郭稱明， 彭會云， 高 典， 胡 雁， 余瓊芳△， 羅 文

(南昌大學 1第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 2基礎醫(yī)學院病原生物學與免疫學系， 江西 南昌 330006)

ELMO1在胃癌細胞侵襲和遷移中的作用*

郭稱明1， 彭會云2， 高 典2， 胡 雁2， 余瓊芳1△， 羅 文1

(南昌大學1第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，2基礎醫(yī)學院病原生物學與免疫學系， 江西 南昌 330006)

目的： 探討吞噬和細胞運動蛋白1(ELMO1)的表達在胃癌細胞侵襲和遷移中的作用和功能。方法: 用Western blot和實時熒光定量PCR實驗檢測5種胃癌細胞和1種人正常胃黏膜上皮細胞ELMO1的蛋白和mRNA表達水平，并篩選出ELMO1表達量高的胃癌細胞株；用細胞轉(zhuǎn)染實驗沉默胃癌細胞株的ELMO1；用細胞劃痕實驗以及Trenswell小室遷移和侵襲實驗檢測抑制該基因的表達對胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響。結(jié)果: 胃癌細胞中ELMO1的表達量明顯高于人正常胃黏膜上皮細胞(P<0.01)，其中SGC7901細胞的ELMO1表達量最高；在SGC7901細胞中ELMO1-siRNA可顯著沉默ELMO1的表達(P<0.05)；沉默ELMO1可顯著降低胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力(P<0.01)。結(jié)論: ELMO1在胃癌細胞中高表達，并可促進胃癌細胞的侵襲和遷移。

吞噬和細胞運動蛋白1； 胃癌； 細胞侵襲； 細胞遷移

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，最近幾年每年約有40萬新發(fā)病例，死亡人數(shù)高達30多萬[1-2]。胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因，因此揭示胃癌轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的分子機制、確立防治靶點并積極探索抗復發(fā)、轉(zhuǎn)移的有效治療手段，對進一步提高胃癌患者的治愈率和生存率具有重要意義。

吞噬和細胞運動蛋白(engulfment and cell mobi-lity，ELMO)家族最初在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans,C.elegans)的研究中被發(fā)現(xiàn)，其與C.elegans的CED-12蛋白同源，在哺乳動物細胞中包括3種不同的轉(zhuǎn)錄剪接體：ELMO1、ELMO2和ELMO3[3]，且在進化過程中高度保守[4]。研究表明人Crk下游180 kDa蛋白(downstream of Crk with molecular weight of 180 kDa，Dock180)須與ELMO1相互結(jié)合成ELMO1/Dock180復合物才能激活下游的依賴Ras相關的C3肉毒桿菌毒素底物(Ras-related C3 botulinum toxin substrate，Rac)的肌動蛋白在細胞吞噬作用和細胞趨化作用中結(jié)構(gòu)重組，從而促進細胞的運動和遷移[5-8]。目前研究發(fā)現(xiàn)ELMO1對于維持機體的生態(tài)平衡具有重要意義，其異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后關系密切，但尚未有文獻報道ELMO1與胃癌相關[9]。本研究主要探討ELMO1的異常表達在胃癌細胞侵襲和遷移中的作用和功能。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人正常胃黏膜上皮細胞GES-1以及胃癌細胞株AGS、BGC823、MGC803、MKN28和SGC7901由本實驗室凍存；RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購于北京全式金生物技術(shù)公司；胰蛋白酶購自Gibco；BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；β-actin購自ComWin；抗ELMO1抗體購自Sigma；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TRIzol 購自上海拜力生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于普洛麥格生物技術(shù)有限公司；qPCR試劑盒購自TaKaRa；qPCR引物購自南京金斯瑞生物科技有限公司；ELMO1-siRNA購自GenePharma；Lipofectamine 2000脂質(zhì)體購自Invitrogen；Transwell小室購自Coring；基質(zhì)膠/基質(zhì)膜購自BD Biosciences。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞AGS、BGC823、MGC803、MKN28和SGC7901及作為對照組的人正常胃黏膜上皮細胞GES-1培養(yǎng)于含10%FBS、1×105U/L青霉素、1×105U/L鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液中，放入37 ℃、5%CO2孵化箱中培養(yǎng)，待細胞生長處于對數(shù)期時用于實驗。

2.2 Western blot實驗 裂解處于對數(shù)生長期的細胞提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，每個樣本上30 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)2 h至硝酸纖維素膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉0.5 h，加Ⅰ抗置于4 ℃冰箱孵育過夜，TBST洗3次，每次10 min，加Ⅱ抗室溫下孵育2 h，再用TBST洗3次，每次10 min，凝膠成像儀成像后用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算各組蛋白條帶的灰度值，再計算目的蛋白條帶的灰度值與β-actin灰度值的比值，得出目的蛋白的相對表達水平，每個實驗均重復3次，取平均值。選出表達量最高的胃癌細胞株用于做進一步實驗。

2.3 實時熒光定量PCR實驗 用TRIzol裂解處于對數(shù)生長期的細胞提取總RNA，每個樣本上1 μg 總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，嚴格按照實時定量PCR試劑盒操作說明書進行實驗，20 μL總反應體系，GAPDH作為內(nèi)參照。ELMO1的上游引物為5′-GGAGCAGGTTATGAGAGCACT-3′，下游引物為5′-GGGCCGGACTGGAAATCTTC-3′；GAPDH的上游引物為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。分別用ELMO1和GAPDH的Ct值計算ΔCt，再計算2-ΔΔCt代表ELMO1的相對表達量，每個實驗均重復3次，取平均值，篩選出表達量最高的胃癌細胞株用于后續(xù)實驗。

2.4 轉(zhuǎn)染實驗 轉(zhuǎn)染前24 h將ELMO1表達量最高且處于對數(shù)生長期的胃癌細胞株均勻接種于6孔板，置于37 ℃、5%CO2孵化箱中培養(yǎng)，待細胞密度達70%～80%時，按Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染細胞。實驗選用的3條ELMO1-siRNA分別為siRNA_001(正義鏈5′-GCA CUU ACA ACC AAG CCU ATT-3′，反義鏈5′-UAG GCU UGG UUG UAA GUG CTT-3′)、siRNA_002(正義鏈5′-GGA UGA ACC AGG AAG AUU UTT-3′，反義鏈5′-AAA UCU UCC UGG UCC AUC CTT-3′)和siRNA_003(正義鏈5′-GGC UUU CGC CAA AUC ACA ATT-3′，反義鏈5′-UUG UGA UUU GGC GAA AGC CTT-3′)，另用1條無任何靶基因的siRNA作為陰性對照(negative control；正義鏈5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，反義鏈5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′)，實驗共分為4組。轉(zhuǎn)染24 h后，用實時熒定量PCR實驗檢測基因沉默效率，每個實驗均重復3次。篩選出沉默效率最高的ELMO1-siRNA用于后續(xù)細胞劃痕、Trenswell小室遷移和侵襲實驗。

2.5 細胞劃痕實驗 實驗分ELMO1-siRNA組、negative control組和空白對照(blank control)組(只加Lipofectamine 2000，而未加任何siRNA的細胞組)。將細胞以每孔2×105的密度均勻地鋪在24孔板中，24 h后細胞融合率可達90%，吸出培養(yǎng)基，用10 μL的槍頭用力均勻地在孔中劃痕，PBS洗3次，加1 mL的RPMI-1640培養(yǎng)基。分別在劃痕后的0 h、18 h和36 h用顯微鏡檢測細胞的劃痕距離。細胞的遷移率(%)=(0 h劃痕距離-不同時點劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。每個實驗均重復3次，取平均值作為實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2.6 Transwell小室侵襲和遷移實驗 細胞侵襲實驗分ELMO1-siRNA組、negative control組和blank control組。Transwell小室的上室鋪一層人工基質(zhì)膠，置于24孔板上，將消化后用不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸的各組細胞懸液分別取100 μL加入小室上室中(1.0×109/L)，下室各加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h，吸去培養(yǎng)基，用棉簽擦盡上室面的人工基質(zhì)膠和細胞，下室面固定染色。每孔隨機取5個高倍鏡(×200)視野，取平均值，計數(shù)下室的細胞數(shù)即為穿透人工基底膜的細胞數(shù)，每個實驗重復3次，取平均值作為實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。對于細胞遷移實驗，只是在Transwell小室的上室不鋪人工基質(zhì)膠，其余步驟均相同。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較選用單因素方差分析。數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進行處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Western blot檢測胃癌細胞系和人正常胃黏膜上皮細胞ELMO1蛋白表達量的結(jié)果

如圖1所示，胃癌細胞系中ELMO1蛋白表達水平顯著高于人正常胃黏膜上皮細胞，差異顯著(P<0.01)。其中SGC7901細胞的ELMO1蛋白表達水平相對最高。

Figure 1.The protein expression of ELMO1 in normal gastric epithelial cells and different gastric cancer cell lines. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGES-1.

圖1 不同胃癌細胞株和人正常胃黏膜上皮細胞ELMO1蛋白的表達水平

2 實時熒光定量PCR檢測胃癌細胞系和人正常胃黏膜上皮細胞ELMO1 mRNA表達量的結(jié)果

胃癌細胞系中ELMO1 mRNA的表達水平同樣顯著高于人正常胃黏膜上皮細胞(P<0.01)，其中SGC7901的 ELMO1 mRNA表達量相對最高，與Western blot的結(jié)果基本一致，因此選用SGC7901細胞株作為后續(xù)的實驗研究，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of ELMO1 in normal gastric epithelial cells and different gastric cancer cell lines. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGES-1.

圖2 不同胃癌細胞株和人正常胃黏膜上皮細胞ELMO1 mRNA的表達水平

3 ELMO1-siRNA在SGC7901細胞中的沉默效果

選用的3條ELMO1-siRNA(siRNA_001、siRNA_002和siRNA_003)對SGC7901細胞ELMO1 mRNA的沉默效果均較顯著，如圖3所示，其相對ELMO1 mRNA表達抑制率分別達88.3%(siRNA_001)、90.3%(siRNA_002)和88.7%(siRNA_003)，差異顯著(P<0.05)，其中以siRNA_002對SGC7901細胞ELMO1 mRNA表達的抑制效率最高，因此選取siRNA_002用于后續(xù)的實驗。

Figure 3.The result ofELMO1 silencing in SGC7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control.

圖3 3種不同siRNA在SGC7901細胞中對ELMO1的沉默效果

4 細胞劃痕實驗檢測ELMO1對SGC7901細胞遷移能力影響的結(jié)果

用沉默后的SGC7901細胞株做細胞劃痕實驗，如圖4所示，劃痕后18 h，陰性對照組和空白對照組的細胞遷移率分別為(38.4±1.9)%和(38.2±3.3)%，而ELMO1-siRNA組的細胞遷移率為(6.3±1.6)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。劃痕36 h后，陰性對照組和空白對照組的細胞遷移率分別為(56.1±4.3)%和(53.5±4.4)%，而ELMO1 siRNA組的細胞遷移率為(35.4±5.5)%，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。這說明沉默ELMO1可顯著降低胃癌細胞的遷移能力。

Figure 4.The effect of ELMO1-siRNA on the migration of SGC7901 cells (×40). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsELMO1-siRNA.

圖4 沉默ELMO1對SGC7901細胞遷移能力的影響

5 Trenswell檢測ELMO1對SGC7901細胞遷移和侵襲能力影響的結(jié)果

如圖5所示，在遷移實驗中,培養(yǎng)48 h后，陰性對照組和空白對照組的SGC7901細胞遷移數(shù)分別為(140.0±15.7)個和(144.3±19.1)個，而ELMO1-siRNA組SGC7901細胞遷移數(shù)顯著減少為(84.0±8.5)個，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。同樣，在侵襲實驗中，培養(yǎng)48 h后，陰性對照組和空白對照組的SGC7901細胞侵襲數(shù)分別為(95.7±7.5)個和(100.0±16.8)個，而ELMO1-siRNA組SGC7901細胞侵襲數(shù)顯著減少為(36.3±7.0)個，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。以上實驗說明沉默ELMO1可顯著降低胃癌細胞的遷移和侵襲能力。

Figure 5.The effect of ELMO1-siRNA on the migration and invasion of SGC7901 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsELMO1-siRNA.

圖5 沉默ELMO1對SGC7901細胞遷移和侵襲能力的影響

討 論

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最具特征性的生物行為之一，它是一個多因素參與的復雜生物學過程，腫瘤微環(huán)境的改變、基質(zhì)降解、新血管形成、腫瘤細胞的脫黏附、遷移及免疫逃逸等多因素參與其中[10-11]。研究表明正常情況下Dock180 N端的SH3區(qū)域與C端的CZH2區(qū)域相互結(jié)合在一起，阻礙了Rac與Dock180 C端CZH2區(qū)域的結(jié)合，從而抑制Rac的激活，ELMO1與Dock180 N端的SH3區(qū)域結(jié)合成復合體后，降低了SH3區(qū)域與CZH2區(qū)域結(jié)合的穩(wěn)定性，而促進Rac與CZH2區(qū)域結(jié)合，從而激活Crk/Dock180/Rac1信號通路，進而促進腫瘤細胞的趨化和轉(zhuǎn)移[8,12]。眾多研究發(fā)現(xiàn)ELMO1在原發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤[13]、乳腺癌[14]、肝細胞癌[15]、卵巢癌[16-17]等多種惡性腫瘤中均有不同程度的異常表達，ELMO1/Dock180復合體在腫瘤細胞的趨化和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用Western blot和實時定量PCR實驗分別檢測了胃癌細胞株和人正常胃黏膜上皮細胞ELMO1的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌細胞株ELMO1蛋白和mRNA的表達水平顯著高于人正常胃黏膜上皮細胞，沉默ELMO1后，胃癌細胞株SGC7901細胞遷移和侵襲能力顯著降低。通過以上研究結(jié)果的分析，我們推測ELMO1也可能是通過與Dock180結(jié)合成ELMO1/Dock180復合體而激活Crk/Dock180/Rac1信號通路，進而促進胃癌細胞的趨化、轉(zhuǎn)移和侵襲。因此，ELMO1是促進胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素，有望成為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移治療的有效靶點，但ELMO1促進胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的具體作用機制還不清楚，后續(xù)我們將利用人體胃癌組織和動物模型檢測ELMO1與Dock180和Rac1之間的相互關系，進一步探討ELMO1對胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖和凋亡能力的影響及其作用機制。

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(責任編輯： 陳妙玲, 羅 森)

Role of ELMO1 in invasion and migration of gastric cancer cells

GUO Cheng-ming1, PENG Hui-yun2, GAO Dian2, HU Yan2, YU Qiong-fang1, LUO Wen1

(1DepartmentofGastroenterology,TheSecondAffiliatedHospital,2DepartmentofPathogenBiologyandImmunology,SchoolofBasicMedicalSciences,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:qiongfangyu@yeah.net)

AIM: To reveal the role and function of engulfment and cell mobility 1 (ELMO1) in the invasion and migration of gastric cancer cells. METHODS: The expression of ELMO1 at protein and mRNA levels was detected in 5 kinds of gastric cancer cells and 1 normal human gastric epithelial cells by Western blot and real-time PCR, and the gastric cancer cells with the highest expression of ELMO1 were screened out. The cell transfection experiment was used to silenceELMO1 expression in the gastric cancer cells, and the effect ofELMO1 silencing on the invasion and migration of the gastric cancer cells was detected by Transwell assay. RESULTS: The expression level of ELMO1 in the gastric cancer cells was significantly higher than that in human normal gastric epithelial cells (P<0.01), and the SGC7901 cells had the highest expression level of ELMO1. ELMO1-siRNA significantly silenced the expression ofELMO1 in the SGC7901 cells (P<0.01). Silencing ofELMO1 expression significantly reduced the invasion and migration abilities of the human gastric can-cer cells (P<0.01). CONCLUSION: ELMO1 is highly expressed in the gastric cancer cells, and promotes the invasion and migration abilities of the gastric cancer cells. ELMO1 may become an effective target for the treatment of invasion and metastasis of gastric cancer.

Engulfment and cell mobility 1; Gastric cancer; Cell invasion; Cell migration

1000- 4718(2017)05- 0782- 06

2016- 11- 08

2017- 01- 06

國家自然科學基金資助項目(No. 81460462)；南昌大學研究生創(chuàng)新基金資助項目(No.cx2015170)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.003

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