王倩，陽琰，陳其榮，張晗，高琳，廖鑫，王茜

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，貴州 遵義 563003）

內(nèi)脂素對2型糖尿病kkay小鼠骨骼肌組織PI3K和GLUT-4的影響*

王倩，陽琰，陳其榮，張晗，高琳，廖鑫，王茜

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，貴州 遵義 563003）

目的 觀察內(nèi)脂素（visfatin）對kkay糖尿病小鼠骨骼肌組織磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT-4）的影響。方法C57BL/6J小鼠隨機分為普通飼料喂養(yǎng)組（CON）、高脂飼料喂養(yǎng)組（HFD），kkay小鼠隨機分為糖尿病模型組（DM）和visfatin治療組（V）。采用實時熒光定量PCR和W estern blot方法測定各組小鼠骨骼肌中PI3K和GLUT-4的mRNA和蛋白表達。結(jié)果V組腹腔注射visfatin后的血糖較注射前下降（P=0.013），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。DM組PI3K、GLUT-4的mRNA及蛋白表達量較CON組、HFD組降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；V組PI3K、GLUT-4的mRNA及蛋白表達量較DM組增加（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論內(nèi)脂素可上調(diào)骨骼肌組織PI3K和GLUT-4的表達。

內(nèi)脂素；kkay小鼠；骨骼肌；PI3K；GLUT-4

糖尿病是以高血糖為特征的一組疾病，主要病理生理機制為胰島素抵抗和（或）胰島素分泌不足，其中2型糖尿病的主要病理機制是胰島素抵抗。內(nèi)脂素（visfatin）具有模擬胰島素降糖作用，可改善胰島素抵抗，但其降血糖的機制并不明確，部分研究結(jié)果并不一致。正常生理狀態(tài)下，骨骼肌作為胰島素作用的主要靶器官之一，葡萄糖在骨骼肌中的轉(zhuǎn)運受損是導(dǎo)致外周胰島素抵抗的重要原因。本實驗選用自發(fā)型2型糖尿病動物模型kkay小鼠為研究對象，通過觀察visfatin對kkay糖尿病小鼠骨骼肌組織磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase isoforms，PI3K）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transport protein-4，GLUT-4）的影響，以期為糖尿病發(fā)病機制及治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物：SPF級8周齡雄性kkay小鼠，體重30 g左右，SPF級8周齡雄性C57BL/6J小鼠，體重20 g左右，均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所提供，許可證編號：SCXK（京）2009-0004；kkay小鼠全價高脂飼料（購自中國醫(yī)科院實驗動物研究所，組成：78.8%基礎(chǔ)飼料，10%蛋黃粉，10%豬油，1%膽固醇，0.2%膽鹽）；飼養(yǎng)于室溫20～24℃，濕度40%～60%的環(huán)境中。實驗材料：小鼠胰島素測定試劑盒（美國R&D system公司），強生穩(wěn)步倍加型血糖儀（測定血糖），內(nèi)脂素重組蛋白購于以色列PROSPEC公司，GLUT-4抗體購于美國Abcam公司，PI3K抗體購于美國Cell signaling公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，CFX Connect實時熒光定量PCR（RT-PCR）儀為美國Bio-Rad公司。

1.2 模型的復(fù)制及分組

C57BL/6J小鼠用隨機數(shù)字法分為普通飼料喂養(yǎng)組（normal diet group，CON）和高脂飼料喂養(yǎng)組（high-fat diet group，HFD），kkay小鼠以高脂飼料喂養(yǎng)，每周定時測定1次空腹血糖，直至連續(xù)2次空腹血糖≥13.9mmol/L為糖尿病成模，成模后的小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)21周后又隨機分為糖尿病模型組（diabeitc group，DM） 和 visfatin治療組（visfatin treatment group，V），V組連續(xù)3 d腹腔注射visfatin重組蛋白（6μg/kg，0.05ml/10g）。DM組、CON組及HFD組均注射等量磷酸鹽緩沖液（PBS）。

1.3 標(biāo)本采集

腹腔注射麻醉（10%水合氯醛）小鼠成功后眼球取血，3 000 r/min離心15min取上清液保存于-80℃冰箱用于測定胰島素。迅速分離小鼠右后側(cè)骨骼肌組織，生理鹽水清洗干凈后濾紙吸干水分，取約100mg置于1ml Trizol中-80℃冰箱凍存，用于RT-PCR；其余骨骼肌速凍后置入-80℃冰箱冷凍保存用于Western blot檢測。

1.4 RT-PCR法測定骨骼肌組織中PI3K、GLUT-4 m RNA的表達

按照氯仿-異丙醇-乙醇法提取骨骼肌總RNA，按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。采用10μl PCR反應(yīng)體系（正反向引物0.5μl+cDNA稀釋液2μl+0.1% DEPC水 2.5μl+SYBR Green Su permix熒光混合物5μl）；反應(yīng)條件：95.0℃×3min；95.0℃×10 s，60.0℃×45 s，共40個循環(huán)。每個樣本均設(shè)副孔，取CT平均值。β-actin：正向引物5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，反向引物5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'；PI3K正向引物5'-CCCATGGGACAACATTCCAA-3'，反向引物5'-CATGGCGACAAGCTCGGTA-3'；GLUT-4正向引物5'-TTCTTATTGCAGCGCCTGAGTC-3'，反向引物5'-CCAAGCACAGCTGAGAATACAGCTA-3'。

1.5 Western blot法測定骨骼肌組織PI3K和GLUT-4蛋白的表達

取小鼠骨骼肌組織約100mg于1.5ml EP管中，剪刀將組織塊剪碎后，加入1 ml裂解液 ，在冰上勻漿至乳糜狀，離心20 min，取上清即為蛋白液，將蛋白液分裝于小EP管中置入-80℃冰箱保存。按BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性（100℃，5min）后上樣電泳，電轉(zhuǎn)，封閉，加入PI3K、GLUT-4一抗孵育過夜。第2天洗膜后加入二抗搖床中孵育1 h，曝光。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單因素方差分析用于多組間數(shù)據(jù)的比較，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠部分代謝指標(biāo)

DM組體重較CON組升高（P=0.002），較HFD組升高（P=0.002），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；DM組血糖較CON組升高（P=0.010），較HFD組升高（P=0.007），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；V組血糖較DM組降低（P=0.027），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 小鼠骨骼肌PI3K、GLUT-4 mRNA表達

DM組小鼠骨骼肌PI3K mRNA較CON組下降（P=0.043），較HFD組下降（P=0.045），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；V組小鼠骨骼肌PI3K mRNA較DM組上升（P=0.009），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；DM組小鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA表達較CON組下降（P=0.014），較HFD組下降（P=0.012），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；V組GLUT-4 mRNA表達較DM組上升（P=0.004），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表1 4組小鼠部分代謝指標(biāo)比較 （n=8，±s）

表1 4組小鼠部分代謝指標(biāo)比較 （n=8，±s）

注：1）與CON組比較，P＜0.05；2）與HFD組比較，P＜0.05；3）與DM組比較，P＜0.05；4）與注射visfatin（或PBS）前比較，P＜0.05

空腹胰島素/（μIU/L）CON組 24.4±0.80 7.78±1.15 9.33±2.39 5.18±0.59 HFD組 25.04±1.03 9.04±1.25 9.64±1.03 6.55±0.401）DM組 41.23±3.951）2） 21.18±4.93 20.86±3.621）2） 8.63±0.671）2）V組 38.73±4.59 19.90±2.403） 13.43±1.103）4） 7.71±1.28F值 32.88 24.16 21.81 17.39P值 0.25 0.14 0.11 0.16組別 體重/g 血糖（給visfatin或PBS前）/（mmol/L） 血糖（給visfatin或PBS后）/（mmol/L）

表2 4組小鼠骨骼肌PI3K、GLUT-4 m RNA表達比較（n=8±s）

表2 4組小鼠骨骼肌PI3K、GLUT-4 m RNA表達比較（n=8±s）

注：1）與CON組比較，P＜0.05；2）與HFD組比較，P＜0.05；3）與DM組比較，P＜0.05

GLUT-4/β-actin CON組 4.36±0.65 6.24±0.61 HFD組 3.94±0.29 6.16±0.64 DM組 3.41±0.181）2） 3.78±0.661）2）V組 4.23±0.253） 6.92±0.633）F值 4.77 18.60P值 0.27 0.90組別PI3K/β-actin

2.3 小鼠骨骼肌PI3K、GLUT-4蛋白表達

圖1 4組小鼠骨骼肌組織PI3K蛋白的表達

如圖1、2所示，DM組小鼠骨骼肌組織PI3K蛋白表達較CON組降低（P=0.007），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；V組PI3K蛋白較DM組增高（P=0.013），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；DM組GLUT-4蛋白表達量較CON組降低（P=0.004），較HFD組降低（P=0.009），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；V組GLUT-4蛋白表達量較DM組增高（P=0.004），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 4組小鼠骨骼肌組織GLUT-4蛋白的表達

3 討論

Visfatin自被發(fā)現(xiàn)以來，大量的研究致力于vis fatin與糖尿病的關(guān)系及其調(diào)控血糖的機制，該研究有望為糖尿病的治療提供新的策略。研究發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，糖尿病人群血漿中的visfatin濃度均明顯升高[1-4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，visfatin濃度的升高也能使血漿葡萄糖水平呈劑量依賴性的降低[1-2，5-6]。該研究均表明Visfatin與血糖有著密切的關(guān)系。Visfatin主要在脂肪組織中表達，在肌肉、肝臟、活化的淋巴細胞、下丘腦等也有表達[7]。KRZYSIK-WALKER等發(fā)現(xiàn)，骨骼肌是小雞體內(nèi)visfatin的主要來源，visfatin可能影響骨骼肌的生長和代謝[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程中，骨骼肌的代謝障礙起著重要的作用[9]。因此，研究visfatin在骨骼肌中的代謝可能成為緩解胰島素抵抗的突破點。Visfatin有多種生理功能[10]，有研究表明，visfatin有類胰島素樣作用，通過與胰島素受體結(jié)合促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取，抑制肝細胞葡萄糖的釋放，從而達到降低血糖的作用[7，11]。研究表明，visfatin與胰島素受體結(jié)合導(dǎo)致受體磷酸化、反向信號分子活化，visfatin與胰島素非競爭性的與胰島素受體結(jié)合，表明visfatin和胰島素分別結(jié)合在胰島素受體的不同部位[12]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，腹腔注射小鼠visfatin重組蛋白3 d后，血糖較注射visfatin前降低，表明visfatin降低血糖，可能visfatin與胰島素降糖機制有所不同，值得筆者深入研究。本研究中HFD組空腹胰島素較CON組升高，說明高脂飲食刺激，HFD組分泌較多的胰島素，HFD組空腹胰島素代償性分泌增多的結(jié)果，使得HFD組小鼠的血糖維持動態(tài)平衡。與CON組、HFD組比較，DM組血糖及空腹胰島素升高，同時DM組小鼠PI3K、GLUT-4 mRNA及蛋白表達均降低；糖尿病小鼠注射visfatin之后血糖下降，而空腹胰島素反而下降，考慮visfatin降低血糖的機制并非是直接由胰島素所起作用，可能visfatin具有類胰島素作用。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，visfatin在骨骼肌中的表達水平與骨骼肌糖脂代謝狀態(tài)有關(guān)，visfatin可能通過PI3K信號傳導(dǎo)通路參與骨骼肌糖脂代謝的調(diào)節(jié)。因葡萄糖的轉(zhuǎn)運依賴GLUT-4在膜內(nèi)外的轉(zhuǎn)移，而GLUT-4的表達受其正向基因PI3K的調(diào)控。綜合DM組和V組的上述實驗結(jié)果，筆者推測visfatin可能是通過增加PI3K和GLUT-4的基因表達而起到降低血糖水平、改善胰島素抵抗的作用。

總之，visfatin可上調(diào) kkay小鼠骨骼肌組織PI3K、GLUT-4 mRNA及蛋白表達，從而影響血糖代謝。本研究有望為visfatin與糖尿病關(guān)系提供理論證據(jù)，而visfatin在糖脂代謝中的具體機制尚需在細胞水平及人體臨床研究中進一步闡明。

[1]LAYLA K A.Visfatin levels in iraqi controlled diabetic patients and uncontrolled diabetic with cardiomyopathy[J].Journal of Natural Sciences Research,2015,5:39-41.

[2]ESTEGHAMATI A,ALAMDARI A,ZANDIEH A,et al.Serum visfatin is associated with type 2 diabetes mellitus independent of insulin resistance and obesity[J].Diabetes Res Clin PR,2011,91: 154-158.

[3]JEANNETTE M,MOLLY H,CYNTHIA SC,et al.Adipokine gene expression in peripheral blood of adult and juvenile dermatomyositis patients and their relation to clinical parameters and disease activity measures[J].J Neuroinflamm,2015,12:29.

[4]楊再剛,趙艷艷,岳欣閣,等.糖尿病患者血漿visfatin水平變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2013,53(31):31-32.

[5]HAIDER D G,SCHALLER G,KAPIOTIS S,et al.The release of the adipocytokine visfatin is regulated by glucose and insulin[J]. Diabetologia,2008,49:1909-1914.

[6]CHEN M P,CHUNG FM,CHANG DM,et al.Elevated plasma level of visfatin/pre-B cell colony-enhancing factor in patients with type 2 diabetes mellitus[J].J Clin Endocrinol Metab,2006, 91(1):295-299.

[7]FUKUHARA A,MATSUDA M,NISHIZAWA M,et al.Visfatin: a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin[J].Science,2005,307:426-430.

[8]KRZYSIK-WALKER S M,OCN-GROVE O M,MADDINENI S R,et al.Is visfatin an adipokine or myokine?Evidence for greater visfatin expression in skeletal muscle than visceral fat in chickens[J].Endocrinology,2008,149(4):1543-1550.

[9]DEFRONZO R A,TRIPATHY D.Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes[J].Diabetes Care, 2009,32(2):S157-163.

[10]PRAGUE M R,SMITKA K,MARES OVáD.Adipose tissue as an endocrine organ:an update on pro-inflmmatory and anti-inflmmatory microenvironment[J].Prague Medical Report,2015, 116(2):87-111.

[11]SESHI JK,VIDAL-PUIG A.visfatin:the missing link between intra-abdominal obesity and diabetes[J]Trends Mol Med,2005, 11:344-347.

[12]ADEGHATEE.Visfatin:structure,function and relation to diabetes mellitus and other dysfunctions[J].Curr Med Chem,2008, 15:1851-1862.

（張蕾 編輯）

Influence of visfatin on PI3K and GLUT-4 in skeletalmuscle of diabetic kkay m ice*

Qian Wang,Yan Yang,Qi-rong Chen,Han Zhang,Lin Gao,Xin Liao,Qian Wang
(Department of Endocrinology,the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College, Zunyi,Guizhou 563003,China)

ObjectiveTo observe the influence of visfatin on glucose transporter 4(GLUT-4)and phosphatidylinositol 3-kinase isoform(PI3K)in skeletal muscle of kkay mice.MethodsC57BL/6Jmice were random ly divided into normal diet group (group CON)and high-fat diet group (group HFD);kkay mice were divided into diabetic group (group DM)and visfatin treatmentgroup(group V).PI3K and GLUT-4mRNA and protein expressions in the skeletal muscle were measured by qRT-PCR and Western blot.ResultsIn the group V,blood glucose significantly decreased after intraperitoneal injection of visfatin(P=0.013).PI3K and GLUT-4mRNA and protein expressions of skeletalmuscle were significantly lower in the group DM than in the groups CON and HFD (P＜0.05).PI3K and GLUT-4 mRNA and protein expressions of skeletal muscle were significantly higher in the group V than in the group DM(P＜0.05).ConclusionsVisfatin increases the expressions of PI3K and GLUT-4 in skeletalmuscle.

visfatin;kkaymice;skeletalmuscle;PI3K;GLUT-4

R 589.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.001

1005-8982（2017）07-0001-04

2016-07-20

國家自然科學(xué)基金（No：81660142）

高琳，E-mail：lgzymc@sina.com，Tel：13595286671