任嬌艷 尚帥明 梁明 張婷 周勇 李海龍 袁爾東?

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510640； 2.無限極(中國)有限公司， 廣東 廣州 510665)

酒精性肝病(ALD)是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率較高的一大主要疾病.其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，可能與乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛、氧化應(yīng)激、內(nèi)毒素、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞凋亡等多種因素有關(guān)[1].肝臟是乙醇在人體內(nèi)的最重要的代謝器官，研究表明乙醇脫氫酶(ADH)、肝微粒體乙醇氧化系統(tǒng)(MEOS)以及過氧化氫酶(CAT)是參與乙醇代謝的3條途徑[2].其中MEOS中核心的酶是細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)，該酶會(huì)被乙醇誘導(dǎo)而激活，參與大部分乙醇代謝，并產(chǎn)生過量的活性氧(ROS).細(xì)胞內(nèi)累積的ROS會(huì)攻擊細(xì)胞膜和線粒體，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能上的損傷，使得細(xì)胞內(nèi)的氧化還原失衡，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷或凋亡，進(jìn)一步造成酒精性肝損傷[3].因此，這種具有抗氧化能力的化合物潛在具備對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)的功能.

河蜆(Corbiculafluminea)是雙殼類軟體動(dòng)物，其營養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)、糖原、必需氨基酸等物質(zhì)，同時(shí)具備食用價(jià)值、保健作用以及藥用價(jià)值，因其具有利尿、治療肝病等功效而廣受歡迎[4].研究發(fā)現(xiàn)[5]，河蜆活性成分多糖CFPS-2具有很強(qiáng)的抗氧化活性且呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)，對(duì)人的胃癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的生長也具有顯著的抑制作用.河蜆的脂質(zhì)成分可使高膽固醇食物誘發(fā)的高膽固醇血癥小鼠血清中膽固醇濃度顯著降低，促進(jìn)膽固醇代謝為膽汁酸[6].

文中主要研究河蜆不同酶解物的抗氧化活性，建立乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞(LO2)損傷模型，并利用此模型評(píng)價(jià)河蜆不同酶解物對(duì)乙醇致LO2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，篩選所得的河蜆酶解物可作為護(hù)肝健康食品中的活性功能因子.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

河蜆干粉購自臺(tái)灣；人正常肝細(xì)胞由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供.

堿性蛋白酶(Alcalase，200 U/mg)、中性蛋白酶(Neutrase，200 U/mg)、木瓜蛋白酶(Papain，600 U/mg)、胰酶(Pancreatin，600 U/mg)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme，30 U/mg)，均由廣州華琪生物科技有限公司提供.

DMEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖溶液，美國Cibco公司生產(chǎn)；胎牛血清，杭州四季青有限公司生產(chǎn)；四氮唑藍(lán)(MTT)、Trolox、熒光素鈉(FL)，美國Sigma公司生產(chǎn)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn).

1.2 儀器與設(shè)備

Synerg Neo2全功能微孔板檢測(cè)儀，美國BioTek公司生產(chǎn)；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡，德國Leica公司生產(chǎn).

1.3 方法

1.3.1 河蜆不同蛋白酶酶解物的制備

蛋白質(zhì)含量測(cè)定參考GB 5009.4—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，采用凱氏定氮自動(dòng)分析儀測(cè)定；

蛋白酶酶解物制備過程如下：河蜆原料→按比例加水勻漿→酶解(酶解過程中兩次調(diào)pH)→滅酶(沸水浴，10 min)→冷卻→離心(8 000 r/min，20 min)→上清液過濾→酶解液濃縮→凍干→酶解物.

采用鄰苯二甲醛(OPA)法測(cè)定各河蜆酶解物的水解度.400 μL 待測(cè)液加入3 mL OPA試劑中，室溫下準(zhǔn)確反應(yīng)2 min，以去離子水調(diào)零后，于340 nm波長測(cè)定吸光值，以去離子水代替樣品液作為對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)溶液為絲氨酸溶液(0.05 g/L).水解度(DH，%)計(jì)算式為

DH=h/htot×100%.

式中，h為蛋白水解后肽鍵的平均數(shù)，htot為每個(gè)蛋白分子的肽鍵總數(shù).5種蛋白酶的酶解條件參數(shù)如表1所示.

1.3.2 酶解物抗氧化能力測(cè)定

(1)酶解物DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考Luo等[7]的方法，并作適當(dāng)修改.2 mL樣品待測(cè)液和2 mL 95%乙醇混合后在測(cè)定波長的吸

表1 5種蛋白酶的酶解條件參數(shù)Table 1 Hydrolysis conditions of 5 kinds of proteases

光值為Aj；在2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)中加入2 mL 樣品，在測(cè)定波長下的吸光值為Ai；對(duì)照樣為2 mL DPPH溶液加2 mL 95%乙醇，在測(cè)定波長下的吸光值為Ac.將待測(cè)溶液避光放置30 min，在517 nm處測(cè)其對(duì)應(yīng)吸光值，樣品對(duì)DPPH的清除率R為

分別測(cè)定50、75、100、125、150 mg/L質(zhì)量濃度下樣品的DPPH自由基清除率，繪制曲線并利用方程計(jì)算不同樣品DPPH自由基清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品的濃度，即為IC50值.

(2)酶解物氧化自由基吸收能力ORAC值測(cè)定

ORAC方法參照Huang等[8]的方法并略有改動(dòng).反應(yīng)于75 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.4)環(huán)境中進(jìn)行，具體操作如下：在96孔板各微孔中分別加入20 μL待測(cè)樣品和Trolox標(biāo)準(zhǔn)液(6.25、12.5、25、50 μmol/L)，每個(gè)孔加入200 μL的熒光素納溶液(0.096 μmol/L)，于37 ℃孵育20 min，迅速在各孔中加入20 μL AAPH溶液(119.4 μmol/L)，在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長538 nm下連續(xù)測(cè)定熒光強(qiáng)度，間隔2 min，測(cè)定90次.繪制Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以Trolox當(dāng)量來表示樣品的ORAC值.

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

LO2細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.3.4 乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷模型的建立

(1)MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

取處于對(duì)數(shù)生長期的LO2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞板中，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入乙醇濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加等量的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)平行，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h.每孔加20 μL MTT 溶液(5 g/L)，于培養(yǎng)箱孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，在490 nm波長下測(cè)各孔的吸光值D(490).計(jì)算不同濃度乙醇處理后各組細(xì)胞的存活率：

(2)ALT和AST酶活性檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長期的LO2細(xì)胞按1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔細(xì)胞板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄上清，實(shí)驗(yàn)組加入1 mL乙醇濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加等量的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h.取培養(yǎng)液以10 000 r/min的速度離心10 min，取上清，按照ALT和AST檢測(cè)試劑盒上方法測(cè)定各自的酶活性，單位用U/L表示.

1.3.5 酶解物的護(hù)肝活性

(1)MTT法評(píng)價(jià)酶解物的護(hù)肝活性

方法步驟同1.3.4節(jié)所述，實(shí)驗(yàn)組更換為不同酶解物，濃度梯度設(shè)為100、200、300、400、500 mg/L，分別計(jì)算各種酶解物在各個(gè)濃度下的細(xì)胞存活率.

酶解物的護(hù)肝活性評(píng)價(jià)：LO2細(xì)胞鋪板步驟同上，鋪板24 h后，實(shí)驗(yàn)組400 mg/L不同酶酶解物預(yù)孵育24 h，模型組加入等量的培養(yǎng)液孵育24 h，棄上清，實(shí)驗(yàn)組加入含有400 mg/L相對(duì)應(yīng)的酶解物和0.8 mol/L 乙醇的培養(yǎng)液，模型組加入0.8 mol/L乙醇的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，空白對(duì)照組始終用培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別計(jì)算各組的細(xì)胞存活率.

(2)ALT和AST酶活性檢測(cè)

將LO2細(xì)胞按1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔細(xì)胞板，接下來的步驟同本節(jié)(1)和1.3.4節(jié)中(2).

1.3.6 分子量分布測(cè)定

分子量分布測(cè)定采用GB/T22729—2008《海洋低聚肽》中的凝膠過濾色譜法.采用的分離柱為TSK Gel G2000 SWXL，流動(dòng)相為45%(體積分?jǐn)?shù))的乙腈水溶液(含0.1%三氟乙酸)，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長為214 nm.

1.3.7 氨基酸組成分析

采用A300自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定樣品氨基酸組成.樣品經(jīng)6 mol/L 鹽酸在110 ℃下水解后用HPLC進(jìn)行分析.測(cè)定條件為:membraPureT259鈉離子交換柱，反應(yīng)器溫度為115 ℃，流動(dòng)相速度為160 μL/min，茚三酮溶液流速為80 μL/min，進(jìn)樣體積為20 μL，在570和440 nm處進(jìn)行檢測(cè).

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 河蜆不同酶解物的水解度

經(jīng)計(jì)算得，河蜆干粉的蛋白質(zhì)含量高達(dá)56.59%±0.50%.如表1所示，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶酶解河蜆?biāo)妹附馕锏乃舛茸罡?，可分別達(dá)到24.23%和24.09%，而木瓜蛋白酶酶解河蜆?biāo)妹附馕锏乃舛茸畹停砻髂竟系鞍酌覆贿m合酶解河蜆蛋白質(zhì).

2.2 河蜆不同酶解物的抗氧化能力

2.2.1 河蜆不同酶解物清除DPPH自由基的活性

DPPH·是一種穩(wěn)定的氮自由基，由于本研究中采用無水乙醇作為溶劑，抗氧化劑與溶劑之間會(huì)產(chǎn)生氫鍵作用力，不利于氫原子的釋放，因此實(shí)驗(yàn)中DPPH自由基清除反應(yīng)是基于ET反應(yīng)機(jī)制[9].經(jīng)計(jì)算得堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物DPPH自由基的IC50分別是104.69±2.05、108.02±0.38、85.31±0.19、112.56±0.11、102.18±3.44 mg/L.同時(shí)由圖1可以看出木瓜蛋白酶的酶解物的DPPH自由基清除能力顯著性的強(qiáng)于其他酶解物(P<0.05).

a、b、c表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.2.2 河蜆不同酶解物的ORAC值

ORAC方法原理是基于偶氮化合物AAPH在O2的作用下產(chǎn)生ROO·，而ROO·與熒光素鈉作用生成沒有熒光的物質(zhì)，使總熒光強(qiáng)度減弱,通過延緩熒光強(qiáng)度衰減的能力評(píng)價(jià)抗氧化活性[10].國際上以Trolox為當(dāng)量表示抗氧化劑的ORAC值，通過設(shè)置不同濃度的Trolox延緩熒光強(qiáng)度衰減，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.355 8x+1.803 1，r2=0.992 3.如圖2所示，胰蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的ORAC值顯著高于其他三者(P<0.05)，表明胰蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物清除過氧自由基的能力強(qiáng)于其他酶解物，且計(jì)算得胰蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的ORAC值分別為(2.54±0.18)和(2.59±0.06) mmol Trolox/g.

a、b、c表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.3 乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷模型的建立

2.3.1 乙醇對(duì)LO2細(xì)胞的毒性作用

采用MTT法檢測(cè)乙醇對(duì)LO2細(xì)胞的毒性作用，如圖3所示，0.4 mol/L乙醇作用24 h后，細(xì)胞存活率已經(jīng)出現(xiàn)顯著性的降低，達(dá)到86%(P<0.05)，而當(dāng)乙醇濃度大于0.6 mol/L時(shí)，LO2細(xì)胞的存活率低于79%(P<0.01)，且呈現(xiàn)出劑量效應(yīng).當(dāng)乙醇濃度達(dá)到0.8 mol/L時(shí)，細(xì)胞存活率接近50%.

2.3.2 乙醇對(duì)LO2細(xì)胞中ALT和AST的影響

乙醇對(duì)肝毒性的體外實(shí)驗(yàn)可直接通過測(cè)量肝細(xì)胞轉(zhuǎn)氨酶釋放到培養(yǎng)基中的水平來完成[11].實(shí)驗(yàn)中用乙醇孵育LO2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)從細(xì)胞質(zhì)釋放到培養(yǎng)基中的ALT和AST量會(huì)隨著乙醇濃度的增加而增加，這與其他人的研究結(jié)果相吻合[12].如表2所示，當(dāng)乙醇的濃度增加到0.8 mol/L及以上時(shí)，培養(yǎng)液中的ALT和AST的活性顯著高于空白組(P<0.01).由此可知，本實(shí)驗(yàn)的乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷模型建立成功，并選擇0.8 mol/L為模型中乙醇的濃度.

相對(duì)于空白對(duì)照組，*—P<0.05,**—P<0.01

Fig.3 Viability of LO2 cells treated with different EtOH concentrations

表2 乙醇對(duì)LO2細(xì)胞中ALT和AST的影響1)

Table 2 Effects of EtOH on ALT and AST contents in LO2 cells

乙醇濃度/(mol·L-1)ALT酶活/(U·L-1)AST酶活/(U·L-1)0.013.21±1.0711.84±2.460.415.77±1.4719.63±0.400.623.86±2.37*19.95±2.040.844.25±0.69**39.40±0.69**1.045.91±3.05**51.16±1.28**

1)相對(duì)于空白對(duì)照組，*—P<0.05，**—P<0.01.

2.4 河蜆酶解物對(duì)LO2細(xì)胞的增殖影響

采用MTT法研究河蜆酶解物對(duì)LO2細(xì)胞生長增殖的影響，結(jié)果如表3所示，其中堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰酶的河蜆酶解物在各個(gè)濃度下的細(xì)胞存活率與空白組相比沒有顯著性差異，說明對(duì)LO2細(xì)胞的增殖沒有影響.而復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的河蜆酶解物在質(zhì)量濃度為100和200 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率顯著性高于空白對(duì)照組(P<0.05)，這是因?yàn)樵撁附馕镏械囊恍┒嚯淖鳛闋I養(yǎng)物質(zhì)被細(xì)胞吸收，從而促進(jìn)了LO2細(xì)胞的增殖.體外多肽促進(jìn)細(xì)胞增殖已有文獻(xiàn)報(bào)道[13].

表3 不同質(zhì)量濃度(100～500 mg/L)酶解物對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響1)Table 3 Effect of the different mass concentrations(100～500 mg/L) of hydrolysates on proliferation of LO2 cells

1)相對(duì)于空白對(duì)照組，*—P<0.05.

2.5 河蜆酶解物對(duì)乙醇致LO2細(xì)胞毒性的影響

研究河蜆酶解物的護(hù)肝活性,MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖4所示，乙醇組細(xì)胞的存活率顯著低于空白組(P<0.05)，而河蜆酶解物組的細(xì)胞存活率比乙醇組顯著增加(P<0.05)，說明河蜆酶解物抑制了乙醇對(duì)LO2細(xì)胞的毒性作用，而其中胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的酶解物組的細(xì)胞存活率也顯著高于其他酶解物組(P<0.05)，證明兩者緩解乙醇致LO2細(xì)胞損傷的能力強(qiáng)，護(hù)肝活性好，而這結(jié)果與各酶解物的ORAC活性強(qiáng)弱一致.乙醇在體內(nèi)代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量的包括O2·-在內(nèi)的ROS，其中CYP2E1催化乙醇代謝為乙醛和乙醛的進(jìn)一步代謝過程是產(chǎn)生O2·-的主要來源，這些自由基可造成DNA損傷、蛋白質(zhì)變性、增加細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化和破壞細(xì)胞內(nèi)氧化平衡等危害，引起氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，酶解物通過清除的自由基，平衡細(xì)胞內(nèi)的氧化與抗氧化體系，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受損傷.而ORAC實(shí)驗(yàn)的實(shí)質(zhì)也是清除過氧自由基，故在理論上解釋了兩者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致性.

相對(duì)于空白對(duì)照組，*—P<0.05;相對(duì)于乙醇組，#&—P<0.05

Fig.4 Effect of different hydrolysates on ethanol-induced LO2 cytotoxicity

2.6 河蜆胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞ALT和AST的影響

ALT和AST作為評(píng)價(jià)對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用的一項(xiàng)指標(biāo)已經(jīng)有研究報(bào)道[14].實(shí)驗(yàn)中選用兩個(gè)對(duì)乙醇致LO2細(xì)胞損傷保護(hù)作用好的酶解物，即胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，由于乙醇對(duì)LO2細(xì)胞的損傷作用，與空白組相比，乙醇組的LO2細(xì)胞向培養(yǎng)液中釋放ALT和AST的顯著性增加，而經(jīng)過酶解物預(yù)孵育后，樣品組培養(yǎng)液中的ALT和AST活性顯著低于乙醇組，說明兩者均可抑制乙醇導(dǎo)致LO2細(xì)胞中ALT和AST的釋放，減緩乙醇對(duì)LO2細(xì)胞的損傷，進(jìn)一步證明河蜆經(jīng)胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解所得的酶解物具有很好的護(hù)肝作用.

相對(duì)于空白對(duì)照組，*—P<0.05;相對(duì)于乙醇組，#—P<0.05

Fig.5 Effect of hydrolysates on the ALT and AST activity in EtOH-induced LO2 cells

2.7 河蜆胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的分子量分布

由表4可得河蜆胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物分子量小于1 000 u的占大部分，其中復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的占比高達(dá)86.93%，這是由于復(fù)合風(fēng)味蛋白酶是外切酶，從肽鏈末端酶切，并且此結(jié)果與復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的較高水解度相符.

表4 河蜆胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的分子量分布

Table 4 Relative molecular weight distribution of Pancreatin and Flavourzyme hydrolysates ofCorbiculafluminea

分子量/u不同酶解物的占比/%胰酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶>300036.513.553000～100010.129.51<100053.3786.93

2.8 河蜆胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的氨基酸組成

上述實(shí)驗(yàn)表明,河蜆由胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解所得酶解物中的活性肽的抗氧化活性和保護(hù)酒精性肝損傷活性優(yōu)于其他，故對(duì)兩者進(jìn)行氨基酸分析.研究表明[15]氨基酸的組成和序列極大地影響著活性肽的活性，且多種氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，組氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等可以螯合金屬離子，本身就具有抗氧化活性；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等疏水性氨基酸的分子結(jié)構(gòu)與表面活性劑類似，具有抑制脂質(zhì)過氧化的能力；酸性氨基酸即天冬氨酸和谷氨酸，其側(cè)鏈羧基具有螯合金屬離子的能力.由表5可知，河蜆由胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解所得酶解物活性肽中，具有抗氧化能力的氨基酸含量分別是50.253%、49.008%，各占到總氨基酸含量的75.69%、75.06%，由此也證明河蜆經(jīng)胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解所得酶解物中的活性肽具備良好的抗氧化活性.

表5 河蜆胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的氨基酸組成

Table 5 Amino acid composition of pancreatin and flavourzyme hydrolysates ofCorbiculafluminea

氨基酸名稱氨基酸含量1)/%胰酶復(fù)合風(fēng)味蛋白酶天冬氨酸8.1947.852蘇氨酸3.5253.422絲氨酸3.6033.511谷氨酸11.01011.032甘氨酸3.4183.452丙氨酸3.8713.927半胱氨酸1.0531.092纈氨酸3.5913.534蛋氨酸1.1581.295異亮氨酸2.8262.768亮氨酸4.8674.442酪氨酸3.6093.484苯丙氨酸3.3913.073組氨酸2.1782.043賴氨酸4.1364.171精氨酸3.7183.883脯氨酸2.2452.311酸性氨基酸19.20518.883抗氧化氨基酸10.2319.692疏水性氨基酸20.81720.433對(duì)抗氧化有貢獻(xiàn)的氨基酸50.25349.008

1)質(zhì)量分?jǐn)?shù).

3 結(jié)論

文中通過實(shí)驗(yàn)研究了河蜆酶解物對(duì)乙醇致LO2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)河蜆不同酶解物均具備一定的DPPH自由基清除能力，且木瓜蛋白酶酶解河蜆?biāo)妹附馕锏那宄芰ψ顝?qiáng)，而胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解物的ORAC值顯著高于其他酶解產(chǎn)物.乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷，導(dǎo)致其細(xì)胞存活率顯著降低，并使得ALT和AST釋放到細(xì)胞外.MTT實(shí)驗(yàn)表明，在300和400 mg/L的質(zhì)量濃度下酶解物對(duì)細(xì)胞的增值無顯著性差異.酶解物預(yù)孵育可降低乙醇對(duì)LO2細(xì)胞的毒性，提高細(xì)胞存活率，其中胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解河蜆?biāo)妹附馕锏男Ч詈?，同時(shí)二者均可抑制乙醇導(dǎo)致的LO2細(xì)胞中ALT和AST的釋放，證明二者可保護(hù)受到乙醇損傷的LO2細(xì)胞.氨基酸組成分析顯示河蜆經(jīng)胰酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶酶解所得活性肽中，對(duì)抗氧化有貢獻(xiàn)的氨基酸分別占總氨基酸量的75.69%、75.06%.文中結(jié)論為開發(fā)河蜆護(hù)肝產(chǎn)品提供了理論支撐.

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