饒志堅，常蕓，王世強

（1.國家體育總局體育科學研究所，北京100061；2.上海體育學院運動科學學院，上海200438；3.湖南工業(yè)大學體育學院，湖南株洲412000）

·綜述·

外泌體對組織纖維化調節(jié)作用的研究進展

饒志堅1，2，常蕓1，王世強3

（1.國家體育總局體育科學研究所，北京100061；2.上海體育學院運動科學學院，上海200438；3.湖南工業(yè)大學體育學院，湖南株洲412000）

外泌體是由細胞釋放的一種納米囊泡，包括心肌細胞、肝細胞及多種干細胞在內的各種細胞都會釋放外泌體。外泌體在細胞間起著通訊作用，它攜帶著信使RNA、微RNA和蛋白質參與了幾乎所有病理生理過程。組織細胞損傷后釋放的外泌體能通過觸發(fā)炎癥、激活成纖維細胞等途徑啟動修復和（或）再生反應，導致組織纖維化。而干細胞釋放的外泌體則能通過促進細胞存活、減少細胞凋亡等途徑減輕組織纖維化。本文綜述不同來源的外泌體對幾種常見組織纖維化調節(jié)作用的研究進展。

外泌體；組織纖維化；微RNA；干細胞

組織纖維化，包括心肌纖維化、肝纖維化、腎纖維化和肺纖維化等是許多疾病致殘和致死的主要原因之一。盡管纖維化發(fā)生機制尚未闡明，但成纖維細胞的激活被認為是組織纖維化的中心環(huán)節(jié)［1］。成纖維細胞與其他細胞和（或）細胞因子之間的信息交流在組織纖維化過程中發(fā)揮關鍵作用，如內皮型一氧化氮合酶活性下降［2］或血小板源性生長因子水平上升［3］及轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的生成［4］可導致成纖維細胞的激活和遷移。然而，近年來大量的研究發(fā)現(xiàn)，組織纖維化過程中細胞和因子間還有一種交流通路，稱為外泌體［5］。外泌體是一種直徑為30～100 nm的囊泡，攜帶著信使RNA（mRNA）、微RNA（microRNA，miRNA）和蛋白質等內容物，在細胞間起著通訊介質的作用，參與了幾乎所有的生理和病理過程［6］。近年來的研究表明，外泌體參與了組織纖維化的形成過程，外泌體內容物可與細胞外基質相互影響，包括整合素、基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotenases，MMP）和免疫球蛋白超家族成員［7］。因此有人提出外泌體可能成為新的纖維化診斷指標。此外，干細胞移植是治療組織纖維化的一種新技術，但在治療過程中有許多困難，如到達病灶的干細胞少、病灶微環(huán)境殺死干細胞等。而有學者發(fā)現(xiàn)，干細胞釋放的外泌體具有干細胞的部分功能［8］，且外泌體可通過血液將其內容物攜帶到靶細胞，并能保護其內容物不被酶降解，因此外泌體有可能應用于治療組織纖維化。本文簡要綜述了近幾年外泌體和組織纖維化的研究進展，為進一步的研究提供思路。

1 外泌體

外泌體是密度為1.13～1.19 kg·L-1納米囊泡，電鏡下呈圓形或杯狀結構，100 000×g離心可沉淀［9］。這些納米囊泡源于多囊泡體，多囊泡體的膜向內凹陷，形成一個膜包圍的結構，其基部逐漸與多囊泡體的膜分離，脫落后形成腔內小囊泡，小囊泡里面包裹的主要是細胞質。多囊泡體的泡膜與質膜融合，導致其中的小囊泡排到細胞外環(huán)境中，即為外泌體。因此，外泌體的分子組成可反應其來源，靶向到特定的細胞群并影響這些細胞的功能。外泌體可由多種細胞形成和釋放，如心臟干/祖細胞（cardiac stem/progenitor cells，CSC/CPC）、心肌細胞、肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）、肝細胞、T細胞、胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）和間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）等。目前，國內外關于外泌體形成和釋放機制的研究很少。Abdullah等［10］發(fā)現(xiàn)，淀粉樣蛋白可通過增強c-Jun氨基端激酶磷酸化而抑制星形膠質細胞外泌體的釋放；而Sinha等［11］發(fā)現(xiàn)，皮質肌動蛋白結合蛋白（cortactin）可通過調控肌動蛋白來促進外泌體的釋放。盡管外泌體形成和釋放的機制仍待進一步研究，但能確定的是外泌體能將其內容物從一個細胞輸送到另一個細胞，且能保護其內容物不被酶降解，因此它能調節(jié)細胞間的信息交流。細胞應激可導致細胞釋放的外泌體攜帶的mRNA和蛋白質發(fā)生變化［12］，表明外泌體一定程度上可反映細胞所處的生理狀態(tài)［13］，外泌體傳送的功能分子可以維持或改變特定細胞的功能狀態(tài)，因此外泌體有望從診斷、治療和藥物呈遞等方面改變許多疾病的治療面貌。

2 組織纖維化

纖維化是指各種原因造成組織損傷的愈合反應，表現(xiàn)為組織內細胞外基質過度沉積，組織順應性下降，引起組織功能障礙。目前，組織纖維化的具體機制仍不明確，但可能與以下幾種因素有關［14］：①血管緊張素-腎素-醛固酮系統(tǒng)的激活；②炎癥反應與氧化應激；③生長因子的分泌及釋放；④血管內皮功能障礙。這些因素通過作用于組織細胞、成纖維細胞、炎癥細胞（中性粒細胞，單核-巨噬細胞，淋巴細胞等）、內皮細胞和細胞外基質，最終導致組織纖維化［15-16］?？梢姡M織纖維化是通過多種效應細胞相互作用而實現(xiàn)的。之前認為細胞間的相互作用是通過自分泌、旁分泌和遠距分泌等方式分泌調節(jié)因子而達成的。但近十年來發(fā)現(xiàn)，外泌體也可作為細胞間信息交流的方式，表明外泌體可能在組織纖維化過程中發(fā)揮一定的作用［5］。

目前，纖維化的診斷方法主要有以下幾種［17］：①組織學檢查，是診斷組織纖維化可靠的方法，但對組織有較大創(chuàng)傷；②影像學方法，如B超、CT和MRI等，簡單易行但特異性不高；③體液（血清或尿液）標志物，包括細胞外基質成分、降解產(chǎn)物、參與其代謝的酶和細胞因子等，易于測定且是非侵入性的，但無組織特異性。各種檢測手段都有其診斷價值，無法用一個指標完全替代其他指標，臨床上一般結合多種診斷方法進行綜合評價。

除了器官移植，臨床上尚無治療組織纖維化的有效手段，而器官移植面臨許多困難，包括捐贈器官少、費用高和免疫排斥反應等，因此亟需應用更加有效的治療方法。目前研究認為，潛在的治療靶點有血管緊張素系統(tǒng)、內皮細胞系統(tǒng)、生長因子和炎癥因子等，但由于對組織纖維化過程的認識還不夠透徹，而且參與組織纖維化過程的調節(jié)因子有多重功能，且其調節(jié)和激活下游信號因子十分復雜，因而臨床前實驗和臨床試驗得出的結果往往相互矛盾［18］。比如主動脈縮窄術后，抑制TGF-β受體可減少纖維化及膠原蛋白的表達［19］；但另一項采用抗TGF-β的方法發(fā)現(xiàn)，盡管成纖維細胞激活減少，膠原蛋白轉錄水平也下降，但心功能并未明顯改善［20］，且還有可能增加死亡率［21］。因此，在無更多實驗證實其臨床效應之前，應用TGF-β療法還需謹慎。干細胞因具有免疫調節(jié)能力、自我更新能力和分化能力，而且獲取成本低而備受關注。因此，研究人員認為干細胞移植可能是一種治療組織纖維化有效的方法，對此展開研究并得到了積極結果［22］。但干細胞治療靶向性不強，且在輸往損傷組織過程中及在損傷組織微環(huán)境中易受影響。研究發(fā)現(xiàn)，干細胞可分泌外泌體，且其外泌體具有其部分功能。因此，干細胞外泌體也可用于治療組織纖維化［23］。

3 外泌外對組織纖維化的調節(jié)

3.1 外泌體與心肌纖維化

心肌纖維化是由各種病因所致心肌細胞損傷引起的。受損的心肌細胞可釋放外泌體，且成分與正常心肌細胞釋放的外泌體成分有較大差異，因而可引發(fā)修復過程，最終導致心肌纖維化。如糖尿病性心肌病患者通常伴隨心肌纖維化。Wang等［24］發(fā)現(xiàn)，糖尿病性心肌病患者心肌細胞釋放的外泌體中熱休克蛋白20（heat shock protein 20，HSP20）含量顯著低于對照組，表明HSP20表達下降可能是此類患者心肌纖維化的原因之一。為進一步證實HSP20是心肌纖維化的關鍵因子，該團隊隨后采用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）處理野生型小鼠和HSP20過表達的轉基因小鼠誘導糖尿病。結果發(fā)現(xiàn)，HSP20過表達可減輕STZ引起的心肌纖維化。提取心肌細胞外泌體發(fā)現(xiàn)，外泌體中HSP20水平高于對照組，用阻斷劑阻斷外泌體的形成后可抵消HSP20對糖尿病性心肌病的保護效應。而通過一些干預方式可促進正常心肌細胞釋放外泌體，這種外泌體有減輕心肌纖維化的功能，如運動能有效地防治糖尿病性心肌病。Chaturvedi等［25］發(fā)現(xiàn)，運動可通過促進心肌細胞釋放外泌體來減輕糖尿病性心肌病患者心肌纖維化，這種外泌體攜帶的miR-455，-29b，-323-5p和-466水平升高，進而下調MMP-9的表達，阻斷下游細胞外基質重塑。此外，心肌梗死再灌注對心肌造成二次損傷后，采用遠端缺血適應（remote ischemic conditioning，RIC）可有效保護左心室舒張功能，減少心肌間充質纖維化，減少氧化應激。Yamaguchi等［26］發(fā)現(xiàn)，RIC組血清外泌體中miR-29a水平升高，低氧處理C2C12細胞后，它們釋放的外泌體中miR-29a水平也顯著升高，而miR-29a是組織纖維化的關鍵調節(jié)因子之一（有抗纖維化作用）。提示再灌后RIC可上調外泌體中miR-29a水平，進而減輕心肌纖維化。

干細胞移植（主要是CPC/CSC，ESC和MSC）可用于治療心肌梗死、減輕心肌纖維化，但梗死后的缺血微環(huán)境可殺滅干細胞，因而降低治療效果。隨后研究發(fā)現(xiàn)，外泌體具有其母細胞的部分功能，因此針對干細胞外泌體能否治療心肌梗死、減輕心肌纖維化展開了許多研究。

CPC/CSC移植可治療心肌病，CSC釋放的外泌體能改善心功能，減少心肌細胞的凋亡，減輕心肌纖維化［27］。Gray等［28］體外低氧處理CPC，然后提取外泌體。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，低氧處理后CPC釋放的外泌體中有7種miRNA（miR-15b，-17，-20a，-103，-199a，-210和-292）表達上調。提示缺血/低氧刺激CPS釋放的外泌體中miRNA表達上調，進而作用于成纖維細胞，降低其促纖維化因子的表達，減輕心肌纖維化。

MSC可用于治療心肌梗死，除了可分化的特性，它還能通過釋放外泌體保護梗死后的心肌細胞。在體實驗表明，缺血預適應后MSC釋放的外泌體可顯著減輕梗死后的心肌纖維化，外泌體中miR-21，-22，-24，-199a-3p和-210含量升高，然后直接作用于甲基CpG結合蛋白2而減少心肌細胞凋亡［29］。此外，Zhao等［30］也發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質干細胞釋放的外泌體可提高心收縮功能，減輕心肌纖維化，減少心肌細胞的凋亡，這些功能可能與外泌體調節(jié)Bcl-2家族成員的表達有關。MSC除能通過減少心肌細胞凋亡減輕心肌纖維化外，用MSC外泌體預處理CSC后，CSC的增殖能力和分化能力增強，能更有效地減輕心肌纖維化，修復心功能，這可能與MSC釋放的外泌體中攜帶有復雜的mRNA和miRNA基因網(wǎng)絡有關［23］。

ESC有再生心肌細胞的功能，其釋放的外泌體也能增強心功能，促進血管生成及心肌細胞的存活，減少心肌纖維化。人ESC來源的心血管祖細胞及其釋放的外泌體可改善慢性心衰小鼠的心功能，并減少纖維化面積（盡管與對照組無顯著性差異），在其外泌體內發(fā)現(xiàn)49種miRNA表達較高，其中78%可通過增加心肌細胞存活和（或）增殖及促進DNA修復來提高心功能，同時減輕纖維化及心衰［31］。ESC外泌體除了直接增加心肌細胞的存活來減輕心肌纖維化外，還可增強CPC的存活并促進其增殖，進而減輕心肌纖維化。其可能機制是ESC外泌體中富含miR290-295基因簇，尤其是miR-294，它們能增強CPC存活和促進CPC增殖［32］。

可見CPC/CSC，MSC和ESC除了本身可用于減輕心肌纖維化，它們釋放的外泌體也有減輕心肌纖維化的功能。這一功能可能是通過外泌體攜帶的miRNA來增加受損心肌細胞的存活率和（或）減輕炎癥實現(xiàn)的。

3.2 外泌體與肝纖維化

肝纖維化是由肝細胞損傷引發(fā)的。在肝纖維化發(fā)生的過程中，受損肝細胞釋放的外泌體可通過多種途徑發(fā)揮其促纖維化作用。首先肝細胞可釋放含有多種自體RNA（self-RNA）的外泌體，這些自體RNA能激活HSC的Toll樣受體3（Toll-like recep?tor 3，TLR3），然后促使HSC表達的CC類趨化因子配體20（C-C motif chemokine ligand 20，CCL20）增多，CCL20再募集大量CCR6+和γδ T細胞，最終使白細胞介素（interleukin，IL）-17A，IL-1β和IL-21在肝纖維化早期表達升高，而敲除TLR3基因后IL-17A的表達水平降低，肝纖維化面積也減少［33］。其次，受損肝細胞釋放的外泌體能直接上調纖維化標志物的水平，如TGF-β受體Ⅱ、α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和Ⅰ型膠原蛋白α2，這可能與外泌體中前體miR-17-92基因簇表達上升有關［34］。最后，受損肝細胞釋放的外泌體可抑制抗纖化因子的表達，如miR-122可使低氧誘導因子1α、波形蛋白及絲裂原活化蛋白激酶3等組織重塑因子表達上調，從而促進肝纖維化［35］。

肝纖維化通路主要由HSC調控，它可生成促纖維化因子，如結締組織生長因子CCN2。研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞釋放的外泌體除了通過上述幾個途徑調節(jié)肝纖維化過程外，還能通過調節(jié)HSC的活動來影響纖維化過程。外泌體一方面可調節(jié)HSC表達CCN2，另一方面還能調節(jié)CCN2在HSC間的轉運［36］。外泌體對CCN2的調節(jié)可能是通過其攜帶的miR-214實現(xiàn)的。肝纖維化時，CCN2表達上調，而miR-214水平降低，miR-214可直接結合CCN2 3’-UTR從而抑制CCN2及其下游基因的表達［37］。因此，HSC外泌體中miR-214含量下降可能是肝纖維化的誘因。Twist1能上調miR-214的表達，而肝纖維化發(fā)生時外泌體中Twist1的表達被抑制，且實驗證實休眠HSC釋放的外泌體中Twist1表達水平很高，但HSC激活后釋放的外泌體中Twist1表達水平卻很低，表明肝損傷導致HSC激活后Twist1的表達被抑制，從而使miR-214表達下降，CNN2的表達升高，最終形成肝纖維化［38］?？梢?，外周外泌體中Twist1，miR-214和CCN2的表達水平可反映肝纖維化程度。因此，血清外泌體能可作為新的診斷肝纖維化的生物標志物。

肝內其他細胞，如血竇內皮細胞能通過釋放外泌體調控HSC的遷移和激活，從而調節(jié)肝纖維化過程。內皮細胞釋放含有鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SK1）的外泌體，外泌體通過纖連蛋白-整合素依賴途徑黏附到HSC上，再通過發(fā)動蛋白-2依賴途徑內化到HSC內，然后激活HSC并促進它的遷移，進而引起肝纖維化。SK1可由成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）激活，而FGF-2已被證實在肝纖維化過程中對外泌體的釋放十分重要［39］。鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine 1-phosphate，S1P）是SK1的下游蛋白，SK1含量升高的外泌體中S1P含量也很高，S1P能募集HSC，并通過激活絲氨酸/蘇氨酸激酶導致HSC的遷移。S1PR2的抑制劑能減輕四氯化碳誘導的肝纖維化［40］。

可見，肝損傷后，肝中各種來源的外泌體通過多種途徑引起肝纖維化，但干細胞釋放的外泌體卻可用于治療肝纖維化。如Li等［41］發(fā)現(xiàn)，MSC釋放的外泌體可減輕肝纖維化、炎癥和膠原堆積，其可能機制是MSC釋放的外泌體下調TGF-β1及p-Smad2的表達，減少Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的生成，從而減少上皮間充質轉化。

3.3 外泌體與腎纖維化

在腎纖維化過程中，不同類型細胞釋放的外泌體通過不同途徑發(fā)揮其調節(jié)作用。如腎近端小管上皮細胞損傷后釋放的外泌體攜帶的基因信息（如TGF-β1mRNA）可激活腎間充質成纖維細胞，TGF-β1快速激活修復或（和）再生反應，促進成纖維細胞的增殖，上調α-SMA、F-肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的表達，最終導致纖維化［42］。而腎小球內皮細胞損傷后其釋放的外泌體攜帶大量的TGF-β1mRNA，通過TGF-β/Smad3信號通路促進腎小球系膜細胞內α-SMA的表達，使腎細胞外基質過度堆積，形成腎纖維化［43］。人體試驗也發(fā)現(xiàn)，從尿液提取的外泌體中miR-29c與Smad3和MMP2呈負相關，且miR-29c表達水平與腎慢性化指數(shù)（即腎小球硬化、纖維性新月體、小管萎縮和間充質纖維化的評分，分數(shù)越高纖維化越嚴重）也呈負相關［44］，表明外泌體中的miR-29c可作為新的診斷腎纖維化的生物標志物。

受損腎細胞釋放的外泌體可促進腎纖維化，而干細胞釋放的外泌體卻可用于治療腎纖維化。如Wang等［45］發(fā)現(xiàn)，miR-Let7c-MSC通過釋放含有miR-Let7c的外泌體抑制促纖維化因子（Ⅰ型膠原蛋白、MMP-9、TGF-β1和TGF-β1R）的基因表達，若使用外泌體抑制劑GW4869則可拮抗這一效應。這些結果表明，HSC通過釋放攜帶miR-Let7c的外泌體至損傷區(qū)域，抑制促纖維化因子的基因表達，發(fā)揮其抗纖維化功能。

3.4 外泌體與其他組織纖維化

除上述幾個重要的臟器組織外，其他組織纖維化與外泌體的研究較少。de Jong等［46］研究發(fā)現(xiàn)，內皮損傷后釋放的外泌體中賴氨酰氧化酶樣蛋白2（lysyl oxidase-like 2，LOXL2）表達上升2倍，這種外泌體可增強膠原交聯(lián)活性，促進真皮細胞外基質重塑；而LOXL 2基因敲除的內皮細胞損傷后釋放的外泌體不能促進真皮細胞外基質重塑，表明內皮細胞損傷后釋放的外泌體通過LOXL2調控真皮細胞外基質的重塑，進而影響皮膚纖維化和傷口愈合。

此外，Choi等［47］用人MSC（human MSC，hMSC）及其釋放的外泌體干預肺纖維化小鼠。結果發(fā)現(xiàn)，hMSC可分化成Ⅰ型肺細胞并成功表達表面蛋白，直接替代纖維化，從而減輕肺纖維化；而hMSC釋放的外泌體雖然效果不如直接移植hMSC，但仍然能顯著減輕膠原堆積和炎癥等非特異性肺纖維化的癥狀。

4 結語

外泌體作為一種細胞間的通訊介質，參與了組織纖維化的病理生理過程（圖1）。目前，對外泌體形成和釋放的機制所知甚少，是今后亟待研究的領域。外泌體所攜帶的功能分子受其母細胞種類及其母細胞所處環(huán)境的影響，對不同靶細胞的功能也有所不同。組織細胞損傷后釋放的外泌體可觸發(fā)炎癥、引起修復或（和）再生反應，導致組織纖維化。因此，外泌體及其內容物可作為診斷組織纖維化的新標志物，避免活檢對組織器官的損傷，但組織纖維化的特異性外泌體還需更進一步的驗證。而干細胞（如ESC，MSC和CSC/CPC）釋放的外泌體卻能減輕組織纖維化、修復組織器官的功能。因此，這些外泌體可被用于治療組織纖維化，克服干細胞移植治療纖維化的一些障礙。此外，還能通過直接構建外泌體將抗纖維化藥物載入外泌體中，用于治療組織纖維化。綜上所述，外泌體在組織纖維化的診斷、治療和藥物呈遞方面都有一定的應用前景，但還需更多的研究了解其臨床影響。

圖1 外泌體在組織纖維化過程中的作用.

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Research progress in exosomes in tissue fibrosis

RAO Zhi-jian1,2,CHANG Yun1,WANG Shi-qiang3
(1.China Institute of Sport Science,Beijing 100061,China;2.School of Kinesiology,Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China;3.College of Physical Education,Hunan University of Technology,Zhuzhou 412000,China)

Exosomes are extracellular nanovesicles secreted by a variety of cell types such as cardiomyocyte,hepatocytes,and stem cells.They carry specific sets of mRNA,microRNA,and proteins, which play a role in intercellular communication in almost each physiological and pathological process. Exosomes,which are released after tissue cell injury,can initiate repair/regeneration responses by triggering inflammation and active fibroblast,and finally lead to tissue fibrosis.However,exosomes released by stem cells can retard tissue fibrosis by enhancing cell survival and reducing apoptosis.In this paper, we reviewed the research progress in the relationship between exosomes and tissue fibrosis.

exosomes;tissue fibrosis;microRNA;stem cells

CHANG Yun，E-mail:changyun@ciss.cn

R963

：A

：1000-3002-（2017）03-0262-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.03.010

Foundation item:The project supported by Fad of CISS-BSF16-21 from Ministry of science and Technoloqy of China; Humam Exercise Capability Development and Protection from the Key Laboratory of shanghai Municipality（11DZ2261100）

2016-08-29接受日期：2017-03-21）

（本文編輯：齊春會）

國家體育總局體育科學研究所基本科研業(yè)務（16-21）；上海市人類運動能力開發(fā)與保障重點實驗室資助（11DZ2261100）

饒志堅，男，博士研究生，主要從事運動心臟病生理學研究，E-mail:1101294556@qq.com；常蕓，女，運動醫(yī)學博士，研究員，博士生導師，主要從事運動心臟病生理學研究。

常蕓，E-mail:changyun@ciss.cn