葉洪濤，薛瑞，許方敏，丁振春，鄧云，張有志

（1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南232000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100850）

·論著·

小鼠海馬糖原合成酶激酶3β 過表達(dá)對小補(bǔ)心湯總黃酮抗抑郁和抗焦慮作用的影響

葉洪濤1，2，薛瑞2，許方敏2，丁振春2，鄧云1，張有志2

（1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南232000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100850）

目的評價小鼠海馬糖原合成酶激酶3β（GSK3β）過表達(dá)對小補(bǔ)心湯總黃酮（XBXT-2）抗抑郁和抗焦慮作用的影響。方法小鼠海馬立體定位微注射包裝有GSK3β（S 9A）突變型基因的腺相關(guān)病毒（AAV）制備小鼠GSK3β過表達(dá)模型，3周后采用Western蛋白印跡法檢測GSK3β和磷酸化GSK3β（S9）〔p-GSK3β（S9）〕含量，采用開場實(shí)驗(yàn)檢測小鼠自發(fā)活動。而后將空載體AAV組和GSK3β過表達(dá)組小鼠各自分為給藥組和溶劑組，分別ig給予XBXT-2 100 mg·kg-1或同體積蒸餾水，每天1次，分別于給藥14和16 d采用懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測小鼠抑郁樣行為，18和20 d采用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和爬梯實(shí)驗(yàn)檢測小鼠焦慮樣行為。結(jié)果Western蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示，與AAV組相比，GSK3β過表達(dá)組小鼠海馬GSK3β含量顯著升高（P＜0.01），p-GSK3β（S9）含量無顯著性差異。在開場實(shí)驗(yàn)中，GSK3β過表達(dá)組與AAV組間小鼠跨格次數(shù)和站立次數(shù)無顯著差異。在小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，AAV+XBXT-2組與AAV組比較，小鼠不動時間顯著縮短（P＜0.05，P＜0.01）；GSK3β過表達(dá)+XBXT-2組與GSK3β過表達(dá)組比較，小鼠不動時間無明顯差異。在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，與AAV組比較，AAV+XBXT-2組小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂停留時間百分比顯著增加（P＜0.01，P＜0.05）；與GSK3β過表達(dá)組比較，GSK3β過表達(dá)+XBXT-2組小鼠上述行為指標(biāo)無明顯改變。在爬梯實(shí)驗(yàn)中，AAV+XBXT-2組比AAV組小鼠爬梯站立次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；GSK3β過表達(dá)+XBXT-2組與GSK3β過表達(dá)組比較，小鼠站立次數(shù)無明顯差異。結(jié)論海馬腦區(qū)GSK3β過表達(dá)可取消XBXT-2在小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的抗抑郁作用及在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和爬梯實(shí)驗(yàn)中的抗焦慮作用。

小補(bǔ)心湯；總黃酮；抑郁；焦慮；糖原合成酶激酶3β；腺相關(guān)病毒

抑郁癥和焦慮癥屬于中醫(yī)情志病范疇，中醫(yī)藥對其認(rèn)識和治療有著悠久的歷史。近年來，越來越多的臨床與基礎(chǔ)研究表明，中藥對抑郁癥和焦慮癥有很好的治療作用［1-2］。小補(bǔ)心湯（Xiaobuxin Tang，XBXT）出自南北朝時期陶弘景所著的敦煌莫高窟遺書《輔行決臟腑用藥法要》，由旋覆花、代赭石、淡竹葉和淡豆豉4味中藥組成。本課題組前期在國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，XBXT及其總黃酮提取物（XBXT-2）在多種抑郁模型上具有良好的抗抑郁活性，其作用機(jī)制與增強(qiáng)腦組織5-羥色胺（5-hydroxytrypta?mine，5-HT）神經(jīng)系統(tǒng)的功能、增強(qiáng)神經(jīng)營養(yǎng)、促進(jìn)神經(jīng)元再生和抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進(jìn)等作用有關(guān)［3-6］。

糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）是一種在進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，分為α和β亞型。GSK3是為數(shù)不多的磷酸化后功能失活的激酶［7］，GSK3α和GSK3β磷酸化位點(diǎn)分別為N端的21位和9位絲氨酸位點(diǎn)。GSK3不僅可以調(diào)節(jié)糖原合成酶的功能，還作用于眾多的信號蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活和凋亡［8］。20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)，鋰鹽的抗抑郁作用與抑制GSK3β的活性密切相關(guān)，從而開啟了GSK3β與精神疾病相關(guān)性的研究。近年來越來越多的研究表明，GSK3β在抑郁癥和焦慮癥的發(fā)生及治療中發(fā)揮重要的作用［9-10］。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，XBTX-2能夠增加慢性應(yīng)激大鼠海馬磷酸化GSK3β的水平。為此，本研究采用以腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）為載體的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過微注射在海馬部位導(dǎo)入GSK3β突變型基因〔GSK3β（S9A），即N端9位絲氨酸突變?yōu)楸彼帷?，該基因表達(dá)的突變型GSK3β在功能上與內(nèi)源性GSK3β一致，但無法磷酸化，造成GSK3β功能在海馬部位持續(xù)激活，進(jìn)而探討GSK3β是否是XBXT-2發(fā)揮抗抑郁和抗焦慮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性ICR小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～20 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXX（京）2016-0002。小鼠飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所動物行為實(shí)驗(yàn)中心，每籠6只群養(yǎng)，溫度22～24℃，光照時間7∶00-19∶00，自由進(jìn)食、飲水，手術(shù)前適應(yīng)飼養(yǎng)6 d。

1.2 藥品、試劑和儀器

XBXT-2由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所植物化學(xué)研究室提供，制備方法參照文獻(xiàn)［11-12］；含小鼠源GSK3β（S9A）突變型基因的AAV〔AAV-GSK 3β（S9A）〕以及AAV空載體由廈門安提海拉生物科技有限公司提供。AAV-GSK3β（S9A）是通過PCR釣取小鼠源GSK3β基因，構(gòu)建AAV載體pAAV-CMV-mGSK3β，再將其突變成S9A，最后轉(zhuǎn)染AAV293細(xì)胞包裝9型AAV，不含有GSK3β基因的空載體AAV作為陰性對照。病毒滴度為1.88×1017vp·L-1和1.67×1017vp·L-1。AAV自帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)簽。

兔抗GSK3β單克隆抗體和兔抗磷酸化GSK3β（S9）〔p-GSK3β（S9）〕單克隆抗體購自于美國Cell Signaling Technology公司；小鼠抗β肌動蛋白單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）均購自于北京中杉金橋公司；RIPA裂解液、磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑均購自于普利萊公司。立體定位儀和電動磨鉆購自于中國瑞沃德公司；微量注射泵購自于美國Hamilton公司；微注射控速泵購自于美國World Precision Instruments公司；蛋白電泳儀器購自于美國BioRad公司；熒光成像儀購自于美國LI-COR Biotechnology公司；冰凍切片機(jī)購自于德國Leica公司。

1.3 海馬齒狀回立體定位微注射

小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)6 d，體質(zhì)量達(dá)到26～27 g時進(jìn)行海馬齒狀回立體定位手術(shù)。小鼠經(jīng)水合氯醛（400 mg·kg-1，ip）麻醉后固定于腦立體定位儀，消毒并切開頭皮暴露顱骨，確定海馬注射位置（前囟后1.7 mm，左右旁開各1.8 mm，深度2.0 mm）。雙側(cè)海馬微量注射，每側(cè)注射體積為1 μL，注射速率為0.2 μL·min-1，留針5 min。術(shù)后將頭皮縫合。

1.4 熒光顯微鏡觀測病毒感染部位

為了確定病毒感染位置，預(yù)實(shí)驗(yàn)對6只小鼠海馬微注射AAV空載體，3周后用水合氯醛（400 mg·kg-1，ip）麻醉，用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行心臟灌流，取腦、梯度脫水、制作冰凍切片，切片厚度為30 μm，封片后立即于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光確認(rèn)病毒感染部位。

1.5 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測海馬GSK3β和p-GSK3β（S9）含量

為了確定基因轉(zhuǎn)染后目的蛋白表達(dá)情況，預(yù)實(shí)驗(yàn)對8只小鼠海馬微注射AAV空載體或AAVGSK3β（S9A），3周后處死，冰上分離雙側(cè)海馬，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，超聲破碎1 min，冰上靜置30 min后，12 000×g，4℃離心30 min，取上清液，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。上清液加入等體積的2×上樣緩沖液，放入沸水中變性5～10 min。將40 μg蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離及凝膠濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，經(jīng)5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h。按照說明書，加入一抗（1∶1000稀釋）4℃孵育過夜，而后加入二抗（1∶3000稀釋）室溫孵育1 h，放入顯影儀顯影，采用Gelpro軟件分析蛋白條帶，以GSK3β和p-GSK3β（S9）分別與內(nèi)參蛋白β肌動蛋白的積分吸光度比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 實(shí)驗(yàn)流程、分組與給藥

ICR小鼠48只，按體質(zhì)量均衡隨機(jī)分為2組，分別于海馬齒狀回立體定位微注射AAV空載體（AAV組）或AAV-GSK3β（S9A）（GSK3β過表達(dá)組）。術(shù)后恢復(fù)飼養(yǎng)3周，進(jìn)行開場實(shí)驗(yàn)。而后將2組小鼠進(jìn)一步隨機(jī)分成對照組與給藥組，分別ig給予XBXT-2 100 mg·kg-1或等體積蒸餾水，每天1次，于給藥14，16，18和20 d進(jìn)行懸尾、強(qiáng)迫游泳、高架十字迷宮和爬梯實(shí)驗(yàn)。

1.7 開場實(shí)驗(yàn)

微注射術(shù)后恢復(fù)飼養(yǎng)3周后進(jìn)行開場實(shí)驗(yàn)。開場箱為36 cm×30 cm×30 cm的透明有機(jī)玻璃箱，底面劃線分割成等大的9個方格，將小鼠頭朝同一方向放入開場箱中心，立即開始觀察，記錄小鼠10 min內(nèi)的跨格數(shù)和站立次數(shù)（以四肢均進(jìn)入同一方格判定為跨格，兩前肢同時離開地面判定為站立）。

1.8 懸尾實(shí)驗(yàn)

給藥14 d參照Steru等［13］建立的方法進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)。各組小鼠ig給藥60 min后，用膠布黏住鼠尾距尾尖2 cm處，用夾子夾住膠布，將小鼠倒懸在黑色懸尾箱（25 cm×25 cm×35 cm）中，頭部距箱底約5 cm，立即開始觀察6 min，記錄后4 min內(nèi)小鼠的不動時間（不動標(biāo)準(zhǔn)為小鼠停止掙扎，身體呈倒懸靜止?fàn)顟B(tài)）。

1.9 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

給藥16 d參照Porsolt等［14］建立的方法進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。各組小鼠ig給藥60 min后，將小鼠放入高20 cm、直徑12 cm的圓柱形玻璃游泳缸中，水深10 cm，水溫25℃。立即開始觀察6 min，記錄后4 min內(nèi)小鼠的不動時間（不動標(biāo)準(zhǔn)為身體呈漂浮狀態(tài)，或僅四肢輕微運(yùn)動以保證頭部浮于水面）。

1.10 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

給藥18 d參照Lister等［15］改良的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。高架十字迷宮為黑色有機(jī)玻璃裝置，由兩條開臂和兩條閉臂組成，臂寬6 cm，長50 cm，呈十字型連通結(jié)構(gòu)。閉臂3個側(cè)面封閉，頂部開放，開臂完全開放，無遮擋，交叉區(qū)域?yàn)橹醒雲(yún)^(qū)。整個裝置架高，距地面45 cm。各組小鼠ig給藥60 min后，頭朝開臂方向放入中央?yún)^(qū)，立即開始觀察5 min，記錄小鼠分別進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)及停留時間（入臂行為以四肢均進(jìn)入為準(zhǔn)）。統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為入臂總時間（即進(jìn)入開、閉臂時間之和）、入臂總次數(shù)（即進(jìn)入開、閉臂次數(shù)之和）、開臂停留時間百分比〔開臂停留時間（%）=開臂停留時間/入臂總時間× 100%〕和入開臂次數(shù)百分比〔入開臂次數(shù)（%）=進(jìn)入開臂次數(shù)/入臂總次數(shù)×100%〕。

1.11 爬梯實(shí)驗(yàn)

給藥20 d參照Simiand等［16］改良的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行爬梯實(shí)驗(yàn)。爬梯實(shí)驗(yàn)裝置為一透明有機(jī)玻璃箱，內(nèi)有5級高2.5 cm、寬10 cm的樓梯，樓梯側(cè)壁的高度一致。各組小鼠ig給藥60 min后，將小鼠背朝樓梯放在實(shí)驗(yàn)箱底部，立即開始觀察5 min，記錄小鼠爬梯數(shù)（以四肢都爬上樓梯為準(zhǔn)）和站立次數(shù)。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s表示，使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。蛋白含量檢測和自發(fā)活動計(jì)數(shù)結(jié)果采用t檢驗(yàn)，其余數(shù)據(jù)均采用雙因素方差分析（two-way ANOVA），組間比較采用Tukey檢驗(yàn)，以P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠海馬微注射AAV感染部位及GSK3β 蛋白表達(dá)

微注射AAV小鼠AAV感染部位如（圖1）所示，在熒光顯微鏡下，小鼠海馬齒狀回立體定位微注射3周后，整個海馬區(qū)可見GFP表達(dá)，而海馬外腦區(qū)未見綠色熒光。Western蛋白印跡法檢測結(jié)果（圖2）所示，與AAV組相比，GSK3β過表達(dá)組小鼠海馬GSK3β含量顯著升高（P＜0.01），而p-GSK3β（S9）含量無顯著性差異。提示AAV攜帶的GSK3β（S9A）突變型基因在海馬部位成功過表達(dá)，且外源性GSK3β無法被磷酸化，GSK3β功能被持續(xù)激活。

Fig.1 Adeno-associated virus（AAV）transfection area in hippocampus.Mice were microinfused with AAV empty vec?tor and sacrificed 3 weeks later.Specific expression of green fluorescent protein（GFP）was observed under fluorescence microscopy.

Fig.2 Expression of glycogen synthase kinase 3β（GSK3β ）and phospho-GSK3β （S9）in hippocampus tissue of mice microinfused with AAV-GSK3β（S9A）by Western blotting.The mice were microinfused with AAVGSK3β（S9A）or AAV empty vector and sacrificed 3 weeks later. B was the semi-quantitative result of A.x±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with AAV group.

2.2小鼠海馬GSK3β 過表達(dá)對自發(fā)活動的影響

開場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GSK3β過表達(dá)組與AAV組小鼠跨格次數(shù)和站立次數(shù)均無顯著差異（表1），提示GSK3β過表達(dá)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)不產(chǎn)生興奮或抑制作用。

Tab.1 Effect of GSK3β over expression on locomotor activity in open field test in mice

2.3 小鼠海馬GSK3β 過表達(dá)對XBXT-2抗抑郁活性的影響

在懸尾實(shí)驗(yàn)中，GSK3β過表達(dá)組與AAV組間小鼠懸尾不動時間無明顯差異；AAV+XBXT-2組與AAV組比較，不動時間明顯縮短（P＜0.05）；GSK3β過表達(dá)+XBXT-2組與GSK3β過表達(dá)組比較，不動時間無顯著差異（表2）。

Tab.2 Effect of GSK3β over-expression in hippocampus on immobility time in tail suspension test of XBXT-2 in mice

在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，GSK3β過表達(dá)組與AAV組小鼠游泳不動時間無明顯差異；AAV+XBXT-2組與AAV組比較，不動時間明顯縮短（P＜0.05）；GSK3β過表達(dá)+XBXT-2組與GSK3β過表達(dá)組比較，不動時間無明顯變化；而GSK3β過表達(dá)+ XBXT-2組與AAV+XBXT-2組比較，小鼠游泳不動時間顯著延長（P＜0.05）（表3）。

Tab.3 Effect of GSK3β over expression in hippocampus on immobility time in forced swimming test of XBXT-2 in mice

2.4 小鼠海馬GSK3β 過表達(dá)對XBXT-2抗焦慮活性的影響

在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，與AAV組比較，GSK3β過表達(dá)組小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比顯著減少（P＜0.05），AAV+XBXT-2組小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比（P＜0.01）和開臂停留時間百分比（P＜0.05）均顯著增加；與GSK3β過表達(dá)組比較，GSK3β過表達(dá)+XBXT-2組進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂停留時間百分比無顯著差異；與AAV+XBXT-2組比較，GSK3β過表達(dá)+XBXT-2組小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比（P＜0.01）和開臂停留時間百分比（P＜0.05）均顯著減少。此外，各組間入臂總時間和總次數(shù)均無顯著差異（表4）。

XBXT-2在爬梯實(shí)驗(yàn)中，與AAV組比較，AAV+ XBXT-2組小鼠站立次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與AAV+XBXT-2組比較，GSK3β過表達(dá)+XBXT-2組小鼠站立次數(shù)顯著增加（P＜0.05）；而AAV組與GSK3β過表達(dá)組之間，及GSK3β過表達(dá)組與GSK3β過表達(dá)+XBXT-2組之間，小鼠站立次數(shù)均無顯著差異。此外，各組間爬梯次數(shù)均無顯著差異（表5）。

Tab.4 Effect of GSK3β over expression in hippocampus on exploratory behavior of XBXT-2 in elevated plus maze test in mice

Tab.5 Effect of GSK3β over expression in hippocampus on exploratory behavior in stair case test of XBXT-2 in mice

3 討論

近年來越來越多的研究表明，GSK3β在抑郁癥和焦慮癥的發(fā)生和治療中發(fā)揮著重要作用，主要證據(jù)包括：重度抑郁癥死亡患者大腦皮質(zhì)GSK3活性升高［17］；通過轉(zhuǎn)基因方法阻斷小鼠GSK3β的抑制性磷酸化過程可產(chǎn)生焦慮樣表現(xiàn)［18］；GSK3β持續(xù)激活（KI小鼠）可取消氟西汀的抗抑郁作用和促神經(jīng)元再生作用［19-20］；選擇性GSK3β抑制劑可在動物模型上產(chǎn)生抗抑郁樣作用［21］；等等。

轉(zhuǎn)基因動物是研究GSK3β在精神疾病的發(fā)生與治療中的常用手段，然而需要在胚胎期對目的基因進(jìn)行操作，可能存在胚胎死亡或代償性功能改變等缺陷［22］。與轉(zhuǎn)基因動物相比，病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染具有以下優(yōu)勢：①可實(shí)現(xiàn)定位注射，從而研究特定腦區(qū)目的基因改變的影響；②實(shí)驗(yàn)對象為成年動物，避免了發(fā)育過程中代償機(jī)制的影響；③實(shí)驗(yàn)周期和成本較低。常用病毒載體包括慢病毒、AAV和腺病毒。本研究使用的AAV是一種單鏈DNA病毒，病毒基因組游離于宿主基因組外，具有長期表達(dá)的潛能，與慢病毒相比，表達(dá)豐度高，彌散性更好，作用時間更長，免疫原性低［23］。

本研究采用小鼠懸尾和小鼠強(qiáng)迫游泳模型，以及小鼠高架十字迷宮和小鼠爬梯模型，分別評價AAV介導(dǎo)的海馬GSK3β（S9A）過表達(dá)（表現(xiàn)為9位絲氨酸無法磷酸化，導(dǎo)致GSK3β功能持續(xù)激活）對抑郁樣行為和焦慮樣行為的影響，以及GSK3β是否為XBXT-2發(fā)揮抗抑郁作用和抗焦慮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。小鼠懸尾和小鼠強(qiáng)迫游泳是經(jīng)典的抑郁樣行為評價模型，抗抑郁藥物能縮短小鼠懸尾和游泳的不動時間。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)是利用小鼠對新奇環(huán)境的探究習(xí)性和對高懸開臂的恐懼形成矛盾沖突而建立的焦慮樣行為評價模型，抗焦慮藥物可增加小鼠對開臂的探究行為，使進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂停留時間百分比增加［24］。爬梯實(shí)驗(yàn)是利用嚙齒動物進(jìn)入新奇環(huán)境時會表現(xiàn)出緊張不安、探究行為增加的行為特性而建立的焦慮樣行為評價模型，抗焦慮藥物可使小鼠站立次數(shù)減少，而不影響爬梯次數(shù)（反映動物的運(yùn)動活性）［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，在上述行為模型上，XBXT-2在AAV組小鼠上具有良好的抗抑郁和抗焦慮作用，然而在GSK3β過表達(dá)組小鼠上，該行為效應(yīng)消失，表明GSK3β過表達(dá)可取消XBXT-2的抗抑郁和抗焦慮作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，海馬GSK3β過表達(dá)可使小鼠在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生焦慮樣行為表現(xiàn)，提示海馬GSK3β功能持續(xù)激活可能參與焦慮癥的發(fā)生。本研究中，在經(jīng)典的懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)上未觀察到GSK3β過表達(dá)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為表現(xiàn)，與文獻(xiàn)［20］報(bào)道一致，但也有研究顯示，GSK3β失抑制會增加抑郁的易感性［19，25］，而GSK3β失抑制是否增加應(yīng)激的易感性進(jìn)而參與抑郁癥的發(fā)生還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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Effect of glycogen synthase kinase 3β overexpression in hippocampus on antidepressant and anxiolytic activity of total flavoids from Xiaobuxin Tang in mice

YE Hong-tao1,2,XUE Rui2,XU Fang-min2,DING Zhen-chun2,DENG Yun1,ZHANG You-zhi2
(1.School of Medicine,Anhui University of Science and Technology,Huainan 232000,China;2.State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures,Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China)

OBJECTIVETo study the influence of glycogen synthase kinase3β(GSK3β)over expres?sion in the hippocampus on the antidepressant and anxiolytic effects of total flavoids from Xiaobuxin Tang(XBXT-2).METHODSAdeno-associated virus containing GSK3β(S9A)mutation was microinjected into the hippocampus.After three weeks of recovery,GSK3β and p-GSK3β were detected by Western blotting,and open field test(OFT)was used to evaluate the locomotor activity.Then,AAV group and GSK3β over expression group were divided into administration group and solvent group,respectively. XBXT-2(100 mg·kg-1)and solvent were ig administered chronically.After 14 d and 16 d of administra?tion,the tail suspension test(TST)and forced swimming test(FST)were used to investigate the influence of GSK3β over expression on the antidepressant effect of XBXT-2,respectively.After 18 d and 20 d of administration,the elevated plus maze test(EPMT)and staircase test(ST)were used to investigate the influence of GSK3β over expression on the anxiolytic effects of XBXT-2,respectively.RESULTSWestern blotting analysis showed that the protein level of GSK3β increased significantly in GSK3β over expression group(P＜0.01)compared with AAV group,but there was no significant difference in p-GSK3β.In OFT,the number of crossings and rearings showed no difference between AAV group and GSK3β over expression group.The results of TST and FST showed that compared with AAV group,the immobility time was significantly reduced in AAV+XBXT-2 group(P＜0.05,P＜0.01),but compared with GSK3β over expression group,the immobility time showed no difference in GSK3β over expression+ XBXT-2 group.In EPMT,compared with AAV group,the percentage of entrances and time into open arms in AAV+XBXT-2 group was significantly increased(P＜0.01,P＜0.05),but compared with GSK3β over expression group,these indexes showed no difference in GSK3β over expression+XBXT-2 group. In ST,compared with AAV group,the number of rearings was significantly reduced in AAV+XBXT-2 group(P＜0.05),but there was no difference between GSK3β over expression+XBXT-2 group and GSK3β over expression group.CONCLUSIONGSK3β over expression in the hippocampus can reverse the antidepressant effects of XBXT-2 in the TST and FST,and the anxiolytic effects in the EPM and ST.

Xiaobuxin Tang;total flavoids;depression;anxiety;glycogen synthase kinase 3β;adenoassociated virus

DENG Yun,E-mail:yunfree196@yeah.net,Tel：13866306502;ZHANG You-zhi,E-mail：13901363887@163.com,Tel：（010）66874620

R964

：A

：1000-3002-（2017）03-0224-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.03.004

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81274117);and National Nat?ural Science Foundation of China(81302761)

2016-12-06接受日期：2017-01-23）

（本文編輯：趙楠）

國家自然科學(xué)基金（81274117）；國家自然科學(xué)基金（81302761）

葉洪濤，男，碩士研究生，主要從事精神藥理學(xué)研究，Tel:（010）66931619，E-mail：yehongtao12345@163.com；鄧云，女，教授，主要從事中藥藥理學(xué)研究；張有志，男，研究員，主要從事精神藥理學(xué)研究。

鄧云，E-mail：yunfree196@yeah.net，Tel：1386-6306502；張有志，E-mail：13901363887@163.com，Tel：（010）66874620