王偉高， 陳 堅，3， 周景文*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫214122）

賴氨酸芽孢桿菌產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

王偉高1，2， 陳 堅1，2，3， 周景文*1，2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫214122）

氨基甲酸乙酯是發(fā)酵酒精飲料及發(fā)酵食品中一種廣泛存在的致癌物，酶法降解是解決氨基甲酸乙酯污染的重要途徑之一。作者以一株來源于小鼠胃部具有水解氨基甲酸乙酯活性的菌株Lysinibacillus fusiformis SC02為出發(fā)菌株，通過搖瓶水平單因素實驗對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為：半乳糖25 g/L，大豆蛋白胨20 g/L，尿素4 g/L，硫酸銅0.02 g/L，pH 6.0。最佳產(chǎn)酶的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度37℃，接種體積分?jǐn)?shù)3%，裝液量20 mL/250 mL。在上述優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，產(chǎn)酶水平由900 U/L提高到4 500 U/L，提高了350%。在3 L發(fā)酵罐水平上初步探究了不同攪拌轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶的影響。當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速達(dá)到800 r/min，菌株最高酶活水平由4 500 U/L提高到7 066 U/L，提高了57%。

氨基甲酸乙酯水解酶；發(fā)酵條件優(yōu)化；芽孢桿菌；發(fā)酵食品

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是一種2A級致癌物[1-2]，在黃酒等酒精飲料及醬油等發(fā)酵食品中廣泛存在[3-8]。氨基甲酸乙酯主要是在食品的發(fā)酵和長期儲存過程中自發(fā)產(chǎn)生[9-10]。

目前對氨基甲酸乙酯的控制策略一般有物理法、化學(xué)法和生物法三種，其中物理法容易造成風(fēng)味物質(zhì)的損失，化學(xué)法容易造成環(huán)境污染和食品安全問題[11]。生物法主要分為對生產(chǎn)菌株的代謝改造、酶法降解其前體物質(zhì)及酶法直接降解氨基甲酸乙酯[11]。關(guān)于酶法降解目前的研究主要集中在利用酸性脲酶[10，12]降解氨基甲酸乙酯前體物尿素。然而氨基甲酸乙酯化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，一旦形成很難消除，因此酶法降解氨基甲酸乙酯對于解決發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯所造成的食品安全問題具有十分重要的意義[13]。目前針對氨基甲酸乙酯水解酶的報道大部分集中在對其產(chǎn)酶菌株的篩選[14-18]，僅有少量關(guān)于來自粘質(zhì)紅酵母的氨基甲酸乙酯水解酶的優(yōu)化報道[19]。

作者針對前期實驗室從小鼠胃腸道分離得到菌株Lysinibacillus fusiformis SC02，從發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件等方面考察這些因素對該菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的影響，以獲得該菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 菌種與材料

1.1.1 菌種 作者所在研究室保藏的賴氨酸芽孢桿菌SC02，-80℃甘油管保藏。

1.1.2 主要試劑 半乳糖、硫酸銅、尿素、大豆蛋白胨等：均為國產(chǎn)分析純，購自國藥有限公司；酵母粉、蛋白胨等：購自O(shè)XOID公司；其他試劑：均為分析純，購自國藥有限公司。

1.1.3 主要設(shè)備與儀器 H-B1-420BS電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；DGX9053B-1電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；DKI-Ⅱ恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床：上海杜科自動化設(shè)備有限公司；UVmini-1240紫外可見分光光度計：Shimadzu公司；DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽：上海一恒科技有限公司；5840 R型高速低溫離心機(jī)：Eppendorf公司；EL204電子天平：Mettler Toledo公司；3 L發(fā)酵罐：New Brunswick Scientific Co.，NJ，USA。

1.1.4 培養(yǎng)基

1）活化培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂2.5 g/dL。

2）種子培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L。

3）發(fā)酵初始培養(yǎng)基：蛋白胨 16 g/L，NaCl 5 g/L，酵母提取物10 g/L。

1.1.5 顯色試劑

1）顯色劑Ⅰ：稱取15 g苯酚和0.625 g亞硝基鐵氰化鈉，用超純水定容至250 mL。

2）顯色劑Ⅱ：稱取13.125 g NaOH和7.5 mL NaClO，用超純水定容至250 mL。

3）終止劑：稱取10 g三氯乙酸，用超純水定容至100 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 將用甘油保存的菌株接種于活化培養(yǎng)基上，劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基條件為裝液量20 mL/250 mL，溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時間12 h。

1.2.2 搖床發(fā)酵培養(yǎng) 將種子培養(yǎng)基中的菌液以1%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為裝液量20 mL/250 mL，溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時間15 h。

1.2.3 Berthelot reaction比色法測定氨基甲酸乙酯水解酶酶活 取酶液1 mL，加入1 mL 3%EC溶液，37℃反應(yīng)30 min，再加入1 mL終止劑，混勻后加入1 mL的顯色劑Ⅰ和1 mL顯色劑Ⅱ，強(qiáng)烈振蕩，37℃保溫20 min后取出，用超純水稀釋到10 mL，625 nm處比色，并記錄OD值，根據(jù)銨離子標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活[20]?？瞻讓φ諡橄燃臃磻?yīng)終止劑，再加反應(yīng)底物。酶活單位（U）：在常壓、37℃、pH7.0條件下，每分鐘分解EC產(chǎn)生1μmol氨為一個酶活力單位（U）。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 對碳源、氮源、金屬離子Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Mg2+、Ni2+等培養(yǎng)基成分進(jìn)行設(shè)計培養(yǎng)，15 h取樣測定氨基甲酸乙酯水解酶活力。

1.2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化 選用溫度、pH、接種體積分?jǐn)?shù)和裝液量等發(fā)酵條件進(jìn)行設(shè)計，研究其對該芽孢桿菌產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶活力的影響。

1.2.6 添加底物對產(chǎn)酶的影響 在培養(yǎng)基中添加不同濃度的氨基甲酸乙酯，研究其對該菌產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶水平優(yōu)化

2.1.1 最適碳源及最佳添加量 分別選用乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘油7種碳源作為惟一碳源，添加到發(fā)酵初始培養(yǎng)基中，使每種碳源的碳質(zhì)量濃度都為8 g/L，考察其對氨基甲酸乙酯水解酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖1?？梢钥闯觯谙嗤荚刺砑恿康那闆r下，最佳碳源為半乳糖，產(chǎn)酶活力為1 068 U/L；以半乳糖為最佳碳源，考察不同質(zhì)量濃度半乳糖對酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖2。最佳質(zhì)量濃度為25 g/L，產(chǎn)酶活力為1 200 U/L。

圖1 不同碳源對菌體產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effects of various carbon sources on urethanase production

圖2 半乳糖質(zhì)量濃度對菌體產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of different galactose addition on urethanase production

2.1.2 最適氮源及最佳添加量 在最佳碳源的基礎(chǔ)上，選用氯化銨、硫酸銨、尿素、大豆蛋白胨、酵母粉、蛋白胨、玉米漿，分別以3 g/L的含氮質(zhì)量濃度替換初始培養(yǎng)基中的蛋白胨，考察它們對產(chǎn)酶的影響。從圖3可以看出，以大豆蛋白胨為氮源的酶活最高，尿素僅次于大豆蛋白胨。因而選擇大豆蛋白胨為有機(jī)氮源，以尿素為無機(jī)氮源，分別研究大豆蛋白胨的最適質(zhì)量濃度以及尿素的最適質(zhì)量濃度，結(jié)果見圖4-5。可以看出，大豆蛋白胨的最佳質(zhì)量濃度為20 g/L，尿素最佳質(zhì)量濃度為4 g/L，產(chǎn)酶活力提高至2 000 U/L。

圖3 不同氮源對菌體產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of various nitrogen sources on urethanase production

圖4 不同大豆蛋白胨添加量對菌體產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of different soy peptone addition on urethanase production

圖5 尿素質(zhì)量濃度對菌體產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of different urea concentration on urethanase production

2.1.3 金屬離子的優(yōu)化 選用8種常見金屬離子Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Mg2+、Ni2+，考察了不同質(zhì)量濃度金屬離子對賴氨酸芽孢桿菌產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的影響，結(jié)果見表1。不同質(zhì)量濃度和種類的金屬離子對產(chǎn)酶有不同影響，其中Ni2+、Fe3+、Cu2+對酶活提高較明顯。選擇此三種金屬離子，探究其最佳質(zhì)量濃度，比較各自最佳質(zhì)量濃度下單獨和同時添加對酶活力的影響，結(jié)果見圖6?？梢钥闯?，單獨添加Cu2+至終質(zhì)量濃度為0.02 g/L時，酶活提高至4 534 U/L，而同時添加三種離子的酶產(chǎn)量低于單獨添加銅離子的產(chǎn)量，因而選擇銅離子質(zhì)量濃度為0.02 g/L。

表1 8種金屬離子不同濃度對酶活的影響Table1 Effects of different concentration of eight metal ions on urethanase production 酶活（U/L）

圖6 不同金屬離子添加對菌體產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of addition of different metal ions on urethanase production

2.1.4 發(fā)酵溫度優(yōu)化 選擇28、30、37、40℃研究發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響。結(jié)果見圖7。當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時，酶活力最高，菌體生長最好。

圖7 不同溫度對菌體產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of different temperatures on urethanase production

2.1.5 初始 pH優(yōu)化 選擇初始 pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0研究對Lysinibacillus fusiformis SC02產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖8。可知最佳初始pH為6.0。pH過高或過低酶活都下降，其原因可能為該芽孢桿菌表達(dá)氨基甲酸乙酯水解酶需要在弱酸的環(huán)境下進(jìn)行，pH過低或過高都不利于該酶的表達(dá)。

圖8 不同初始pH對菌體產(chǎn)酶的影響Fig.8 EffectsofvariousinitialpH on urethanase production

2.1.6 接種體積分?jǐn)?shù)優(yōu)化 選取1%、3%、5%、7%和9%5個接種體積分?jǐn)?shù)。研究對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖9?？梢钥闯觯?dāng)接種體積分?jǐn)?shù)為3%時，酶活力達(dá)到最高值。

2.1.7 裝液量優(yōu)化 選擇20、30、40 mL三個裝液量研究對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖10。可以看出，最佳裝液量為20 mL/250 mL，此時最高酶活為4 500 U/L。隨著裝液量的增加，酶活急劇下降。

2.2 發(fā)酵罐水平轉(zhuǎn)速優(yōu)化

選擇400、600、800、1 000 r/min 4個發(fā)酵轉(zhuǎn)速來研究其對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖11。4種轉(zhuǎn)速條件下產(chǎn)酶趨勢相同，然而當(dāng)轉(zhuǎn)速從400 r/min增加到600 r/min時，最高酶活出現(xiàn)時間由10 h縮短為8 h，提前了2 h。當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速增加至800 r/min時，最高酶活達(dá)到7 000 U/L，最高酶活隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加又降低至5 000 U/L，說明過高的攪拌轉(zhuǎn)速不利于菌體產(chǎn)酶。

圖9 不同接種體積分?jǐn)?shù)對菌體產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effects of various inoculum volume on urethanase production

圖10 不同裝液量對菌體產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effects of various liquid volume in flask on urethanase production

從菌體干質(zhì)量曲線可以看出，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速控制在400 r/min時，菌體干質(zhì)量為7 g/L，然而當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速增加至1 000 r/min時，菌體干質(zhì)量降低至6.25 g/ L，這說明剪切力較高的確不利于菌體生長。

從殘?zhí)乔€可以看出，從接種后開始2 h內(nèi)，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度下降較大，這是由于菌體生長需要消耗碳源提供能量。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至第6小時后，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定，這說明菌體不再利用碳源。對比各批次殘?zhí)乔€可以看出，發(fā)酵結(jié)束后的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度隨著轉(zhuǎn)速的增加而降低，當(dāng)轉(zhuǎn)速增加至1 000 r/min時，發(fā)酵結(jié)束后的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度降低至18 g/L，然而此時菌體干質(zhì)量卻最低，說明耗掉的葡萄糖并沒有完全用于菌體生長，原因可能是較高的轉(zhuǎn)速可能引起還原糖的氧化。

對比各批次產(chǎn)酶曲線和殘?zhí)乔€發(fā)現(xiàn)，葡萄糖的利用效果較差，整個發(fā)酵過程糖耗不足10 g/L。葡萄糖質(zhì)量濃度過高會增加培養(yǎng)基的滲透壓，不利于菌體生長，因此可以嘗試降低發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度。

對比各個批次發(fā)酵過程的pH變化曲線和產(chǎn)酶曲線可以看出，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，發(fā)酵液的pH逐漸增加。在發(fā)酵的前6小時，發(fā)酵液的pH從6.5急劇增加至9.0。原因是該過程菌體產(chǎn)酶需要消耗大量的氮源，從而導(dǎo)致pH增加。當(dāng)發(fā)酵液pH在7～8.5之間時，菌體生長和產(chǎn)酶急劇上升。因此，下一步可以嘗試在pH 7～8.5選擇最適pH，通過控制恒定pH的方法來促進(jìn)菌體生長產(chǎn)酶。

對比各批次溶解氧變化曲線和產(chǎn)酶曲線可以看出，在接種后的4 h內(nèi)，溶解氧急劇下降，此時是因為菌體生長需要消耗掉過多的氧氣。隨著發(fā)酵時間的延長，溶解氧在第四個小時之后呈現(xiàn)反彈趨勢，這說明菌體耗氧速率逐漸降低。當(dāng)酶活達(dá)到最高時，溶解氧濃度趨于100%，說明此時菌體停止生長。對比各批次溶解氧曲線可以發(fā)現(xiàn)，隨著溶解氧的增加，產(chǎn)酶速率和最高酶活都呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)轉(zhuǎn)速增加至1 000 r/min時，最低溶解氧濃度為80%，此時菌體的最高酶活僅為5 000 U/L，這說明過高的溶解氧對菌體生長不利。因此，下一步可以嘗試將溶解氧濃度控制在80%以下來探究溶解氧濃度對菌體生長的影響，選擇最適溶解氧濃度。

圖11 不同攪拌轉(zhuǎn)速對菌體產(chǎn)酶的影響Fig.11 Different agitation speeds on urethanase production

3 結(jié)語

通過單因素優(yōu)化實驗對賴氨酸芽孢桿菌產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，半乳糖 25 g/L，大豆蛋白胨 20 g/L，尿素4 g/L。 CuSO40.02 g/L，初始pH 6.0。培養(yǎng)條件：37℃，接種體積分?jǐn)?shù)3%，裝液量20 mL/250 mL。與原始培養(yǎng)條件下酶活力900 U/L相比，酶活提高了350%。通過在3 L發(fā)酵罐水平探究不同轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)轉(zhuǎn)速控制在800 r/min時，發(fā)酵10 h酶活由4 500 U/L提高到7 066 U/L，提高了57%。

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Optimization of the Fermentation Conditions for Producing Urethanase by Lysinibacillus fusiformis

WANG Weigao1，2， CHEN Jian1，2，3， ZHOU Jingwen*1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Collaborative Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.National Engineering Laboratory of Grain Fermentation Process and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Ethyl carbamate （EC）is a potential carcinogen which widely exists in alcohol beverage and fermented food.Enzyme degradation is one of the important routes to deal with the EC contamination.In this study，a bacteria Lysinibacillus fusiformis SC02 which was able to degrade EC was isolated from mice stomach as the starting strain.The condition of enzyme production was optimized by using single-factor test.The optimal fermentation medium components were asfollows：galactose 25 g/L，soy peptone 20 g/L，urea 4 g/L，CuSO40.02 g/L，initial pH 6.0.The optimal conditions for enzyme-producing were as below：temperature 37℃，inoculum volume 3%and liquid volume in flask 20 mL/250 mL.Urethanase production level of the strain was improved from 900 U/L to 4 500 U/L after being cultured for 15 h under the conditions mentioned above，which was 350%higher than the one under the original conditions.After investigating the influences of different agitation speeds on the urethanase production at the fermentation tank level，800 r/min was chosen as the optimal agitation speed，and the urethanase activity can reach to 7066 U/L at this speed，which was 57%higher than before.

ethyl carbamate，single-factor optimization，Bacillus，fermented food

Q 814

A

1673—1689（2017）03—0259—07

2015-01-20

國家973計劃項目（2012CB720802）。

*通信作者：周景文（1982—），男，安徽巢湖人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事利用微生物生產(chǎn)植物來源天然產(chǎn)物的代謝工程和合成生物學(xué)方面的研究。E-mail：zhoujw1982@jiangnan.edu.cn

王偉高，陳堅，周景文.賴氨酸芽孢桿菌產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（03）：259-265.