張曉雪， 孫秀蘭*， 張銀志

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

新型黑曲霉液體發(fā)酵及對黃曲霉毒素B1的脫除

張曉雪1， 孫秀蘭*1， 張銀志2

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

對經(jīng)紫外照射誘變制備的新型黑曲霉FS-UV1在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）中的pH、蛋白質質量濃度、蛋白酶活性變化以及脫除機制進行了研究。在發(fā)酵過程中，pH值不斷下降，由初始pH 5.9下降為1.83。蛋白質質量濃度在發(fā)酵48 h后達到最大，為10.07 g/L，而酸性蛋白酶活性則在72 h達到最高，為0.98 U/mL。新型黑曲霉FS-UV1孢子懸液對AFB1無脫除效果，而菌絲體對AFB1具有吸附作用，發(fā)酵液則對AFB1具有降解作用，其中發(fā)揮降解作用的可能是蛋白質。對FS-UV1在pH 7的模擬腸道環(huán)境中脫除黃曲霉毒素B1（AFB1）的效果進行了評價。脫除48 h時，在pH 7的模擬腸道環(huán)境中對AFB1的脫除率為87.3%。

新型黑曲霉；紫外誘變；AFB1；生物脫除

霉菌及其產(chǎn)生的毒素對食品及動物飼料的污染已然成為現(xiàn)今不可忽視的世界性難題，而霉菌所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物即毒素會引起動物體重減輕，影響肝腎臟功能，免疫抑制等嚴重疾病甚至死亡。而黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1簡寫為AFB1）作為公認毒性最強的毒素會引發(fā)肝癌及遺傳毒性[1-2]。近年來，物理、化學、生物脫除毒素方法成為主要的脫毒方式[3-5]。而生物脫除方法因其與物理、化學方法相比脫除條件相對比較溫和，不易對食品等原材料的營養(yǎng)成分及風味產(chǎn)生變化和環(huán)境友好型等優(yōu)點受到關注與推崇。研究表明，某些真菌及細菌甚至生物堿能夠有效抑制黃曲霉毒素B1的產(chǎn)生并對其具有降解作用，其中包括平菇、枯草芽孢桿菌、某些藥用真菌等[6-8]，而這些真菌對AFB1的脫除機制與它們在發(fā)酵過程中的產(chǎn)生的胞外酶密切相關，研究發(fā)現(xiàn)，某些胞外酶可以破壞AFB1結構中的雙呋喃環(huán)從而改變AFB1的熒光性質及毒性，并且已有研究人員成功純化獲得了胞外酶[9]。黑曲霉作為能夠有效抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生及降解AFB1的微生物，已被報道并受到廣泛關注[10]。作者對誘變獲得的新型黑曲霉FS-UV1在PDB培養(yǎng)基中pH等指標的變化進行了研究，并對其降解AFB1的效果進行了評價。早期為了研究對毒素的脫除效果所進行的體外試驗大多是在中性環(huán)境下進行的，但考慮到實際應用中腸道環(huán)境的復雜性及方法的簡便性，模擬腸道成為了一種既簡便又能最大程度上還原實際腸道環(huán)境的有效方法。作者使用模擬腸道來評價新型黑曲霉FS-UV1對AFB1的脫除效果，不僅為后期的體內動物實驗提供了參考，還為實際應用的可行性提供了可靠的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新型黑曲霉菌株FS-UV1：保藏于武漢微生物保藏中心，編號CCTCC M2013553；AFB1標準品：Sigma公司；乙腈：質譜純，美國TEDIA公司。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯300 g、葡萄糖20 g、瓊脂20g、氯霉素0.1 g、蒸餾水1 L，自然pH，121℃高壓滅菌15 min。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB培養(yǎng)基）：馬鈴薯300 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L、自然pH，121℃高壓滅菌15 min。計數(shù)培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH（7.0±0.2），121℃高壓滅菌15 min。

1.2 設備

DGG-9123AD電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；LS-B50L立式圓形壓力蒸汽滅菌器：上海醫(yī)用核子儀器廠；SW-CJ-1D潔凈工作臺：蘇州凈化設備廠生產(chǎn)；MJ-180B霉菌培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；AB204-N電子天平：梅特勒-托利多國際貿（上海）有限公司；安捷倫1100高效液相色譜系統(tǒng)：美國安捷倫公司；PB-10/C標準型PH計：上海精密儀器有限公司；WFH-203B三用紫外分析儀：上海精科實業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 新型黑曲霉FS-UV1的液體發(fā)酵 將PDA斜面上黑曲霉菌株點接到固體平板中央，進行菌體活化，30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，取出放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ眠m量的生理鹽水洗脫斜面培養(yǎng)基中的孢子，在預先滅菌的帶玻璃珠的三角瓶中充分搖勻，并用滅菌的脫脂棉過濾以除去菌絲，稀釋成5×106個/mL孢子懸液。將上述菌懸液接種到種子培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至直徑為2 mm左右的菌絲球出現(xiàn)，并按照10%的接種體積分數(shù)接種至5 L發(fā)酵罐發(fā)酵48 h。

1.3.2 發(fā)酵過程中pH的測定 測定滅菌后PDB培養(yǎng)基的pH，并在發(fā)酵過程中每隔6 h取樣15 mL，測定發(fā)酵液中pH值，記錄發(fā)酵過程中的pH值的變化。

1.3.3 發(fā)酵過程中蛋白質質量分數(shù)的測定 測定滅菌后PDB培養(yǎng)基的蛋白質質量分數(shù)，并在發(fā)酵過程中每隔6 h取樣15 mL，考馬斯亮藍法測定發(fā)酵液中蛋白質質量分數(shù)，記錄比較發(fā)酵過程中的蛋白質質量分數(shù)的變化。

1.3.4 發(fā)酵過程中酸性蛋白酶活性的測定 測定滅菌后PDB培養(yǎng)基的酸性蛋白酶活性，并在發(fā)酵過程中每隔6 h取樣15 mL，根據(jù)GB/T23527-2009測定發(fā)酵液中酸性蛋白酶活性，記錄比較發(fā)酵過程中的酸性蛋白酶活性的變化。蛋白酶活性（活力）為1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，即為1個酶活力單位，以U/mL表示。

1.3.5 新型黑曲霉FS-UV1在模擬腸道中對AFB1的脫除效果 準確稱取KH2PO4（6.805 g）NaOH（0.896 g）溶解于1 L去離子水中，并調節(jié)pH為7±0.2[11]。取10 mL pH（7±0.2）的腸道模擬液，向其中加入等體積的新型黑曲霉FS-UV1 48 h發(fā)酵液，然后加入AFB1標準液使其終質量濃度為8.0 μg/mL，測定不同降解時間新型黑曲霉FS-UV1對AFB1的脫除率。

1.3.6 新型黑曲霉FS-UV1脫除機制研究 向無菌試管中分別加入方法1.3.1制備的孢子懸液9 mL，之后向試管中加入1 mL AFB1使其終質量分數(shù)為0.5 μg/g，混勻后于30℃、150 r/min避光反應48 h，測定AFB1脫除率。取發(fā)酵48 h的發(fā)酵液紗布過濾后獲得菌絲體，并將其分為以下兩組：121℃處理20 min和未做處理。兩組的菌絲體于無菌試管中，各加入10 mL生理鹽水-AFB1（終濃度為0.5 μg/g）溶液懸浮起來，搖勻后于30℃、150 r/min避光反應48 h，測定AFB1的脫除率。將上述過濾獲得的發(fā)酵液并將其分為以下兩組：硫酸銨沉淀處理和未處理組；加入AFB1（質量分數(shù)為0.5 μg/g）混勻后于30℃、150 r/min避光反應48 h，測定AFB1脫除率[5]。

1.3.7 AFB1的提取與測定 吸取1 mL濾液，用3倍體積的氯仿提取濾液中AFB1，靜置分層，收集氯仿層，氮氣吹干，加入100 μL三氟乙酸和200 μL正己烷，混勻后于40℃避光反應15 min，再次氮氣吹干，1 mL流動相（乙腈∶水=20∶80）溶解AFB1的衍生物，0.22 μm膜過濾，保存于棕色瓶，待測。高效液相色譜檢測條件參考文獻[12]測定[12]。

2 結果與分析

2.1 新型黑曲霉FS-UV1的液體發(fā)酵過程中pH的變化

新型黑曲霉FS-UV1在PDB培養(yǎng)基發(fā)酵過程中pH的變化見圖1。pH由初始培養(yǎng)基中的pH 5.9下降為1.83并趨于平衡。發(fā)酵過程中pH值的變化是微生物代謝反應的綜合結果，pH與培養(yǎng)基的組成及微生物的代謝途徑均有著密切的關系。pH的下降可能是由菌體對培養(yǎng)基中糖的利用并產(chǎn)生有機酸造成的；而在發(fā)酵后期菌體發(fā)生自溶pH會隨之下降，與此同時菌體蛋白酶的活躍致使pH值又呈上升趨勢，二者綜合作用致使總的pH值沒有發(fā)生明顯的變化并趨于平衡[13]。

2.2 新型黑曲霉FS-UV1的液體發(fā)酵過程中蛋白質質量濃度的變化

圖2中顯示了新型黑曲霉FS-UV1在PDB培養(yǎng)基發(fā)酵過程中蛋白質質量濃度的變化。發(fā)酵液中的蛋白質質量濃度在48 h時達到最大，為10.07 g/L，之后蛋白質質量濃度呈現(xiàn)下降趨勢并在72 h趨于平衡[14-15]。蛋白質質量濃度變化與脫除率的關系見圖2?？梢钥闯?，當?shù)鞍踪|質量濃度達到最高時，脫除率也達到最大，可知蛋白質與脫除率密切相關。

圖1 新型黑曲霉FS-UV1在PDB培養(yǎng)基發(fā)酵過程中pH的變化Fig.1 pH change during the permentation of the new Aspergillus niger FS-UV1 in PDB medium

圖2 新型黑曲霉FS-UV1在PDB培養(yǎng)基發(fā)酵過程中蛋白質質量濃度變化及對AFB1的脫除效果Fig.2 Protein content change and AFB1removal effect during the permentation of the new Aspergillus niger FS-UV1 in PDB medium

2.3 新型黑曲霉FS-UV1的液體發(fā)酵過程中酸性蛋白酶活性的變化

圖3所示為新型黑曲霉FS-UV1在PDB培養(yǎng)基發(fā)酵過程中酸性蛋白酶活性的變化。酸性蛋白酶活性在72 h時達到最大，為0.98 U/mL，并在144 h趨于平衡。

2.4 新型黑曲霉FS-UV1在模擬腸道中對AFB1的脫除效果

結果表明：新型黑曲霉FS-UV1在PDB培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后，對AFB1的脫除效果見圖4。新型黑曲霉FS-UV1對AFB1的脫除率隨時間的延長而升高，并在48 h達到87.3%，見圖4。

圖3 新型黑曲霉FS-UV1在PDB培養(yǎng)基發(fā)酵過程中酸性蛋白酶活性的變化Fig.3 Acid protease activity change during the permentation of the new Aspergillus niger FSUV1 in PDB medium

圖4 新型黑曲霉FS-UV1在模擬腸道中不同降解時間對AFB1的脫除效果Fig.4 AFB1removal effect of the new Aspergillus niger FS-UV1 by different times in simulated intestinal tract

2.5 新型黑曲霉FS-UV1對AFB1脫除機制研究

為了研究FS-UV1對AFB1的脫毒作用機制，分別對孢子懸液、菌絲體、發(fā)酵液對AFB1的脫毒作用進行了研究[16-17]，結果見圖5。其中孢子懸液對AFB1幾乎沒有脫除作用，而菌絲體及發(fā)酵液可有效的脫除AFB1，脫除率分別達到20.01%、50.1%；而在熱處理前后菌絲體對AFB1的脫除能力未發(fā)生顯著變化，說明菌絲體是通過物理吸附達到對AFB1的脫除，而發(fā)酵液在經(jīng)過硫酸銨沉淀后對AFB1的脫除能力發(fā)生了顯著性變化，由50.1%下降到10.9%，說明發(fā)酵液中發(fā)揮脫毒作用的很可能是蛋白質。

圖5 新型黑曲霉FS-UV1孢子、發(fā)酵液及菌絲體對AFB1的脫毒效果比較Fig.5 Comparision of AFB1 removal effectt by the new Aspergillus niger FS-UV1 spore，fermentation broth and mycelium

3 結語

1）在發(fā)酵過程中，pH值不斷下降，由初始pH 5.9下降為1.83。 蛋白質質量濃度在發(fā)酵48 h達到最大，為10.07 g/L；而酸性蛋白酶活性則在72 h達到最高，為0.98 U/mL。新型黑曲霉FS-UV1發(fā)酵過程中pH、蛋白質量濃度及酸性蛋白酶活性的變化對后期研究提取發(fā)酵液中胞外酶的條件提供了參考數(shù)據(jù)。

2）脫除時間為48 h時，在pH 7的模擬腸道環(huán)境中對AFB1的脫除率為87.3%。

3）FS-UV1孢子懸液對AFB1無脫除效果，而菌絲體對AFB1具有吸附作用，發(fā)酵液則對AFB1具有降解作用，其中發(fā)揮降解作用的可能是蛋白質。

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AFB1Decontamination and Fermentation
of the Novel Aspergillus niger FS-UV1

ZHANG Xiaoxue1， SUN Xiulan*1， ZHANG Yinzhi2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2．State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In this paper，the changes in pH，protein，protease activity and the degradation mechanism of the new Aspergillus Niger FS-UV1 which was induced by ultraviolet irradiation in potato glucose liquid medium （PDB）were studied.It is found that the pH value is declining in fermentation process，which dropped from the initial 5.9 to 1.83.The protein content showed the maximum of 10.07 g/L at 48 h，and protein activity reached the highest at 72 h with 0.98 U/mL.The experimental results showed that AFB1could be decontaminated by mycelium and culture filtrate，and the spores had effect on AFB1.In addition，F(xiàn)S-UV1 degraded aflatoxin B1（AFB1）effect was evaluated in simulation intestinal environment of pH=7 and the degradation rate was 87.3%.

novel Aspergillus niger，ultraviolet irradiation，AFB1，biodegradation

TS 201.3

A

1673—1689（2017）03—0266—05

2015-03-02

國家973計劃項目（2012CB720804）。

*通信作者：孫秀蘭（1976—），女，山東聊城人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品安全監(jiān)測方面的研究。

Email：sxlzzz@jiangnan.edu.cn

張曉雪，孫秀蘭，張銀志.新型黑曲霉液體發(fā)酵及對黃曲霉毒素B1的脫除[J].食品與生物技術學報，2017，36（03）：266-270.