葉蕾，葉鱗泓，張穎，魏榮，姜楠，裴重剛，高桂平，邵毅

（南昌大學第一附屬醫(yī)院 眼科，江西 南昌 330006）

槲寄生滴眼液預防去勢雄兔干眼癥的實驗研究*

葉蕾，葉鱗泓，張穎，魏榮，姜楠，裴重剛，高桂平，邵毅

（南昌大學第一附屬醫(yī)院 眼科，江西 南昌 330006）

目的 探究槲寄生滴眼液對預防去勢雄兔干眼癥的效果。方法取健康雄兔36只，將24只雄兔行雙側睪丸切除術制作去勢雄兔模型隨機分成兩組。A組為槲寄生滴眼液組，B組為生理鹽水組，剩下的12只為C組僅切開陰囊，不切除睪丸。分別于治療前、治療后2、4和8周檢查兩組淚液分泌實驗、角膜熒光素染色、淚液蛋白以及角膜共焦顯微鏡下的情況。結果治療2、4和8周后，A組淚液分泌實驗（SIT）和角膜熒光素染色（FL）較治療前稍有改變，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而B組SIT和FL較處理前惡化，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。治療后2周，A組淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性與治療前相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；B組在各個時間點淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性與處理前相比均有不同程度下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。比較角膜共焦顯微鏡下去勢干眼癥雄兔的角膜上皮基底層形態(tài)情況，發(fā)現(xiàn)A組角膜炎癥細胞和上皮基底細胞均減少。結論槲寄生滴眼液可有效減輕去勢雄兔干眼癥的癥狀和體征，具有一定的預防作用。

槲寄生滴眼液；去勢雄兔；干眼癥

干眼癥是一種常見的多因素影響的疾病，可以由免疫功能紊亂，神經系統(tǒng)疾病如強風和較低的濕度等環(huán)境因素引起，特點是改變角膜上皮屏障和損傷眼部表面環(huán)境造成眼部干燥和炎癥[1]。美國的調查結果顯示在65～84歲的人群中干眼病占14.6%[2]；加拿大的13 517人問卷調查中28.7%的人群有眼干癥狀，1.6%為嚴重癥狀[3]?，F(xiàn)如今，越來越多的干眼癥是由于激素水平紊亂而導致。有研究表明體內睪酮水平與淚液分泌量之間呈正相關[4]。本研究復制去勢雄兔干眼模型，觀察雄兔去辜丸激素水平的下降后，應用槲寄生滴眼液的療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組與手術方法

取健康成年雄兔36只，雄性，體質量1.5～2.0 kg，在無特殊病菌的恒溫條件下喂養(yǎng)（由南昌大學醫(yī)學院動物實驗中心提供）。將24只雄兔隨機分成兩組，參照馬軼群等[5]的方法將24只雄兔行雙側睪丸切除術，切除辜丸及附辜，結扎輸精管及精索靜脈，復制去勢雄兔模型。A組12只（12眼）直接滴入槲寄生滴眼液，B組12只（12眼）直接滴入生理鹽水，剩下的C組12只（12眼）雄兔僅切開陰囊，不切除睪丸，眼部不給與任何處理。36只雄兔均連續(xù)縫合陰囊皮膚，再局部涂碘配注意預防感染，全部選用雄兔的左眼進行實驗。本研究實驗符合動物倫理委員會（以下簡稱倫理委員會）要求，充分考慮到了動物的利益，減少動物了的應激、痛苦和傷害，尊重動物生命，采取痛苦最少的方法處置動物。

1.2 槲寄生滴眼液的制備

取槲寄生粉末約1 g，精密加入鹽酸乙醇溶液30ml，加氯仿提取5次（20、20、20、15和15ml），用氯仿-甲醇（80∶1）30ml沖洗，棄去洗液，再用氯仿-甲醇（20∶1）50ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加無水乙醇溶解等，得到所需槲寄生提取液。以蒸餾水溶解槲寄生提取物，水∶提取物質量比為1∶0.1，加入眼潤滑劑羧甲基纖維素，濃度控制1.5%，加入碳酸氫鈉NaHCO3以及氯化鉀KCl作為緩沖系統(tǒng)，濃度控制在0.1%以下。經過一系列的檢測與調整最后加入保存劑苯扎溴銨，其濃度控制在0.005%。

1.3 觀察方法

確保每次檢查的溫度、地點、時間、濕度及照明亮度相同，分別于治療前與治療后2、4和8周行淚液分泌實驗（schirmer’s test，SIT）、常用SchimerⅠ實驗和角膜熒光素染色（fluorescein staining，F(xiàn)L）檢查。同時觀察淚中含有多種抗微生物蛋白，本實驗觀察的蛋白包括淚液蛋白（tear protein，TP）、乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）、溶菌酶（Lysozyme，LZM）和淀粉酶（Amylase）。SIT是用一條濾紙并將一端折彎置眼內，其余部分懸垂于皮膚表面，檢測記錄5min后試紙淚液浸潤的長度（不包括反折），參照文獻的標準[6]，5min后測量濾紙上淚痕的長度，若長度＜5mm則提示干眼。角膜熒光素染色∶將熒光素滴于兔下眼結膜囊內，使其瞬目后，在裂隙燈下觀察角膜上皮的染色情況，評分參考文獻[7]：評分采用12分法，將角膜分為4個象限，依據(jù)不同的染色情況將每個象限分為0～3分，無染色為0分，＜5個點計為1分，≥5個點計為2分，≥5個點并有絲狀物染色或潰瘍計為3分。8周后從耳靜脈對去勢雄兔推注空氣處死，立即取其淚角膜浸泡于4%甲醛液中，常規(guī)石蠟切片及HE和PAS染色，然后在角膜共焦顯微鏡下觀察角膜上皮基底層形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prim 5.00統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，對各亞組癥狀評分以均數(shù)±標準差（±s）表示描述統(tǒng)計數(shù)據(jù)的集中位置和離散程度；計數(shù)資料用χ2檢驗，多時間點比較首先采用重復測量設計的方差分析，不同時間點組內兩兩比較時，采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 治療前后及兩組間各項干眼檢測指標評定結果比較

不同組間、不同時間點間SIT和FL相比，差異有統(tǒng)計學意義（FSIT=5.54和 11.76，F(xiàn)FL=11.26和6.52，P＜0.05）。A、B兩組治療前，SIT和FL相比差異無統(tǒng)計學意義（tSIT=0.542，tFL=0.714，P＞0.05）；治療2、4和8周后，A組SIT和FL較治療前稍有改變，差異均無統(tǒng)計學意義（tASIT=0.722、0.932和0.761，tAFL=0.653、0.752和0.952，均為P＞0.05），而B組SIT和FL較處理前惡化，差異均有統(tǒng)計學意義（tBSIT=5.913、6.411和 8.735，tBFL=3.883、6.329和7.712，均為P＜0.05）；A、B兩組在術后2周時SIT和FL相比，差異均無統(tǒng)計學意義（tSIT=0.562，tFL=0.832，P＞0.05），但A、B兩組在術后4和8周時SIT和FL相比，差異均有統(tǒng)計學意義（tSIT=3.542和4.127，tFL=5.329和7.156，P＜0.05）。見圖1。

2.2 兩組用藥前后各時間點淚液蛋白比較

不同組間、不同時間點間淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。處理前A、B兩組淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比較，差異均無統(tǒng)計學意義（t=0.528、0.414、0.743和0.943，P＞0.05）；術后2周，A組淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性與術前相比差異均有統(tǒng)計學意義（t=3.123、2.833、4.629和5.831，P＜0.05），術后4和8周，淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性與術前相比差異均無統(tǒng)計學意義（t=0.831、0.554、0.635和0.531，t=0.572、0.329、0.571和0.397，P＞0.05），而B組在各個時間點淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性與處理前相比均有不同程度下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；A、B兩組術后8周淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比，差異均有統(tǒng)計學意義（t=6.618、5.182、5.776和7.629，P＜0.05）。見圖2。

圖1 兩組處理前和處理后各時段SIT和FL比較

圖2 兩組患者手術前后淚液蛋白比較

2.3 處理前后及兩組間共聚焦顯微鏡觀察結果

正常角膜上皮基底層細胞顯示為光暗細胞體，窄的細胞邊界（圖3A）。A組可見少數(shù)炎癥細胞，上皮基底細胞數(shù)量趨于正常（圖3B）。B組角膜上皮細胞體積增大，角膜上皮層可見有呈亮光樣炎癥細胞，上皮基底細胞密度明顯增加（圖3C）。炎癥細胞進行計數(shù)發(fā)現(xiàn)，A組2個月后炎癥細胞和上皮基底細胞密度分別為（81±16）個/mm2和（3 004±107）個/mm2，而B組炎癥細胞和上皮基底細胞密度分別為（252±21）個/mm2和（4 234±212）個/mm2，兩組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（tBC=5.174，tIC=3.821，P＜0.05）。

圖3 槲寄生滴眼液、生理鹽水對去勢干眼癥雄兔的角膜上皮基底層形態(tài)的影響

3 討論

干眼癥可以有各種各樣的癥狀包括眼睛干澀、有異物感、視力模糊、刺激和眼痛。目前，干眼多是以局部對癥治療為主，包括人工淚液、糖皮質激素及免疫抑制劑等眼液滴眼以及行淚道栓塞治療。

槲寄生為桑寄生科，味苦、性平，歸肝、腎經。具祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎的功效，為歷版藥典所收載。用色譜等方法從槲寄生中分離得到多個黃酮類化合物，主要有：3'-甲基鼠李素，3'-甲基鼠李素-3-葡萄糖甙，異鼠李素-3-葡萄糖甙，異鼠李素-7-葡萄糖甙（isorhamnetin-7-O-β-D-glucoside），3'-甲基圣草素，3'-甲基圣草素-7-葡萄糖甙（3'-methylerlodi ctyol-7-O-β-D-glucoside）又稱槲寄甙甲，槲寄生新甙Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ等[8]。槲寄生提取物中主要含有的黃酮類物質屬于植物雌激素的一種，可與性激素受體結合而發(fā)揮作用；有人利用放射性示蹤標記的方法研究還表明黃酮類物質是細胞膜雄激素受體的刺激物，可以與細胞膜雄激素受體結合發(fā)揮生物學效應。

目前基礎研究已證實淚腺、瞼板腺、角膜和結膜上均分布有雄激素受體[9]。槲寄生提取物可能可以與其結合發(fā)揮擬雄激素作用。另一方面，由于雄激素、黃酮類化合物均為雜環(huán)多酚類化合物，可以利用其化學結構的相似性，維持體內雄激素的正常水平，治療某些雄激素水平下降導致的疾病。研究已證明某些黃酮類化合物具有擬雄激素作用。

近年來已有研究表明密蒙花茶、鬼針草在動物實驗上能用于治療雌/雄激素下降導致的干眼模型，密蒙花茶、鬼針草提取物滴眼劑中主要成分為黃酮類物質，可顯著抑制雄激素水平降低后干眼癥的發(fā)生[10]。MCVEY等[11]對F1鼠進行連續(xù)大豆異黃酮灌胃，連續(xù)灌胃120 d后，檢測F1鼠睪丸和精液中雄激素含量，與對照組比較均有顯著的升高。DEENI等[12]研究發(fā)現(xiàn)，槲寄生有著廣譜的抗菌活性，對某些多重耐藥細菌和真均有效果。同時槲寄生中含有凝集素、磷脂成分可促進機體的免疫力，提高抑菌能力。槲寄生中的甲基鼠李素用于抗新生血管、抗炎和抗腫瘤，并研究其能通過抑制VEGFR2信號通道而發(fā)揮抑制新生血管、抗炎和抗腫瘤作用，而干眼本身就是一種眼部炎癥，對干眼抗炎發(fā)揮一定的作用[13]。此外，槲寄生對于多種眼表微生物具有抑菌作用，同時含大量膽堿，可引起流淚，防止干眼患者的眼表狀態(tài)進一步惡化。

本研究結果顯示：槲寄生滴眼液可有效減輕去勢雄兔干眼癥的癥狀和體征，具有一定的預防作用。A組在使用槲寄生滴眼液2、4和8周后SIT和FL較治療前稍有改變，可能因為槲寄生水煎液中的黃酮類化合物發(fā)揮擬雄激素的作用，與眼表組織雄激素受體結合，促進眼瞼腺體分泌。而B組SIT和FL較治療前明顯惡化，進一步體現(xiàn)出A組使用槲寄生滴眼液治療后的效果。A、B兩組術后8周淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性都有所改變。A組術后2周效果明顯，淚液總蛋白量、乳鐵蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性都在逐漸恢復正常，4和8周后已完全恢復正常。B組在術后的2、4和8周與術前相比均有不同程度下降，表明有惡化趨勢。此外本次研究比較角膜共焦顯微鏡下去勢干眼癥雄兔的角膜上皮基底層形態(tài)情況，發(fā)現(xiàn)A組角膜炎癥細胞和上皮基底細胞均減少，逐漸趨于正常組，槲寄生滴眼液有效地減少了炎癥反應，改善了瞼板腺、淚腺的分泌。經槲寄生滴眼液治療干眼方便簡單，不會對其他部位產生影響。

綜上所述，對于去勢雄兔干眼癥，槲寄生滴眼液可較快而明顯地改善干眼的癥狀和維持淚液蛋白成分。作為一種安全有效、給藥途徑簡單、副反應少且廉價的治療干眼的方法，具有廣泛臨床應用及推廣價值。

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（張西倩 編輯）

Experimental study on m istletoe eye drops in prevention of xerophthalm ia of castrated male rabbits*

Lei Ye,Lin-hong Ye,Ying Zhang,RongWei,Nan Jiang,Chong-gang Pei,Gui-ping Gao,Yi Shao
(Departmentof Ophthalmology,the First Affiliated Hospital,Nanchang University, Nanchang,Jiangxi330006,China)

ObjectiveTo investigate the experimental effect ofmistletoe eye drops in prevention of xerophthalmia of castrated male rabbit.MethodThirty-six healthy male rabbits were chosen.The castrated dry eye models were established in 24male rabbits and random ly divided into 2 groups,i.e.group A(mistletoe eye drop group)and group B (normal saline group).In the remaining 12 rabbits (12 eyes,group C)the scrotum was cut and the testes were saved.Schirmer test(SIT),corneal fluorescein(FL),tear proteins,and corneal condition under confocalmicroscope were checked before treatment and 2,4 and 8 weeks after treatment.ResultsAfter treatment for 2,4 or 8 weeks, SIT and FL were slightly changed in the group A without statistical differences(P＞0.05),while SIT and FL were significantlyworsened than those before treatment in the group B(P＜0.05).In the group A,tear protein,lactoferrin, lysozyme and amylase activity 2 weeks after treatment had statistical differences from those before treatment(P＜0.05).In the group B tear total protein content,lactoferrin,lysozyme and amylase activity at all time points significantly decreased compared with those before treatment(P＜0.05).Observation of the base layer of corneal epithelium in the castrated male rabbits under corneal confocalmicroscope revealed that corneal inflammatory cells and epithelial basal cells were reduced in the group A.ConclusionsMistletoe eye drops can effectively reduce the signs and symptoms of dry eyes of the castratedmale rabbits and have a certain preventive effect.

mistletoe eye drops;castrated male rabbit;xerophthalmia

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.005

1005-8982（2017）07-0020-05

2016-11-21

國家自然科學基金（No：81160118、81460092、81400372）；江西省遠航工程（No：2014022）；江西省青年科學基金（No：20151BAB215016）；江西省科技支撐計劃項目（No：20151BBG70223）；江西省衛(wèi)計委中醫(yī)藥科技計劃項目（No：2015JX126）

邵毅，E-mail：freebee99@163.com；Tel：0791-88596614