唐 清， 劉 楓， 周 蓓， 楊嚴俊， 蘇宇杰*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫214122；3.江蘇康德蛋業(yè)有限公司，江蘇 南通226600）

熱處理對卵轉(zhuǎn)鐵蛋白抑菌效果的影響

唐 清1，2， 劉 楓1，2， 周 蓓3， 楊嚴俊1，2， 蘇宇杰*1，2

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫214122；3.江蘇康德蛋業(yè)有限公司，江蘇 南通226600）

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（OVT）是一種具有結(jié)合鐵能力的球蛋白,具有廣譜的抗菌功能,其抑菌活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。作者研究熱處理對卵轉(zhuǎn)鐵蛋白抑菌效果的影響,并通過對其二級結(jié)構(gòu)和疏水作用的分析來揭示其抑菌效果的變化機理。結(jié)果表明:隨著處理溫度的升高,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果呈降低趨勢;熱處理后卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)和疏水作用都發(fā)生了變化,隨著處理溫度的升高以及處理時間的延長，α-螺旋含量呈降低趨勢,β-折疊含量呈升高趨勢,表面疏水性明顯增大,而熱處理時間則與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)與活性無明顯關(guān)聯(lián)。

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白;熱處理;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);抑菌效果

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（OVT）是雞蛋清中一種易溶的非結(jié)晶蛋白質(zhì)分子，有兩個球狀葉瓣結(jié)構(gòu)：N端瓣和C端瓣，并由一條α-螺旋的短肽連接。每一個瓣的肽鏈又纏繞成兩個小區(qū)段（N1，N2和C1，C2），且每瓣的兩個子區(qū)域通過兩條反平行的β鏈連接，鐵結(jié)合部位即位于兩區(qū)段間的溝中[1]。每個蛋白質(zhì)分子可以可逆地結(jié)合兩個 Fe3＋，同時結(jié)合兩個 CO32-或HCO3-，使得整個OVT分子結(jié)構(gòu)變得更加封閉、緊密，從而更加穩(wěn)定。

OVT的抑菌活性在第一次被提純時即被證實，其抑菌機理主要為“鐵剝奪”機制，即OVT對鐵離子具有較強的親和性，而鐵又是微生物生長繁殖必需的生長因子，OVT螯合了微生物生長必需的鐵離子，從而達到抑制細菌生長的效果[2]。這種“鐵剝奪”機制使得OVT具有廣譜的抑菌功能[3]。但是不同菌種對該機制的敏感性不同，其中最敏感的是大腸桿菌等，抗性較強的為金黃色葡萄球菌等[4]。

OVT作為一種天然的抑菌劑和防腐劑[5]，應(yīng)用前景非常廣闊，但它對溫度極為敏感，食品加工中常見的熱加工會對其結(jié)構(gòu)性質(zhì)造成一定的影響。詳細系統(tǒng)地研究熱加工處理后的OVT結(jié)構(gòu)與抗菌性之間的變化關(guān)系可以為OVT的深加工提供理論依據(jù)，同時對深化蛋品加工、提高蛋品產(chǎn)業(yè)效益有重要的意義。作者通過熒光光譜、拉曼光譜等方法研究了熱處理后OVT結(jié)構(gòu)的變化，并進一步分析研究了結(jié)構(gòu)變化對其抑菌活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料 培養(yǎng)皿、無菌移液管、牛津杯（內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm）、鑷子、接種環(huán)、無菌水、OVT：作者所在實驗室自制;大腸桿菌（Escherichia coli），沙門氏菌（Salmonella）：江南大學(xué)食品學(xué)院食品生物技術(shù)中心提供。

1.1.2 固體LB培養(yǎng)基 水20 mL，牛肉膏1 g，蛋白胨2 g，氯化鈉1 g，瓊脂4 g。調(diào)節(jié)pH至7.4，121℃下滅菌20 min。

1.1.3 液體LB培養(yǎng)基 水20 mL，牛肉膏0.2 g，蛋白胨0.4 g，氯化鈉0.2 g。調(diào)節(jié)pH至7.4～7.6，121℃下滅菌20 min。

1.1.4 儀器 YX280A型手提式不銹鋼蒸汽消毒器：上海三申醫(yī)療機械有限公司;F-7000熒光光譜儀：日本HITACHI公司;LabRAMHR Evolution拉曼光譜儀：法國 HORIBA Jobin Yvon S.A.S.公司; JobinSW-CJ-1FD型超凈工作臺：蘇州安泰生物技術(shù)有限公司;SP-250A型生化培養(yǎng)箱：南京實驗儀器廠;游標卡尺：哈爾濱量具刃具集團有限責任公司; FE-20型實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的熱處理 將純化的OVT稀釋至0.2 mg/mL，裝在密封的玻璃管中，分別于65、75、85、95℃進行水浴加熱處理，分別在5、15、30、45 min取樣，并迅速置于冰水浴中冷卻備用。

1.2.2 菌種活化與培養(yǎng)

1）菌種活化：取凍干菌種沙門氏菌和大腸桿菌。無菌條件下，在固體LB培養(yǎng)基平板上劃線接種，置于37℃恒溫培養(yǎng)16 h。

2）制備菌懸液：經(jīng)活化的大腸桿菌和沙門氏菌在無菌條件下接種，挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中，在37℃下恒溫振蕩培養(yǎng)16 h，將得到的菌液稀釋備用。

1.2.3 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白抑菌效果的研究 采用牛津杯法分析檢測OVT的抑菌效果[6]，在無菌操作下取0.1 mL菌液均勻涂布于冷卻的固體培養(yǎng)基上，然后用無菌鑷子將滅過菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，每一培養(yǎng)皿置入3個牛津杯，在牛津杯中分別加入0.2 mL不同方式處理后的OVT和無菌水，注意不要讓樣品溢出牛津杯外，然后小心將培養(yǎng)皿移入37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后測量各抑菌圈直徑作為抑菌效果的指標。

1.2.4 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)的研究

1）卵轉(zhuǎn)鐵蛋白表面疏水性分析：OVT表面疏水性的變化采用Takagil報道的熒光探針法檢測[7]。將處理后的蛋白質(zhì)樣品溶于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中得到質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，加入 5 μmol/L的8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS）溶液20 μL，混勻，室溫反應(yīng)3 h，測其熒光強度（激發(fā)波長395 nm，發(fā)射波長467 nm）。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)[8]。

2）卵轉(zhuǎn)鐵蛋白拉曼光譜分析：用拉曼光譜儀測定OVT的拉曼光譜，激發(fā)源為He-Ne激光（632.8nm），到達樣品表面的功率小于10 mW。每個樣品在400～1 800 cm-1的范圍內(nèi)重復(fù)掃描3次，儀器自動累積計算其平均值。使用OMINC軟件進行去卷積、Peakfit軟件進行曲線擬合和蛋白質(zhì)各二級結(jié)構(gòu)含量的計算[9]。以表1中各二級結(jié)構(gòu)的峰值為基準進行分析。

表1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白各二級結(jié)構(gòu)的峰值Table 1 Peak Value of secondary structure of OVT

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對抑菌效果的影響

抑菌效果用抑菌圈法[10]測定。圖1表示經(jīng)熱處理后OVT分別對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果。比較圖1(a)和(b)可以看出，經(jīng)過熱處理的OVT對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果變化趨勢類似，抑菌效果均隨著加熱溫度的升高和加熱時間的延長而逐漸降低。通過對比發(fā)現(xiàn)，在65、75℃抑菌效果隨處理時間延長呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，而在85、95℃下抑菌效果的下降速度趨于平緩，這一結(jié)果和OVT的分子結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系。OVT分子的鐵結(jié)合部位位于N端瓣和C端瓣的兩區(qū)段間的溝中，鐵原子深藏于分子中，這個溝可以在結(jié)合和釋放Fe3＋時發(fā)生構(gòu)象變化[11]。而OVT受熱易變性，在熱處理后其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，兩區(qū)段間的溝結(jié)構(gòu)開始展開，使得其結(jié)合鐵離子的能力降低。由于OVT的抑菌機理主要為“鐵剝奪”機制，所以隨著結(jié)構(gòu)的改變，溝結(jié)構(gòu)的展開，抑菌效果降低。由圖1的結(jié)果可以推斷，在65、75℃時蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)開始發(fā)生變化，隨著處理時間延長結(jié)構(gòu)變化程度更明顯，抑菌效果呈明顯下降趨勢，而在85、95℃下卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生徹底變性，所以隨著處理時間的延長，其抑菌效果的變化并不明顯。這與袁小軍的結(jié)果存在差異，其研究結(jié)果為OVT在65～75℃熱處理后對抑制沙門氏菌、大腸桿菌的能力沒有太大的影響，但OVT經(jīng)過75～85℃熱處理后，抑菌能力減少較明顯[10]。這可能是因為袁小軍用于抑菌的OVT溶液蛋白質(zhì)濃度較低，在熱處理后變性程度不明顯，最終導(dǎo)致與本研究結(jié)果存在差異。

圖1 熱處理后卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果Fig.1 Effect of heat treatment on antibacterial activity of OVT

2.2 熱處理對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 蛋白質(zhì)疏水作用的變化 由圖2可以看出，熱處理5 min時，OVT溶液在65、75℃時依然保持相對澄清，但是經(jīng)過85、95℃處理后蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，產(chǎn)生白色絮狀凝聚物。這是由于熱處理后蛋白質(zhì)的疏水性發(fā)生變化所導(dǎo)致的。

圖2 不同溫度下對卵轉(zhuǎn)鐵蛋白熱處理5 min的影響Fig.2 Effect of heat treatment on OVT at different temperatures after 5 minutes

蛋白質(zhì)中氨基酸殘基非極性側(cè)鏈之間的疏水相互作用是維持蛋白質(zhì)獨特三維結(jié)構(gòu)關(guān)鍵的作用力。熒光光譜法是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其構(gòu)象變化的重要手段之一[12]。ANS熒光探針法是評價蛋白質(zhì)表面疏水性的經(jīng)典方法，是水溶液中蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的一種反映。在一定范圍內(nèi)，熒光強度與蛋白質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。利用ANS的這個性質(zhì)，可以衡量ANS結(jié)合的蛋白質(zhì)部位極性的變化，根據(jù)極性的變化又可以進一步推測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。經(jīng)不同方式熱處理的OVT的表面疏水性見圖3。結(jié)果表明，在相同的處理時間下，表面疏水性隨著溫度的升高呈上升的趨勢。在65、75℃下，隨著處理時間的延長，OVT的表面疏水性有明顯的升高趨勢，在85、95℃下其表面疏水性雖也呈現(xiàn)上升趨勢，但變化幅度較小。由此推測：熱處理使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，使得OVT中本來隱藏的疏水基團暴露了出來，溫度越高，處理時間越長，結(jié)構(gòu)的展開程度也就越大，暴露的疏水性區(qū)域越多，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面疏水性增加。在65、75℃下OVT結(jié)構(gòu)開始變化，并且隨著結(jié)構(gòu)的展開，表面疏水性增大趨勢明顯，而在85、95℃下，OVT結(jié)構(gòu)的展開已趨于最大化，隨著處理時間的延長其結(jié)構(gòu)不再呈現(xiàn)大的變化趨勢，也就意味著其表面疏水性也不再有較大的變化。

圖3 熱處理對卵轉(zhuǎn)鐵蛋白表面疏水性的影響Fig.3 Effect of heat treatment on surface hydrophobicity

2.2.2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化 拉曼光譜是一種定性分析分子結(jié)構(gòu)的散射光譜，具有樣品濃度低、無需預(yù)處理、分析速度快、靈敏度高、結(jié)果客觀等特點，可以用于水溶液、晶體、膠體、粉末等[13]。拉曼光譜在生物大分子中主要用于鑒別蛋白質(zhì)及其組分的差異，由此可獲得側(cè)鏈微環(huán)境的化學(xué)信息以及多肽骨架構(gòu)型信息[9]。

OVT的6個二硫鍵主要被保存在C端瓣：兩個在N1區(qū)域，三個在2區(qū)域，一個在N2區(qū)域。從圖4可看出，經(jīng)不同溫度處理后，OVT中胱氨酸二硫鍵的特征峰發(fā)生了位移，波數(shù)由505 cm-1偏移至507 cm-1。據(jù)報道[14]，卵白蛋白經(jīng)過熱處理后，其二硫鍵的特征峰由504 cm-1偏移至507 cm-1。

1 003 cm-1處的苯丙氨酸的峰強度和位置與結(jié)構(gòu)對環(huán)境的變化并不敏感，因此可以作為標準，將峰強度進行歸一化。酰胺I與酰胺III經(jīng)常被用來說明蛋白質(zhì)組成和二級結(jié)構(gòu)，圖4中酰胺I與酰胺III鍵峰分別位于 1 660、1 248 cm-1。該結(jié)果與 Igor Chourpa[9]報道的酰胺I與酰胺III鍵峰分別位于1 650、1 250 cm-1的結(jié)果不同，這說明經(jīng)過熱處理后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

色氨酸殘基與蛋白的表面疏水作用密切關(guān)聯(lián)。蛋白質(zhì)經(jīng)熱處理后色氨酸殘基在757 cm-1處的特征峰強度減小，表明色氨酸所處的深藏在分子內(nèi)部的疏水微環(huán)境被展開[9]，疏水基團的暴露導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性增大。拉曼光譜的結(jié)果表明，提高處理溫度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水作用增大，這與通過熒光探針測得的蛋白質(zhì)表面疏水性的結(jié)果相一致。

蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基858、836 cm-1特征峰分別為酪氨酸內(nèi)折和展開的鍵峰。其比值（I858/I836）可反映酪氨酸微環(huán)境的變化及其存在狀態(tài)，還可以反映酪氨酸所在肽鏈的骨架結(jié)構(gòu)信息[15]。從圖4可看出，在858 cm-1處的光譜強度減小，836 cm-1處的光譜強度基本無變化，從而I858/I836值減小，這說明熱處理使得OVT中的酪氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了一定的變化。

圖4 不同溫度處理后卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的拉曼光譜Fig.4 Raman spectroscopy ofOVT atdifferent temperatures

表2為熱處理后OVT中各二級結(jié)構(gòu)的含量?？梢钥闯觯扒逯蠴VT的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成，且以β-折疊為主。表2結(jié)果表明，溫度升高導(dǎo)致α-螺旋明顯下降、β-折疊明顯上升，β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲含量稍微升高，但變化不顯著。變化的原因可能是熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)形成凝膠，使得α-螺旋結(jié)構(gòu)展開，含量呈降低趨勢;而后通過分子間暴露的疏水殘基相互作用形成了折疊結(jié)構(gòu)和其他的轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。而加熱時間對OVT各種二級結(jié)構(gòu)含量的影響沒有明顯的規(guī)律。

袁小軍[10]用圓二色譜法計算得出的OVT二級結(jié)構(gòu)的含量為：α-螺旋（27.2%）、β-折疊（49.7%）、β-轉(zhuǎn)角（7.7%）和無規(guī)則卷曲（15.3%），所占比例與本研究的結(jié)果存在著較大的差異。其原因可能有兩點：一是本研究采用的是拉曼光譜，用OMNIC軟件得出其二階導(dǎo)數(shù)曲線和傅立葉自去卷積 （FSD）曲線。而FSD曲線參數(shù)選擇應(yīng)以二階導(dǎo)數(shù)曲線和FSD曲線中的各子峰的峰位和峰寬基本吻合為原則。作者采用的參數(shù)為：峰寬24 cm-1，增強因子2.6。根據(jù)二階導(dǎo)數(shù)曲線選定各子峰的峰位和峰寬，再對所得曲線進行擬合，當確定了各子峰與相應(yīng)的對應(yīng)關(guān)系后，根據(jù)其積分面積計算各種二級結(jié)構(gòu)的相對百分含量。由于峰寬和增強因子是人為選定，所以可能存在較大誤差。二是由于本研究熱處理的最低溫度為65℃，研究已經(jīng)證實此溫度已使OVT發(fā)生部分變性，可能已有部分α-螺旋展開和轉(zhuǎn)化成其他的二級結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)的含量與袁小軍的結(jié)果存在差異。

表2 熱處理后卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中各二級結(jié)構(gòu)的含量Table 2 Contents of secondary structure of OVT after heat treatment

3 結(jié)語

作者研究了不同溫度及加熱時間的熱處理對OVT抑菌活性、表面疏水性和二級結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)論為：熱處理后的OVT對大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌效果均有所下降，并且隨著處理溫度的升高，其抑菌效果呈現(xiàn)明顯的降低趨勢。熱處理后OVT分子內(nèi)部的疏水基團暴露，蛋白質(zhì)表面疏水性增大，并且溫度越高，蛋白質(zhì)的表面疏水性越高，同時隨著時間的延長，蛋白質(zhì)的表面疏水性呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢;熱處理使得蛋白α-螺旋向β-折疊和其他二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，β-折疊呈上升趨勢，而熱處理時間與OVT的結(jié)構(gòu)與活性無明顯關(guān)聯(lián);蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開意味著蛋白結(jié)合Fe3+位點結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化導(dǎo)致結(jié)合Fe3+能力的下降，進而引起OVT抑菌活性的下降。

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Research on Antibacterial Activity of OVT under Heat Treatment

TANG Qing1，2， LIU Feng1，2， ZHOU Bei3， YANG Yanjun1，2， SU Yujie*1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122，China;2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214000214122，China；3.Jiangsu Kangde Egg Industry Co.Ltd.，Nantong 226600，China)

Ovotransferrin，an iron-binding globulin，had a broad spectrum of antibacterial activity. Its antibacterial activity was closely related with its structure.In this study，the impact of heat treatment on the structure and antibacterial activity of ovotransferrin was studied，and the change mechanism of the antibacterial effect was revealed through the analysis of its secondary structure and hydrophobic effect.Results showed that the antibacterial activity of ovotransferrin on Escherichia coli and Salmonella was decreased with the increase of treatment temperature.The structure of ovotransferrin got changed after the heat treatment，the contents of α-helix and random coil of ovotransferrin were decreased due to the high temperature，meanwhile the contents of β-sheet and the β-turn were increased.Besides，surface hydrophobicity of ovotransferrin was significantly increased.As processing time extension，the antibacterial activity of ovotransferrin had no significant change at the same temperature.

ovotransferrin，heat treatment，protein structure，antibacterial activity

TS 253.4

A

1673—1689（2017）03—0277—06

2015-02-03

國家863計劃項目（2013AA102207）。

*通信作者：蘇宇杰（1982—），男，山東臨沂人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事食品蛋白質(zhì)分離與性質(zhì)方面的研究。

E-mail：suyujie@jiangnan.edu.cn

唐清，劉楓，周蓓，等.熱處理對卵轉(zhuǎn)鐵蛋白抑菌效果的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（03）：277-282.