于明鶴,史秋梅,柴鐵瑛,柴楠楠,王會敏,高光平,高桂生,張艷英,高景龍

(1.文安縣畜牧獸醫(yī)局，河北 文安 065800； 2.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 昌黎066600；3.承德縣農(nóng)牧局，河北 承德 067499； 4.中紅三融集團(tuán)有限公司，河北 承德 067499)

黃芪和板藍(lán)根超微粉的粒徑觀察及其抗雞新城疫病毒效果

于明鶴1,史秋梅2*,柴鐵瑛3,柴楠楠3,王會敏3,高光平2,高桂生2,張艷英2,高景龍4

(1.文安縣畜牧獸醫(yī)局，河北 文安 065800； 2.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 昌黎066600；3.承德縣農(nóng)牧局，河北 承德 067499； 4.中紅三融集團(tuán)有限公司，河北 承德 067499)

為探討黃芪、板藍(lán)根超微粉的抗病毒作用，應(yīng)用激光粒度分析儀和掃描電鏡觀察了黃芪和板藍(lán)根超微粉的粉體粒度及其破壁情況，通過雞胚接種試驗(yàn)觀察2種中草藥超微粉對雞新城疫病毒的抑制作用。結(jié)果表明：黃芪和板藍(lán)根超微粉的粒度分布中心D50分別為10.10 μm和8.31 μm；2種中草藥超微粉的破壁情況良好，電鏡下只能觀察到不完整的細(xì)胞壁，為組織碎片。黃芪和板藍(lán)根超微粉對新城疫病毒最小抑制劑量分別為1 562.5、781.2 μg/mL，以板藍(lán)根抗病毒效果較好。

黃芪； 板藍(lán)根； 超微粉； 新城疫病毒

中草藥的超微粉碎可將細(xì)胞打碎，細(xì)胞破壁率高達(dá)95%，細(xì)胞經(jīng)破壁后，胞內(nèi)有效成分可充分暴露出來，使儲存于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的有效成分直接接觸到提取溶劑，或直接與機(jī)體受體結(jié)合，發(fā)揮治療效果[1]。研究證實(shí),許多中草藥具有增強(qiáng)免疫力、抑制和殺滅病原微生物的作用[2-3]。黃芪具有促進(jìn)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的功能,可抑制和殺滅微生物。黃芪多糖能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生抗病毒干擾素,抑制病毒蛋白的合成,從而使機(jī)體產(chǎn)生抗病毒感染的作用[4-7]。板藍(lán)根作為清熱解毒藥,可直接作用于免疫系統(tǒng)的免疫器官、免疫細(xì)胞及其分泌的抗體、細(xì)胞因子，對免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié), 通過提高機(jī)體免疫功能激發(fā)機(jī)體自身的抗菌、抗病毒、抗氧化作用[8-9]。為進(jìn)一步驗(yàn)證黃芪和板藍(lán)根對微生物在動物體外的殺滅和抑制作用, 以黃芪和板藍(lán)根為供試藥物,應(yīng)用激光粒度分析儀和掃描電鏡觀察了黃芪和板藍(lán)根超微粉的粉體粒度及其破壁情況，通過雞胚接種試驗(yàn)觀察了2種中草藥超微粉對雞新城疫病毒(NDV)的抑制作用，旨在為黃芪、板藍(lán)根的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

雞胚、中藥、毒株：8～10日齡雞胚(北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)、黃芪和板藍(lán)根超微粉(河北省某中藥廠制備)、NDV 標(biāo)準(zhǔn)毒株F48E8株(中國獸藥監(jiān)察所)。

儀器：JL9200激光粒度分析儀(青島市平度華寶電氣有限公司)、KYKY-2800掃描電鏡(北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司)、SCB-12小型離子試射儀(上海民儀電子有限公司)。

1.2 黃芪、板藍(lán)根超微粉粉體粒度及破壁觀察

取適量黃芪和板藍(lán)根超微粉分別用無水乙醇進(jìn)行分散，將分散后的粉體混懸液加入JL9200激光粒度分析儀的測定杯中，按操作說明進(jìn)行黃芪、板藍(lán)根超微粉粉體粒度的測定。測定的粉體顆粒大小即顆粒粒度用D表示，分別表示為D10、D25、D50、D75、D90，D50為中位徑或中值粒徑，表示1個樣品的累計(jì)粒度分布百分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時所對應(yīng)的粒徑，常用來表示粉體的平均粒度。用銀針將黃芪和板藍(lán)根超微粉分別撥散在碳雙面膠帶上，在SCB-12小型離子試射儀中噴鍍黃金4～5 min，黃金厚度約1.5×10-7cm，最后以20 kV的加速電壓，在KYKY-2800掃描電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)和破壁情況。

1.3 黃芪、板藍(lán)根超微粉抗病毒試驗(yàn)

1.3.1 NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測定 參照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行NDV增殖，計(jì)算EID50。將NDV標(biāo)準(zhǔn)毒株F48E8株按照10倍梯度連續(xù)稀釋9個稀釋度，取101～109稀釋度的病毒液接種于10日齡雞胚，每個稀釋度接種4枚雞胚，每枚雞胚接種0.1 mL，另設(shè)4枚雞胚為空白對照。將雞胚置于37.5 ℃恒溫箱中孵化，經(jīng)10 h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續(xù)觀察4 d，每天觀察雞胚發(fā)育情況，將24 h后死亡及96 h時未死的雞胚放入4 ℃冰箱中凍存、過夜，收集尿囊液，測定血凝效價，按Reed-Muench法計(jì)算EID50。

1.3.2 黃芪、板藍(lán)根超微粉提取液最大安全質(zhì)量濃度的測定 將黃芪和板藍(lán)根超微粉用70 ℃溫水溶解成1 g/mL儲存質(zhì)量濃度，分裝提取液，于121 ℃高壓滅菌30 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。將黃芪、板藍(lán)根超微粉提取液用生理鹽水分別進(jìn)行100倍稀釋，之后再進(jìn)行連續(xù)2倍倍比稀釋，取連續(xù)5個稀釋度的稀釋液(100×21～100×25)接種10日齡雞胚，每個稀釋度接種2枚雞胚，每枚雞胚接種0.2 mL，另設(shè)2枚雞胚為空白對照(接種生理鹽水)。將雞胚置于37.5 ℃恒溫箱中孵化，經(jīng)10 h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。觀察雞胚發(fā)育情況，記錄死胚情況。24 h后雞胚全部存活(并結(jié)合雞胚發(fā)育情況)的最高藥液質(zhì)量濃度為藥物對雞胚的最大無毒質(zhì)量濃度，該劑量即為對雞胚的最大安全質(zhì)量濃度。

1.3.3 黃芪、板藍(lán)根超微粉提取液對NDV的抑制作用測定 將黃芪和板藍(lán)根2種單味中草藥稀釋，每種藥物稀釋5個梯度質(zhì)量濃度，用1 mL滅菌注射器分別吸取100×EID50的NDV和不同稀釋梯度的單味中草藥提取液各1 mL，置于10個滅菌的小青霉素瓶中，混勻后置于37.5 ℃恒溫箱作用30 min。按參考文獻(xiàn)[11]的方法先將雞胚分為病毒組、中草藥病毒組和空白對照組。病毒組每胚尿囊腔接種0.1 mL病毒液和0.1 mL生理鹽水，中草藥病毒組每胚尿囊腔接種0.2 mL的病毒中草藥混合液，空白對照組每胚尿囊腔接種0.2 mL生理鹽水。接種后96 h收取尿囊液，測定NDV的血凝效價并觀察胚體變化。血凝試驗(yàn)采用微量凝集法，判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[11-12]的方法。與空白對照組相比，血凝滴度相差5個或以上滴度的中草藥劑量為對NDV的最小抑制劑量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪超微粉粉體粒度的分布情況

從表1可以看出，81.13%的黃芪超微粉粉體集中在1.981～88.583 μm，≤1.981 μm的粉體只占3.62%，≥88.583 μm的粉體占15.25%，粉體粒度分布中心D50為10.10 μm。粒徑最大的粉體可達(dá)344.206 μm，但在229.075～344.206 μm的粉體還不到1%。

表1 黃芪超微粉粉體粒度的分布情況

注:D10=3.01 μm，D25=5.22 μm，D50=10.10 μm，D75=26.23 μm，D90=130.12 μm。

2.2 板藍(lán)根超微粉粉體粒度的分布情況

從表2可以看出，78.31%的板藍(lán)根超微粉粉體集中在1.981～17.377 μm，≤1.981 μm的粉體占3.82%，≥17.377 μm的粉體占17.87%，粉體粒度分布中心D50為8.31 μm。粒徑最大者可達(dá)174.616 μm,在101.460～174.616 μm的粉體占全部粉體的1.13%。

表2 板藍(lán)根超微粉粉體粒度的分布情況

注：D10=3.10 μm，D25=5.22 μm，D50=8.31 μm，D75=14.53 μm，D90=25.11 μm。

2.3 黃芪、板藍(lán)根超微粉破壁情況的電鏡觀察結(jié)果

在掃描電鏡下可以看到，黃芪和板藍(lán)根微粉均勻分布,均看不到完整的藥物組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)不完整,只能看到組織碎片，且2種粉體的超微結(jié)構(gòu)無明顯區(qū)別(圖1、2)。

2.4 黃芪、板藍(lán)根超微粉體外抗病毒試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 EID50的測定結(jié)果 雞胚接種NDV 72 h后，105稀釋度的病毒液組有1枚雞胚死亡，106～109稀釋度的病毒液組雞胚無死亡，按Reed-Muench法計(jì)算EID50，NDV病毒液105倍稀釋時的EID50為0.1 mL。

圖1 黃芪超微粉在掃描電鏡下形態(tài)

圖2 板藍(lán)根超微粉在掃描電鏡下形態(tài)

2.4.2 黃芪、板藍(lán)根超微粉提取液最大安全質(zhì)量濃度 由表3可知，黃芪提取液在100×21～100×22稀釋度時,雞胚死亡或發(fā)育不良；在100×23稀釋度時，對雞胚發(fā)育無影響。黃芪提取液最大安全質(zhì)量濃度為2 500 μg/mL。板藍(lán)根提取液在100×21～100×22稀釋度時，雞胚發(fā)育不良；在100×23稀釋度時，對雞胚發(fā)育影響不明顯，毒性不大。板藍(lán)根提取液最大安全質(zhì)量濃度為1 875 μg/mL。

表3 中草藥提取液對雞胚最大安全質(zhì)量濃度測定結(jié)果

注：括號內(nèi)為雞胚數(shù)量。

2.4.3 黃芪、板藍(lán)根超微粉對NDV的抑制作用 空白對照組胚體發(fā)育良好；病毒組胚體發(fā)育不良，頭頸、四肢出血，60 h達(dá)到死亡高峰，72 h全部死亡；藥物病毒組，隨著藥物質(zhì)量濃度的降低，胚體的頭頸、四肢出血程度呈加重趨勢。黃芪和板藍(lán)根對NDV的最小抑制劑量分別為1 562.5、781.2 μg/mL(表4)。

表4 雞胚接種法篩選中草藥對NDV抑制作用的結(jié)果

3 結(jié)論與討論

將中草藥材粉碎至能通過篩孔內(nèi)徑為47 μm篩網(wǎng)，綜合細(xì)胞尺度破壁率可達(dá)到86.5%以上。黃芪和板藍(lán)根超微粉的粒度分布中心分別為10.10 μm和8.31 μm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于47 μm篩的內(nèi)徑。因此，從理論上講，本試驗(yàn)所用的黃芪和板藍(lán)根超微粉的破壁率應(yīng)高于86.5%。通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，黃芪和板藍(lán)根超微粉均看不到完整的細(xì)胞形態(tài)，只能觀察到組織碎片。這說明本試驗(yàn)所用的黃芪和板藍(lán)根超微粉的破壁率在90%以上。史萬玉等[13]應(yīng)用JL 9200激光粒度分析儀和掃描電鏡對黃芪和淫羊藿2種中草藥超微粉的粉體粒度及其破壁情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，這2種中草藥超微粉的粒度分布中心D50分別為6.82 μm和8.40 μm，且2種中草藥粉體90%以上的粒徑大小均未超過40.72 μm。中藥中80%是以植物藥為主的，植物類藥材的有效成分多貯存在細(xì)胞內(nèi)，中草藥超微粉碎技術(shù)是指利用機(jī)械或流體動力將3 mm以上物料顆粒粉碎至粒徑為30 μm以下的過程，可打破植物藥材細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的有效成分充分釋放出來，從而提高藥材的生物利用度，有利于畜禽機(jī)體對藥物的吸收利用。

NDV具有2種囊膜糖蛋白,即F、HN糖蛋白[14-16]。其中，HN糖蛋白既具有神經(jīng)氨酸酶活性，也具有血凝性，通過HN糖蛋白與動物紅細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合,可使紅細(xì)胞發(fā)生凝集，根據(jù)這一特性，所建立的血凝試驗(yàn)已成為檢測NDV效價的主要方法。將黃芪和板藍(lán)根超微粉制成液劑，各含原生藥1 g/mL，通過雞胚接種觀察了2種中草藥對NDV的抑制作用，用血凝試驗(yàn)檢測了2種中草藥對NDV的抗病毒作用，發(fā)現(xiàn)2種中草藥對NDV有不同程度的抑制作用，黃芪和板藍(lán)根對NDV的最小抑制劑量分別為1 562.5 μg/mL和781.2 μg/mL，板藍(lán)根的最小抑制劑量小于黃芪的最小抑制劑量，以板藍(lán)根抑制效果較好。黃芪和板藍(lán)根是獸醫(yī)臨床上常用的2種中草藥，用于增強(qiáng)畜禽的免疫力和抗病毒感染，本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，板藍(lán)根、黃芪對NDV的增殖有一定的抑制作用，其中板藍(lán)根作用相對較強(qiáng)。此外，值得提出的是，藥物的抗病毒活性與藥物的劑量有直接關(guān)系。在雞胚可耐受的劑量下，隨著藥物稀釋倍數(shù)的增加，其對病毒的抑制作用逐漸減弱。

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Size Observation and Anti-NDV Activity of Ultrafine Particle ofRadixAstragaliandRadixIsatidis

YU Minghe1，SHI Qiumei2*，CHAI Tieying3，CHAI Nannan3，WANG Huimin3， GAO Guangping2，GAO Guisheng2，ZHANG Yanying2，GAO Jinglong4

(1.Wenan Animal Husbandry and Veterinary Bureau,Wenan 065800,China; 2.Hebei Normal University of Science & Technology,Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine of Hebei Province,Changli 066600,China; 3.Bureau of Agriculture and Husbandry of Chengde County, Chengde 067499,China; 4.Zhonghong San Rong Group Co.,Ltd.,Chengde 067499,China)

To investigate the antiviral effect of ultrafine powders ofRadixAstragaliandRadixIsatidis,the size and the broken wall of ultrafine powders ofRadixAstragaliandRadixIsatidisby laser particle size analyzer and scanning electron microscope were observed and the inhibitory effects on Newcastle disease virus(NDV) were observed through the inoculation of chicken embryo.The results showed that the partical size distribution center D50of ultrafine powders ofRadixAstragaliandRadixIsatidiswere 10.10 μm and 8.31 μm,respectively.The broken wall condition was good,and the incomplete cell wall(pieces of tissues) could only be observed under electron microscope.The minimum inhibitory concentration to NDV ofRadixAstragaliandRadixIsatidiswere 1 562.5 μg/mL and 781.2 μg/mL respectively.The antiviral effect ofRadixIsatidiswas better.

RadixAstragali;RadixIsatidis; ultrafine particle; NDV

2016-11-22

科技部農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2012GB2A200044)；河北省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(12220408D,14966610D)；河北省科技廳獎勵性補(bǔ)助項(xiàng)目；承德市科技局計(jì)劃項(xiàng)目(2015N0001)

于明鶴(1980-)，男，河北灤平人，獸醫(yī)師，本科，主要從事動物傳染病防治研究。E-mail:yuminghe2004@163.com

*通訊作者：史秋梅(1965-)，女，河北樂亭人，教授，博士，主要從事動物傳染病防治研究。E-mail:shiqiumei@126.com

S859.3

A

1004-3268(2017)05-0140-04