劉宇偉，樊再雯，吳娟娟，張帥，張波

（空軍總醫(yī)院1.呼吸內(nèi)科，2.腫瘤內(nèi)科，北京 100142）

人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞對(duì)人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響*

劉宇偉1，樊再雯2，吳娟娟2，張帥1，張波1

（空軍總醫(yī)院1.呼吸內(nèi)科，2.腫瘤內(nèi)科，北京 100142）

目的 探討缺氧條件下，細(xì)胞共培養(yǎng)體系中人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HPASMCs）經(jīng)由Survivin信號(hào)通路調(diào)控人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HPAECs）的增殖。方法建立Transwell共培養(yǎng)體系將HPASMCs和HPAECs分別接種于下室和上室，根據(jù)HPASMCs是否行YM 155（Survivin抑制劑）預(yù)處理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：常氧條件下HPASMCs與HAPECs共培養(yǎng)對(duì)照組（N組），常氧條件下YM 155（終濃度100 nmol/l）預(yù)處理HPASMCs與HPAECs共培養(yǎng)組（NY組），缺氧條件下HPASMCs與HAPECs共培養(yǎng)組（H組）和缺氧條件下YM 155預(yù)處理HPASMCs與HPAECs共培養(yǎng)組（HY組）。采用活細(xì)胞計(jì)數(shù)（CCK8）法檢測(cè)各組中HPASMCs與HPAECs的增殖活性（吸光度，A值），實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HPASMCs中Survivin mRNA的表達(dá)，W estern blot檢測(cè)HPASMCs中Survivin蛋白的表達(dá)。結(jié)果N組HPASMCs與HPAECs增殖活性（0.561±0.007）、（0.619±0.013）與H組（0.777±0.030）、（0.875±0.021）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=16.615和21.333，P＜0.05）。HY組HPASMCs與HPAECs增殖活性為（0.661±0.027）、（0.723±0.025），與H組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=8.923和12.667，P＜0.05）。共培養(yǎng)體系中N組HPASMCs未見(jiàn)mRNA和Survivin蛋白（0.017±0.001）表達(dá)，H組中HPASMCs可見(jiàn)mRNA（4 506±849）和Survivin蛋白（0.932±0.018）表達(dá)。HY組HPASMCs mRNA和Survivin蛋白含量為（677±183）和（0.426±0.022），與H組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=15.25和50.6，P＜0.05）。結(jié)論缺氧導(dǎo)致HPASMCs和HPAECs異常增殖，缺氧條件下共培養(yǎng)體系中HPASMCs經(jīng)由Survivin信號(hào)通路調(diào)控HPAECs的增殖。

肌細(xì)胞；平滑??；內(nèi)皮細(xì)胞；缺氧；生存素；共培養(yǎng)

缺氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxia pulmonary hypertension，HPH）是一種漸進(jìn)性、致死性疾病，其病理生理基礎(chǔ)包括肺血管收縮、肺動(dòng)脈平滑?。╬ulmonary arterial smooth cells，PASMCs）增生和肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary arterial endothelial cells，PAECs）功能失調(diào)[1]。HPH形成的關(guān)鍵是缺氧肺血管重構(gòu)，而缺氧條件下PASMCs和PAECs的異常增殖在肺血管重建中起著主導(dǎo)作用。缺氧條件下PASMCs和PAECs彼此是否相互影響？其之間是否存在信號(hào)傳遞？其具體機(jī)制又是什么？目前都尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)建立缺氧條件下人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HPASMCs）和人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HPAECs）共培養(yǎng)體系，從生存素（Survivin）信號(hào)通路角度探討HPASMCs對(duì)HPAECs增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

HPASMCs、HPAECs、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Scien Cell公司，DMEM（高糖）培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，活細(xì)胞計(jì)數(shù)盒（CCK-8，批號(hào)：CK04）購(gòu)自日本Dojindo公司，TRNzol-A+總RNA提取試劑、SYBR Premix、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）、FastQuantRTKit（With gDNase）均購(gòu)自北京天根生化科技公司，蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自廣州碧云天公司，兔抗人生存素單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，山羊抗兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Survivin、GAPDH引物由上海桑尼公司合成，YM155購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，Transwell孔板（孔徑0.4μm，貨號(hào)：3412）購(gòu)自美國(guó)Corning公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 HPASMCs與HPAECs共培養(yǎng)和分組

按美國(guó)Scien Cell公司的說(shuō)明書(shū)復(fù)蘇HPASMCs和HPAECs，將細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整到最佳。以105個(gè)細(xì)胞接種6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，匯合度80%左右，用胰酶消化傳代，取4～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。建立Transwell共培養(yǎng)體系，實(shí)驗(yàn)分組為4組：常氧對(duì)照組（N組），HPASMCs及HPAECs細(xì)胞分別鋪于Transwell小室的上下室，下室為HPASMCs細(xì)胞，上室為HPAECs細(xì)胞，培液更換成DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；常氧條件下 YM155（100 nmol/L）預(yù)處理的 HPASMCs與HPAECs共培養(yǎng)組（NY組），Transwell下室為YM155預(yù)處理24 h的HPASMCs與上室的HPAECs共培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同正常對(duì)照組；缺氧培養(yǎng)組（H組），Transwell上室為 HPAECs細(xì)胞，下室為HPASMCs細(xì)胞，細(xì)胞更換成DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液，置于37℃、2.5%O2、5%CO2、92.5%N2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；缺氧條件下應(yīng)用YM155（100 nmol/L）預(yù)處理的PASMCs與PAECs共培養(yǎng)組（HY組），Transwell下室為YM155預(yù)處理24 h的HPASMCs與上室的HPAECs共培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同缺氧對(duì)照組。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 Transwell共培養(yǎng)體系中HPASMCs活性：干預(yù)方式及給藥同上述分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白組（只有培養(yǎng)液，無(wú)細(xì)胞）。每孔溶液的總體積為100μl，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。檢測(cè)時(shí)每孔加入10μl的CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于培養(yǎng)后的48 h用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定HPASMCs每孔的吸光值（A值）。CCK-8法檢測(cè)Transwell共培養(yǎng)體系中HPAECs活性：此次實(shí)驗(yàn)將HPAECs置于Transwell共培養(yǎng)體系中的下室，HPASMCs置于上室，干預(yù)方式及給藥同前，只改變2種細(xì)胞的位置，按照上述CCK-8法檢測(cè)HPAECs活性的方法，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定HPAECs每孔的A值。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HPASMCs中Survivin mRNA的表達(dá) 按Trizol試劑操作說(shuō)明書(shū)提取HPASMCs中總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，取A260/A280值在1.8～2.0的標(biāo)本。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，并對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定產(chǎn)物的長(zhǎng)度為設(shè)計(jì)的長(zhǎng)度，GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)4組中Survivin mRNA的表達(dá)，Survivin正向引物：5'ACTTGGCCCAGTGGGTTTTT-3'，反向引物：5'-CA GAAAGGAAAGCGCAACCG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為108 bp。GAPDH正向引物：5'-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3'，反向引物：5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為112 bp。PCR反應(yīng)體系為20μl，其中熒光定量MIX 10μl、cDNA 1μl、正反向引物各1μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。循環(huán)完成后分析溶解曲線(xiàn)以確定PCR的特異性。采用2-△△Ct分析目的基因mRNA的表達(dá)量。Ct是達(dá)到熒光閾值的循環(huán)圈數(shù)，△△Ct=（Ct目的基因-Ct管家基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對(duì)照組。

1.3.3 W estern blot檢測(cè)各組HPASMCs中Survivin蛋白的表達(dá) 細(xì)胞總蛋白的提?。菏占疶ranswell共培養(yǎng)體系中下室的HPASMCs，用4℃預(yù)冷的PBS洗3遍，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，置于冰上20min后，于4℃、12 000 r/min離心5min，取上清液，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)濃度，并將所測(cè)蛋白濃度調(diào)為均一值。蛋白質(zhì)變性：每組中取20μg蛋白質(zhì)加在5×SDS凝膠上樣緩沖液中，99℃煮沸變性10min。分離蛋白質(zhì)：用10%的聚丙烯酰胺進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，80 V電壓下電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)從濃縮膠進(jìn)入分離膠后電壓改為120 V，電泳1.5 h左右。轉(zhuǎn)膜及封閉：電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。免疫反應(yīng)：一抗為兔抗人生存素單克隆抗體（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜后，TBST洗3次，次日室溫孵育二抗山羊抗兔IgG（1∶8 000）1 h，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光顯影。Survivin蛋白的相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶之比表示。結(jié)果采用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性

N組HPASMCs與HPEACs增殖活性分別為（0.561±0.007）、（0.619±0.013），應(yīng)用YM155預(yù)處理 HPASMCs后與 HPEACs共培養(yǎng)，結(jié)果顯示HPASMCs與HPEACs增殖活性沒(méi)有明顯變化，分別為（0.565±0.014）、（0.626±0.014）。H組HPASMCs與HPAECs增殖活性上升（0.777±0.030）、（0.875±0.021），與N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=16.615和21.333，P＜0.05）。HY組HPASMCs與HPEACs增殖活性為（0.661±0.027）、（0.723±0.025），與H組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=8.923和12.667，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 HPASMCs中Survivin mRNA的表達(dá)

常氧條件下，N組與 NY組共培養(yǎng)體系中HPASMCs未見(jiàn)Survivin mRNA的表達(dá)，缺氧條件下，H組共培養(yǎng)體系HPASMCs mRNA表達(dá)與N組比較升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=17.95，P＜0.05）。而缺氧條件下，應(yīng)用YM155預(yù)處理HPASNCs與HPAECs共培養(yǎng)后，HPASMCs中Survivin mRNA表達(dá)量又明顯下降，由H組（4 506±849）下降到（677±183），與H組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=15.25，P＜0.05），見(jiàn)附表。

圖1 各組HPASMCs和HPAECs的增殖活性

2.3 各組HPASMCs Survivin蛋白的表達(dá)

常氧條件下，N組與 NY組共培養(yǎng)體系中HPASMCs Survivin蛋白的表達(dá)量極低，分別為（0.017±0.001）和（0.016±0.001），經(jīng)缺氧條件下共培養(yǎng)，H組HPASMCs Survivin蛋白的表達(dá)量上升為（0.932±0.018），與N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=91.5，P＜0.05）。而應(yīng)用YM155預(yù)處理HPASNCs與HPAECs共培養(yǎng)后，其HPASMCs中Survivin蛋白表達(dá)量下降，為（0.426±0.022），與H組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=50.6，P＜0.05），見(jiàn)附表，圖2。

附表 各組HPASMCs m RNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)量 （±s）

附表 各組HPASMCs m RNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)量 （±s）

注：1）與N組比較，P＜0.05；2）與H組比較，P＜0.05

Survivin蛋白1 0.017±0.001 1 0.016±0.001 H組 4 506±8491） 0.932±0.0181）HY組 677±1832） 0.426±0.0222）F值 74 388 2 895.469P值 0.000 0.000分組N組NY組SurvivinmRNA

圖2 各組HPASMCs Survivin蛋白的表達(dá)

3 討論

HPH的基本病理變化是肺血管重構(gòu)，引起肺血管重構(gòu)的機(jī)制主要有兩方面：缺氧直接作用于PASMCs，促進(jìn)其增殖[2]，缺氧作用于PAECs，使其釋放多種細(xì)胞因子，這些因子再作用于PASMCs、PAECs和成纖維細(xì)胞，并促進(jìn)其增殖[3]。有研究表明[4]，缺氧可刺激PAECs合成和分泌內(nèi)皮素-1（endothelin 1，ET-1）、5-羥色胺、血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和血栓素A2等因子，促進(jìn)PASMCs增殖，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓形成。平滑肌細(xì)胞（smooth cells，SMCs）是內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）的周細(xì)胞之一，2種細(xì)胞在生長(zhǎng)與代謝等方面存在相互作用，SMCs主要通過(guò)2種方式參與影響ECs：遠(yuǎn)距離的細(xì)胞通訊和細(xì)胞間的連接通訊[5]。但是缺氧條件下，PASMCs對(duì)PAECs是否產(chǎn)生影響，目前研究甚少。本實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室共同培養(yǎng)HPASMCs和HPAECs，模擬細(xì)胞的生理狀態(tài)，研究缺氧條件下，HPASMCs對(duì)HPAECs增殖的影響。本研究結(jié)果顯示，Transwell共培養(yǎng)體系在缺氧條件下，HPASMCs和HPAECs增殖活性均升高，而應(yīng)用YM155后，2種細(xì)胞的增殖活性又均下降，并進(jìn)一步證明在缺氧條件下，共培養(yǎng)體系中的HPASMCs Survivin mRNA與蛋白的表達(dá)均高于常氧條件下的表達(dá)。這說(shuō)明Survivin在缺氧共培養(yǎng)體系中可能起介導(dǎo)作用，HPASMCs通過(guò)Survivin信號(hào)通路調(diào)控HPAECs的增殖。

肺動(dòng)脈血管壁主要是由ECs與SMCs構(gòu)成的，2種細(xì)胞間相互作用、相互影響對(duì)維持血管生理功能和血管壁自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起重要作用。在肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展中，2種細(xì)胞勢(shì)必存在一些物質(zhì)或生物信號(hào)，使其相互影響，促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)程。夏世金等[6]研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下共培養(yǎng)體系中PAECs經(jīng)Notch1/Japped1信號(hào)通路調(diào)控PASMCs的增殖，導(dǎo)致缺氧性肺血管重塑。LIN等[7]研究也證實(shí)，ECs通過(guò)Notch信號(hào)通路調(diào)控SMCs表型的變化。有研究顯示，PAECs分泌的 ET-1與位于PASMCs上的ET-A受體結(jié)合后[8-9]，可通過(guò)激活PKC（protein kinase C，PKC）、TKs（tyrosine kinases，TKs）及Rho激酶等通路，增加細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平[10]，同時(shí)還可以誘導(dǎo)MAPK通路和c-fox、c-jun基因的激活，促進(jìn)PASMCs異常增殖，進(jìn)而促進(jìn)HPH的進(jìn)展。而另一方面，WEDGWOOD等[11]研究新生兒肺動(dòng)脈高壓，通過(guò)建立PASMCs與PAECs共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)PAECs產(chǎn)生的ET-1與PASMCs上受體反應(yīng)后，促使PASMCs生成活性氧類(lèi)（reactive oxygen species，ROS）增多并釋放至PAECs，導(dǎo)致PAECs中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的表達(dá)與活化降低，繼而PAECs產(chǎn)生一氧化氮減少，從而促進(jìn)肺血管的收縮與重構(gòu)。此外，共培養(yǎng)體系中SMCs通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）刺激ECs產(chǎn)生表型變化，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移、基底膜細(xì)胞基質(zhì)蛋白沉著，從而影響血管生成和成熟[12]。本實(shí)驗(yàn)表明在缺氧條件下共培養(yǎng)體系中HPASMCs經(jīng)Survivin信號(hào)通路影響HPAECs的增殖，從而促進(jìn)肺血管的重構(gòu)。

Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosisproteins，IAP）家族的重要一員，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的雙重功能[13]。Survivin在絕大多數(shù)腫瘤中過(guò)度表達(dá)，并且Survivin的高表達(dá)與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)[14-15]。YM155為Survivin的小分子抑制劑，對(duì)多數(shù)腫瘤細(xì)胞組具有抗腫瘤效應(yīng)[16]。筆者前期的研究表明[17]，缺氧條件下單獨(dú)培養(yǎng)的HPASMCs中可見(jiàn)Survivin表達(dá)，并促進(jìn)HPASMCs增殖，應(yīng)用YM155干預(yù)后可抑制其增殖。而本次實(shí)驗(yàn)采 用 Transwell小 室 共培 養(yǎng) HPASMCs與HPAECs，應(yīng)用 YM155預(yù)處理 HPASMCs后與HPAECs共培養(yǎng)，使得缺氧條件下HPASMCs和HPAECs增殖活性明顯降低，表明缺氧條件下Survivin在HPASMCs和HPAECs異常增殖中起重要作用。缺氧條件下共培養(yǎng)體系中HPASMCs經(jīng)由Survivin信號(hào)通路調(diào)控HPAECs的增殖，在HPH的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。細(xì)胞與細(xì)胞之間存在豐富的信息交流與復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)，彼此之間還會(huì)通過(guò)這些路徑相互作用、相互影響。本研究結(jié)果為治療HPH提供新的思路和方法。

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（張蕾 編輯）

Human pulmonary arterialsmoothmuscle cells regulate proliferation of human pulmonary arterial endothelial cells via survivin signaling pathway under hypoxic condition*

Yu-weiLiu1,Zai-wen Fan2,Juan-juanWu2,ShuaiZhang1,Bo Zhang1
(1.Department of Respiratory Medicine,2.Departmentof Oncology,General Hospital of PLA Air Force,Beijing 100142,China)

ObjectiveTo investigate the effect of hypoxic human pulmonary arterial smooth muscle cells (HPASMCs)on the proliferation of human pulmonary arterialendothelial cell(HPAECs)and themechanism.MethodsA Transwell coculture system of HPASMCs and HPAECs was constructed.HPAECs were put into the upper chamber while HPASMCs were put into the lower chamber.The Transwell coculture system included the following groups∶normoxic coculture of HPASMCs and HPAECs(N group),normoxic coculture of HPASMCs pretreated withYM155(inhibitor of survivin)and HPAECs(NY group),hypoxic coculture of HPASMCs and HPAECs(H group),and hypoxic coculture of HPASMCs pretreated with YM155 and HPAECs(HY group).Cell proliferation was determined using a Cell Counting Kit-8(CCK-8).The mRNA and protein expressions of survivin in the HPASMCs were measured by qRT-PCR and Western blot respectively.ResultsThe proliferation of HPASMCs and HPAECs in the H group [(0.777±0.030)and(0.875±0.021)respectively]was significantly increased compared with that of the N group [(0.561±0.007)and(0.619±0.013)，q=16.615 and 21.333，P＜0.05].As compared with the H group,the proliferation of HPASMCs and HPAECs in the HY group [(0.661±0.027)and (0.723±0.025)respectively] significant decreased(q=8.923 and 12.667,P＜0.05).The mRNA and protein of survivin were expressed in HPASMCs of the H group[(4506±849)and(0.932±0.018)]，but not in those of the N group(0.017±0.001).As compared with the H group,the survivinmRNA and protein expressions of HPASMCs in the HY group[(677±183) and(0.426±0.022)]significant decreased(q=15.25 and 50.6,P＜0.05).ConclusionsHypoxia leads to abnormal proliferation of HPASMCs and HPAECs,and under hypoxic condition HPASMCs regulate the proliferation of HPAECs via survivin signaling pathway in the coculture system．

myocyte;smoothmuscle;endothelial cell;hypoxia;survivin;coculture

R 563

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.006

1005-8982（2017）07-0025-05

2016-07-27

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81170045）

樊再雯，E-mail：kzzaiwenfan@163.com

張帥現(xiàn)工作單位為滄州市人民醫(yī)院