劉均玲, 康靜瑋, 符中環(huán), 馬 莎

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殼寡糖對海南熱帶糙海參免疫相關酶的影響

劉均玲1, 2, 康靜瑋1, 2, 符中環(huán)1, 2, 馬 莎1, 2

(1. 海南大學 熱帶生物資源教育部重點實驗室, 海南 ?？?570228; 2. 海南大學 海洋學院, 海南 ?？?570228)

本研究測定了殼寡糖對海南熱帶糙海參()體腔液和體壁組織中免疫相關因子, 酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LSZ)和溶血素活性的影響。結果表明, 投喂0.5%殼寡糖對糙海參體腔液中AKP、ACP、LSZ和溶血素活性均有明顯增強作用(<0.05), 其中對ACP和LSZ活力有極顯著的影響(<0.01), 且投喂6 d內(nèi)活性均持續(xù)增強; 0.5%殼寡糖對體壁組織勻漿液中AKP、ACP活性明顯增強(<0.05), 但隨著時間延長, 對體壁組織中LSZ和溶血素作用不明顯。殼寡糖可以提高海南熱帶糙海參()的非特異性免疫力。

糙海參(); 酸性磷酸酶; 堿性磷酸酶; 溶菌酶; 溶血素; 殼寡糖

糙海參(), 熱帶海參優(yōu)質(zhì)品種, 皮質(zhì)粗糙, 體色多呈灰白并具有深色條紋, 屬于棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuriidae)中瘤海參亞屬(), 主要分布在潮流強、海草多的岸礁邊緣或水深10 m以內(nèi)的淺海海域[1]。海南熱帶糙海參生長周期較短, 適應性強, 肉厚味美, 成為有潛力的沿海海參養(yǎng)殖種類[2-3]。但隨著養(yǎng)殖密度的增加和養(yǎng)殖時間的延長, 糙海參養(yǎng)殖病害問題越來越嚴重[4]。且大量抗生素的使用, 使有害菌產(chǎn)生耐藥性, 在動物體內(nèi)產(chǎn)生藥物殘留[5-6]。影響海參生長的因素有很多, 比如水溫是刺參生長重要的環(huán)境因子, 可以影響消化酶、代謝酶和免疫酶活力[7-8]。其中最重要的是其自身特有的免疫機制, 因此對海參免疫機能的分析, 不僅可以了解免疫的變化, 而且還可以進一步探討其生態(tài)免疫機理[9]。

殼寡糖(chitooligosaccharid, COS)是由2~10 個氨基葡萄糖以-l, 4糖苷鍵連接而成的低聚糖, 是自然界中唯一的堿性寡糖, 具有相對分子質(zhì)量小、毒性低、水溶性好、吸收率高等特點。目前, 寡糖在水產(chǎn)動物上的應用越來越多。Shibata等[10]研究證明, 殼寡糖能提高小鼠生產(chǎn)性能和非特異性免疫功能。蔡雪峰等[11]的研究表明, 殼寡糖可顯著提高虹鱒的非特異性免疫和抗感染能力。Staykov等[12]在虹鱒飼料中添加甘露寡糖, 結果顯示, 甘露寡糖能顯著激活虹鱒補體系統(tǒng), 提高溶菌酶活力和抗體滴度, 增強其免疫功能, 減少死亡率。劉美思等[13]研究報道, 海洋寡糖COS作為仿刺參()的免疫增強劑, 可有效提高幼參的生長性能和免疫力。然而, 殼寡糖用于海南熱帶糙海參()的研究還未見報道。

本研究擬針對糙海參的免疫系統(tǒng)的特點, 研究殼寡糖對糙海參體腔液和體壁組織免疫相關酶的作用, 通過對比分析, 為深入研究糙海參免疫防御機制提供基本的理論基礎, 以期為養(yǎng)殖中糙海參疾病的預防和治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 糙海參

實驗所用糙海參()于2014年11月采自海南省陵水縣黎安港, 體質(zhì)量45~70 g, 暫養(yǎng)于室內(nèi), 充氣, 水溫(16±1)℃, 鹽度30±1, pH7.4± 0.4, 每天更換海水, 使鹽度恒定[2]。實驗前, 對實驗參饑餓24 h。

實驗設計: 空白對照, 健康糙海參未投喂0.5%殼寡糖; 實驗處理, 健康糙海參投喂0.5%殼寡糖。每個處理3個重復, 實驗期間養(yǎng)殖條件相同, 每天更換海水, 并檢測溫度、鹽度、pH等指標, 于投喂后第1、2、3、4、5、6 天制備體腔液和體壁組織液, 測定相關免疫因子。

1.2 實驗方法

1.2.1 體腔液的制備

將糙海參, 從腹部距口1/3處抽取體腔液, 4℃ 500 r/min離心10 min, 取上清1 mL, –4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 體壁酶液的制備

將糙海參體壁組織稱重后, 加入體壁組織4倍體積的預冷生理鹽水于組織勻漿機中攪拌, 收集研磨液, 4℃下4 000 r/min離心10 min, 取上清, –4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 溶菌酶活性測定

溶菌酶(LZS)活性通過濁度比色法測定[14]。將活化后的溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus, 購于廣東微生物菌種保藏中心)用0.l mol/L pH6.4的磷酸緩沖液稀釋至570為0.35。實驗條件下, 以每mL樣品每min吸光值減少0.001為1個酶活性單位(U)。

1.2.4 酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性測定

堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性的測定采用磷酸苯二鈉法[15]。

1.2.5 溶血素含量測定

取2.5 mL雞紅細胞懸液加0.1 mL血清(對照組用0.1 mL的生理鹽水代替血清), 37℃保溫30 min后, 1 000 r/min離心2 min, 于540 nm處測光吸收值。溶血素含量表示為: 所測值′稀釋倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel和dps進行方差分析, 最小顯著差數(shù)法(LSD)進行多重比較。

2 結果與分析

由表1可知, 投喂0.5%殼寡糖對糙海參體腔液中免疫相關因子LSZ、ACP、AKP和溶血素活性均有顯著的影響(<0.05), 其中對ACP和LSZ活力有極顯著的影響(<0.01)。

由表2可知, 投喂0.5%殼寡糖對糙海參體壁組織中免疫相關因子LSZ、ACP、AKP和溶血素活性均有顯著的影響(<0.05), 其中對ACP、AKP和LSZ活力有極顯著的影響(<0.01)。

2.1 殼寡糖對糙海參AKP活性的影響

投喂0.5%殼寡糖后, 糙海參體腔液和體壁組織中AKP活性均升高。圖1表明, 糙海參在投喂0.5%殼寡糖2 d后, 6 d內(nèi)體腔AKP活性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢, 其中前3 dAKP活性變化不明顯, 從第4天開始AKP活性逐漸增強。圖2表明, 糙海參在投喂0.5%殼寡糖2 d后, 6 d內(nèi)體壁組織AKP活性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢, 其中前4 dAKP活性變化比較緩慢, 平穩(wěn)上升, 從第5天開始AKP活性明顯增強。

表1 殼寡糖對糙海參體腔液酶的影響(平均值±標準誤)

注: 標有不同小寫字母上標表示差異顯著(<0.05), 標有不同大寫字母表示差異極顯著(<0.01)

表2 殼寡糖對糙海參體壁酶相關因子的影響(平均值±標準誤)

注: 標有不同小寫字母上標表示差異顯著(<0.05), 標有不同大寫字母表示差異極顯著(<0.01)

圖1 殼寡糖對體腔AKP活性的影響

圖2 殼寡糖對體壁組織AKP活性的影響

2.2 殼寡糖對糙海參ACP活性的影響

投喂0.5%殼寡糖后, 糙海參體腔液中ACP活性逐漸升高, 體壁組織ACP活性先增強再減弱。圖3表明, 糙海參在投喂0.5%殼寡糖2 d后, 6 d內(nèi)體腔ACP活性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢, 其中第2天ACP活性變化明顯, 之后每日ACP活性逐漸增強。圖4表明, 糙海參在投喂0.5%殼寡糖2 d后, 6日內(nèi)體壁組織ACP活性呈現(xiàn)先逐漸升高, 再緩慢降低的趨勢, 其中前5 dACP活性平穩(wěn)上升, 第5天ACP活性最高, 從第5天后ACP活性開始減弱。

圖3 殼寡糖對體腔ACP活性的影響

圖4 殼寡糖對體壁組織ACP活性的影響

2.3 殼寡糖對糙海參LSZ活性的影響

投喂0.5%殼寡糖后, 糙海參體腔液中LSZ活性逐漸升高, 但是體壁組織LSZ活性先增強再減弱。圖5表明, 投喂0.5%殼寡糖2 d后, 糙海參6 d內(nèi)體腔LSZ活性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢, 其中第4天LSZ活性變化最明顯, 第5、6天體腔LSZ活性趨于穩(wěn)定, 變化微弱。圖6表明, 投喂0.5%殼寡糖2 d后, 糙海參6 d內(nèi)體壁組織LSZ活性呈現(xiàn)先逐漸升高, 再緩慢降低的趨勢, 其中前3 dLSZ活性平穩(wěn)上升, 第3天LSZ活性最高, 從第3天后LSZ活性開始減弱, 第5、6天體壁組織LSZ活性趨于穩(wěn)定。

圖5 殼寡糖對體腔LSZ活性的影響

圖6 殼寡糖對體壁組織LSZ活性的影響

投喂0.5%殼寡糖后, 糙海參體腔液中溶血素含量逐漸升高, 但是體壁組織LSZ活性先增強再減弱, 變化趨勢不穩(wěn)定, 這可能是由于LSZ主要由體腔細胞分泌, 體壁組織中LSZ含量極少的原因[16]。

2.4 殼寡糖對糙海參溶血素含量的影響

圖7表明, 投喂0.5%殼寡糖, 糙海參6 d內(nèi)體腔溶血素含量呈現(xiàn)小幅度逐漸升高的趨勢, 第5、6天體腔溶血素含量趨于穩(wěn)定, 變化微弱。

圖8表明, 投喂0.5%殼寡糖, 糙海參6 d內(nèi)體壁組織溶血素含量呈現(xiàn)先逐漸升高, 接著急劇降低, 再升高的趨勢, 其中前4 d溶血素含量平穩(wěn)上升, 在第4天達到最高, 第5天溶血素含量急劇減弱, 第6天體壁組織溶血素含量又升高。

圖7 殼寡糖對體腔溶血素含量的影響

圖8 殼寡糖對體壁組織溶血素含量的影響

3 討論

堿性磷酸酶是一種對底物專一性要求比較低的磷酸單脂水解酶, 廣泛存在于生物界, 是重要的解毒體系, 堿性環(huán)境下, 可使磷酸單脂水解為乙醇和磷酸。本研究中, 糙海參投喂0.5%殼寡糖6 d內(nèi), 體腔液、體壁組織中AKP活性持續(xù)升高。近年來, 免疫刺激物在水產(chǎn)生物上的應用研究逐漸受到重視。艾春香等[16]用不同劑量的VE刺激河蟹(), AKP活力有顯著升高的趨勢; 劉云等[17]研究報道, 刺參()口服不同劑量海藻硫酸多糖和殼聚糖, AKP活力顯著增強; 劉樹青等[18]用海藻多糖投喂中國對蝦(), AKP活性也得到加強。但本實驗中AKP活性在投喂結束第6天后, 會不會繼續(xù)出現(xiàn)高活性值, 需要進一步的研究。

酸性磷酸酶是一種在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機磷酸的水解酶, 主要存在于巨噬細胞, 定位于溶酶體內(nèi)。本研究, 糙海參投喂殼寡糖6 d內(nèi), 與未投喂殼寡糖的對照海參相比, 糙海參體腔液和體壁組織勻漿液中ACP活性均有極顯著的差異(<0.01),這與很多研究報道, 免疫多糖可以誘導ACP活性提高的結論相一致。劉樹青等[18]報道中國對蝦()攝食海藻多糖可提高ACP活性; 牟海津等[19]報道櫛孔扇貝()口服海藻多糖免疫增強劑可以使ACP活性明顯升高。

溶菌酶是許多生物組織和體液里普遍存在的堿性蛋白, 是吞噬細胞殺菌的物質(zhì)基礎, 可使革蘭氏陽性細菌細胞壁的乙酰基多糖水解釋放, 破壞和清除體內(nèi)的異物。本實驗結果顯示, 投喂0.5%殼寡糖后, 糙海參體腔液中LSZ活性逐漸升高, 但是體壁組織LSZ活性先增強再減弱, 第3天活性達到最高, 0.5%殼寡糖對體壁組織LSZ活性影響總體不明顯。沈錦玉等[20]通過實驗證明, 中華絨螯蟹口服殼聚糖免疫增強劑以后的第9天, 血清溶菌酶活性與對照組相比顯著增強(<0.05), 這和本實驗研究結果基本相同。而體壁組織勻漿液中LSZ活性先升高再降低, 可能是由于體壁組織中LSZ含量很少, 或免疫疲勞等原因。Gopalakannan等[21]研究表明給鯉魚()投喂殼聚糖飼料添加劑90 d, 其溶菌酶活性顯著增強(<0.05)。

溶血素由體腔細胞分泌, 可以與靶細胞接觸, 在細胞質(zhì)膜上形成空洞, 使其裂解死亡[6]。本研究, 糙海參投喂0.5%殼寡糖后, 體腔液中溶血素含量逐漸升高, 但是體壁組織LSZ活性先增強再減弱再升高, 變化趨勢不穩(wěn)定。

綜上, 投喂0.5%殼寡糖對糙海參體腔液中AKP、ACP、LSZ和溶血素活性均有明顯增強作用, 對體壁組織勻漿液中AKP、ACP活性也有明顯增強, 但對體壁組織中LSZ和溶血素作用不明顯。江小璐等[22]在基礎飼料中添加0.1%褐藻寡糖, 發(fā)現(xiàn)均能顯著提高AKP、ACP的活性。因此, 寡糖可以提高動物的非特異性免疫力, 可能由于其具有免疫原性, 刺激了機體進行免疫應答, 作為外源抗原的佐劑, 減緩其吸收, 從而增強了動物的細胞和體液免疫反應[23-24]。本研究結論: 投喂殼寡糖可提高海南熱帶糙海參()免疫相關因子的活性。

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Effect of COS on immune factors in the Hainan tropical sea cucumber

LIU Jun-ling1, 2, KANG Jing-wei1, 2, FU Zhong-huan1, 2, MA Sha1, 2

(1. Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, Haikou 570228, China; 2. The Ocean College Hainan University, Haikou 570228, China)

The influence of chitosan oligosaccharide (COS) on immune factors in the Hainan tropical sea cucumberwas studied. Acid phosphatase (ACP), alkaline phosphatase (AKP), lysozyme (LSZ), and hemolysin activity were detected in the coelomic fluid and body wall. The result showed that feeding 0.5% COS significantly enhanced the activity of AKP, ACP, LSZ, and hemolysin in the coelomic fluid of(< 0.05), which has an extremely significant impacton the activity of ACP and LSZ (< 0.01). The activity was continuously enhanced in 6 days. Further, feeding 0.5% COS significantly enhanced the activity of AKP and ACP in the body wall (<0.05); however, over time, the effect on LSZ and hemolysin activity was not obvious. COS can improve the non-specific immune activity of.

ACPAKP; LSZ; hemolysin;

(本文編輯: 梁德海)

[Hainan province colleges and universities scientific research project, No.Hjkj2013-11; Hainan university youth fund project, No.qnjj1223]

Dec. 13, 2016

劉均玲(1975-), 女, 河北滄州人, 副教授, 主要從事海洋底棲生物學的研究, E-mail: 330108510@qq.com

Q178.1

A

1000-3096(2017)12-0026-06

10.11759/hykx20160601001

2016-12-13;

2017-03-11

海南省高等學?？茖W研究項目(Hjkj2013-11); 海南大學青年基金項目(qnjj1223)