreModel5.60±0.7530.92±5.47GH1(25mg/kg)5.00±0.4518.25±4.92GH2(35mg/kg)4.80±0.4910.93±3.79GH3(45mg/kg)7.00±0.7127.56±6.47HY1(15mg/kg)3.80±1.2415.32±5.41HY2(25mg/kg)2.00±0.32*7.33±1.45*HY3(35mg/kg)4.80±0.7425.48±5.15

*P<0.05vsmodel group.

5 CCR5拮抗短肽對(duì)結(jié)腸黏膜COX-2和TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)的影響

由表7可見(jiàn)，模型組COX-2和TNF-α的mRNA表達(dá)水平較正常組明顯升高；HY2短肽干預(yù)組中COX-2和TNF-α的mRNA表達(dá)水平與模型對(duì)照組相比明顯下調(diào)，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且HY2拮抗肽組和正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，GH2短肽干預(yù)組與模型組比較差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

模型組COX-2和TNF-α蛋白表達(dá)水平和正常對(duì)照組比較明顯升高；HY短肽干預(yù)組中的COX-2和TNF-α蛋白表達(dá)水平與模型組相比明顯下調(diào)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。而GH短肽干預(yù)組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖4、表7。

表7 COX-2 和TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)量的比較

Table 7.The expression of COX-2 and TNF-α at mRNA and protein levels determined by RT-qPCR and Western blot (Mean±SEM.n=5)

GroupmRNAProteinCOX-2TNF-αCOX-2TNF-αNormal110.40±0.060.39±0.06Model4.90±0.12#2.19±0.21#0.77±0.06#0.86±0.06#GH2(35mg/kg)4.59±0.101.73±0.220.52±0.030.62±0.13HY2(25mg/kg)3.57±0.39*1.39±0.18*0.36±0.04*0.39±0.12*

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group.

Figure 4.The images of Western blot for determining the protein expression of COX-2 and TNF-α.

圖4 Western blot檢測(cè)COX-2和TNF-α的蛋白表達(dá)

討 論

CCR5是一種由7次跨膜螺旋區(qū)、胞外長(zhǎng)N末端、3個(gè)胞外環(huán)(ECL1-3)、3個(gè)胞內(nèi)環(huán)(ICL1-3)和胞內(nèi)C末端幾個(gè)部分構(gòu)成的蛋白，其與配體調(diào)解活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expression and secrete, RANTES)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein, MIP)-1α、MIP-1β等結(jié)合后通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的活化和定向遷移來(lái)控制免疫和炎癥反應(yīng)，從而參與IBD的發(fā)生與發(fā)展。在各免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中CCR5主要通過(guò)PKC、NF-κB、JAK-STAT等多條信號(hào)通路，促進(jìn)T細(xì)胞增殖，上調(diào)多種細(xì)胞因子受體表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。另外，CCR5是HIV-1感染靶細(xì)胞的輔助受體，CCR5拮抗劑也因此成為抗艾滋病藥物研發(fā)熱點(diǎn)，目前以CCR5為靶點(diǎn)的拮抗劑主要分趨化因子衍生物、非肽類(lèi)小分子化合物、單克隆抗體及肽類(lèi)化合物等4類(lèi)，本實(shí)驗(yàn)使用的親和短肽即屬于肽類(lèi)拮抗劑一類(lèi)，具有高活性、高穩(wěn)定性、高親和力和特異性結(jié)合的特點(diǎn)。因此說(shuō)明CCR5拮抗短肽作為受體蛋白拮抗劑，可以干預(yù)CCR5介導(dǎo)的多種炎癥通路反應(yīng)，發(fā)揮治療作用。已有研究者使用CCR5拮抗劑Met-RANTES、MIP-3α單克隆抗體以及TAK-779等分別治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)腸炎，發(fā)現(xiàn)其可有效地抑制腸道炎癥反應(yīng)、減輕腸道損傷[10-13]。

TNF-α是炎癥性腸病中公認(rèn)存在的一種促炎因子，在結(jié)腸炎活動(dòng)期，血液及炎癥性腸組織中TNF-α的水平明顯升高，介導(dǎo)腸黏膜損傷，臨床上抗TNF-α藥物在IBD的治療中也起到重要作用[14]。同樣COX-2/NF-κB也是炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制中重要的炎癥通路，參與IBD的發(fā)展[15]。COX-2和TNF-α表達(dá)水平是許多研究治療IBD藥物的觀察指標(biāo)[16]，它們?cè)贗BD中通過(guò)抑制NF-κB介導(dǎo)的促炎介質(zhì)(COX-2、TNF-α等)發(fā)揮腸道抗炎作用[17]。

本實(shí)驗(yàn)中，CCR5膜外第二環(huán)特異結(jié)合的拮抗短肽能明顯降低結(jié)腸炎大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)、大體損傷指數(shù)及組織學(xué)分級(jí)的評(píng)分，且發(fā)現(xiàn)模型組大鼠結(jié)腸組織COX-2和TNF-α表達(dá)水平異常增高，經(jīng)過(guò)CCR5拮抗短肽治療，COX-2和TNF-α的表達(dá)明顯下降。說(shuō)明HY拮抗短肽可通過(guò)下調(diào)COX-2和TNF-α的表達(dá)，減輕其與炎癥細(xì)胞相互作用，緩解腸道黏膜的炎癥損傷，促進(jìn)腸黏膜修復(fù)與潰瘍愈合。推測(cè)CCR5膜外第二環(huán)特異結(jié)合的拮抗短肽，可能通過(guò)模擬CCR5配體的結(jié)合表位，結(jié)合在由跨膜區(qū)一些關(guān)鍵氨基酸殘基組成的疏水口袋中，誘發(fā)CCR5的ECL2區(qū)域的構(gòu)象發(fā)生改變，阻止CCR5特異性配體與CCR5的結(jié)合，進(jìn)而影響下游信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少炎癥細(xì)胞趨化和炎癥因子的釋放，從而抑制炎癥反應(yīng)[18]。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)CCR5胞外第一環(huán)的模擬肽對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸炎無(wú)明顯緩解作用，因而推斷可能由于CCR5與配體結(jié)合而發(fā)揮生理功能的主要位點(diǎn)是N末端和ECL2[19]的緣故。

因此，CCR5在結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)機(jī)制中起重要作用，其胞外第二環(huán)的活性拮抗短肽對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型大鼠具有治療作用。對(duì)于CCR5胞外第一環(huán)拮抗劑對(duì)結(jié)腸炎的作用機(jī)制和效果有待進(jìn)一步的探索和評(píng)價(jià)。因此，合成性CCR5胞外第二環(huán)拮抗肽可能成為研究IBD治療一種候選藥物，為IBD的臨床治療方面的研究提供一種新的方法。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of antagonistic peptides binding specifically with first and second extracellular loops of CCR5 on colitis rats induced by TNB

SHU Mei1, SONG Yang-da1, LIU Si-xue1, SONG Yi-hang1, SHEN Xi-ming2, HUANG Hua-rong3, ZHONG Ying-qiang1

(1DepartmentofGastroenterology，2DepartmentofPathology，3DepartmentofPediatrics,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:zhongyingqiang@126.com；hhrvivi@126.com)

AIM: To study the effects of antagonistic peptides binding specifically with the first and second extracellular loops (ECL1 and ECL2) of C-C chemokine receptor 5 (CCR5) on the colitis rats induced by trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) and the mechanisms. METHODS: The colitis model of SD rats was induced by TNBS (100 mg/kg). The effects of 2 antagonistic peptides at different doses (ECL1： 25， 35 and 45 mg/kg； ECL2： 15， 25 and 35 mg/kg) on the model rats including the changes of disease activity index (DAI), colon macroscopic damage index (CMDI) and histological grading were observed. The mRNA and protein expression levels of TNF-α and COX-2 in the colonic mucosa were detected by real-time PCR and Western blot, respectively. RESULTS: Compared with model group, the changes of DAI, CMDI and histopathological injury of the rats treated with ECL2 antagonistic peptide HY at an appropriate dose were significantly reduced (P<0.05), and the protein and mRNA expression levels of TNF-α and COX-2 were significantly decreased (P<0.05). However, the effects of ECL1 antagonistic peptide GH on all scores and the expression levels of TNF-α and COX-2 were not obvious. CONCLUSION: ECL2 antagonistic peptide HY relieves TNBS-induced colitis in SD rats via down-regulating the expressions of TNF-α and COX-2 in the colonic mucosa, while the effect of ECL1 antagonist peptide GH was not obvious.

C-C chemokine receptor 5; Antagonistic peptide; Inflammatory bowel disease

1000- 4718(2017)05- 0902- 06

2016- 12- 13

2017- 02- 13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81370499)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2014A030313020； No. 2016A03031343)

R363； R965.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.022

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 鐘英強(qiáng) Tel： 020-81332598； E-mail: zhongyingqiang@126.com； 黃花榮 Tel： 020-81332446； E-mail: hhrvivi@126.com

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