趙海鋒 盧敏 周永婧 陽(yáng)輝蓉 孟赫誠(chéng)

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東 廣州 510640)

啤酒是一種低酒精度發(fā)酵酒,含有各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),成分均衡,適度飲用有益于健康[1- 2].傳統(tǒng)的啤酒釀造是常濃釀造,現(xiàn)在的啤酒生產(chǎn)企業(yè)則主要采用高輔料釀造和高濃釀造技術(shù)[3].高濃釀造技術(shù)的應(yīng)用可以降低生產(chǎn)成本、提高設(shè)備利用率,改善啤酒風(fēng)味，但同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一系列的問題,例如高滲透壓、高酒精毒性會(huì)使酵母的生長(zhǎng)代謝受到影響,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏(主要是氮源)會(huì)阻礙酵母的生長(zhǎng),使發(fā)酵延緩甚至停滯,從而影響啤酒發(fā)酵[4].而在提高酵母生長(zhǎng)代謝和發(fā)酵效率的各種方法中,氮源補(bǔ)充被認(rèn)為是最有效的方式.Vu等[5]發(fā)現(xiàn)添加0.25%的酵母抽提物和0.8%的吐溫80可以縮短發(fā)酵時(shí)間和提高乙醇產(chǎn)量.Kitagawa等[6]證實(shí)了大豆肽的添加可以提高酵母的抗凍壓力,使得酵母更能忍受低溫環(huán)境,但是大豆肽影響酵母生長(zhǎng)代謝的機(jī)制還不明確.Kemsawasd等[7]發(fā)現(xiàn)氮源對(duì)酵母生長(zhǎng)代謝的影響是有菌株特異性的,不同酵母影響也不同.文中研究了超高濃釀造中小麥面筋蛋白水解物的水解度和添加量對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵性能的影響,以期探討釀酒酵母對(duì)小分子肽的吸收和代謝機(jī)制,并拓展小麥面筋蛋白的應(yīng)用范圍.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

釀酒酵母(Saccharomycespastorianus) FBY0095，華南理工大學(xué)食品生物技術(shù)研究室保藏;小麥面筋蛋白(蛋白含量76.1%)，安徽瑞福祥食品有限公司提供;胰酶(酶活力2.7×107U/g)，重慶市全新祥盛生物制藥有限公司提供;大麥芽、60 °P高濃麥葡糖漿,廣州珠江啤酒有限公司提供;其他試劑均為分析純.

冷凍離心機(jī),3-18K,德國(guó)Sigma公司出品;全自動(dòng)糖化儀,杭州博日科技有限公司出品;高效液相色譜儀,Waters2695,美國(guó)Waters公司出品;低溫培養(yǎng)箱,LRN-250CL,上海一恒科技有限公司出品;紫外分光光度計(jì),UV-721,上海精密科學(xué)儀器儀表有限公司出品.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

小麥面筋蛋白水解物的制備:參照萬(wàn)春艷[8]制備大豆分離蛋白水解物的方法并加以改進(jìn),其中蛋白與水配比為1∶10(質(zhì)量體積比(g/mL)),調(diào)pH至9.0,胰酶添加量為蛋白質(zhì)量的1%.

麥汁制備、酵母活化和擴(kuò)培:參照萬(wàn)春艷等[9- 11]的方法,使20 °P麥汁的游離氨基氮(FAN)的含量控制在180 mg/L.

酵母發(fā)酵:將不同酶解時(shí)間的水解物分別添加至麥芽汁培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)組,不添加水解物的作為空白對(duì)照組(CK),調(diào)pH至5.5，高壓滅菌后,按每升培養(yǎng)基6.8 g酵母泥接入擴(kuò)培后的酵母,在12 ℃的培養(yǎng)箱發(fā)酵,厭氧,隔天搖瓶.

1.3 分析方法

1.3.1 水解度(DH)測(cè)定

參照王劍鋒等[12- 14]的水解度測(cè)定方法測(cè)水解度.

1.3.2 酵母增殖和發(fā)酵性能指標(biāo)測(cè)定

參照宗緒巖等[15- 16]的發(fā)酵過程各指標(biāo)測(cè)定方法測(cè)量乙醇、表觀發(fā)酵度、發(fā)酵液降糖、生物量等.

1.3.3 游離氨基氮的測(cè)定

采用茚三酮比色法,樣液稀釋100至200倍,在1、2號(hào)玻璃試管中加入2 mL的蒸餾水,2、4號(hào)試管中加入2 mL甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)液,其余試管則加入稀釋后的樣液,然后各試管中加入1 mL的發(fā)色劑,加玻璃珠,蓋上螺帽,將試管放于沸水浴中,精確反應(yīng)16 min,在20 ℃的水浴中冷卻20 min,再各加入稀釋劑5 mL,充分混勻.用空白液管(1、2 號(hào)試管)調(diào)節(jié)分光光度計(jì)零點(diǎn),于570 nm 下測(cè)定吸光值,盡量在30 min內(nèi)測(cè)完.

FAN含量(mg/L)=樣液吸光值×2(mg/L)×稀釋倍數(shù)/甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值

FAN含量消耗率(%)=(FAN初始量-FAN最終量)/FAN初始量×100%

稱取0.107 2 g甘氨酸用水溶解,定容至100 mL,從中取1 mL用水稀釋至100 mL,即為甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)液,游離氨基酸質(zhì)量濃度為2 g/L.

發(fā)色劑的制備：取10.0 g Na2HPO4·12H2O、6.0 g KH2PO4、0.5 g茚三酮、0.3 g果糖溶于 100 mL 去離子水.

稀釋劑的制備：稱取碘酸鉀2 g溶于600 mL水中,加入96%(體積分?jǐn)?shù))乙醇400 mL.

1.3.4 小麥面筋蛋白水解物分子量分布的測(cè)定

高效液相色譜法,參照莫芬等[17]的方法測(cè)定.色譜柱：TSK gel 2000SXL凝膠柱，7.8 mm×300 mm；預(yù)柱：C18；柱溫：30 ℃.流動(dòng)相：100%磷酸鹽緩沖液(pH 7.2);流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；洗脫時(shí)間：20 min.檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm.

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值作為最終結(jié)果，用Origin 8.0和Excel 軟件數(shù)據(jù)作圖處理,利用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異顯著.

2 結(jié)果與討論

2.1 小麥面筋蛋白胰酶酶解過程中水解度的變化

小麥面筋蛋白可以被不同種類的蛋白酶酶解得到水解物,前期的研究發(fā)現(xiàn)[18],胰酶處理過的小麥面筋蛋白水解物具有良好的生理活性,所以文中選擇胰酶水解小麥面筋蛋白.酶解過程中水解度的變化如圖1所示.酶解的36 h內(nèi),水解度在6.8%～22.4%之間變化.前24 h隨著時(shí)間的增加水解度不斷增大,在24 h時(shí)水解度達(dá)到了22.4%,但是在24～36 h間水解度基本趨于穩(wěn)定,酶解36 h時(shí)水解度為21.7%.隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物濃度變小,可以被胰酶水解的肽鍵數(shù)目逐漸減少,同時(shí)酶活力也逐漸下降,因此隨著時(shí)間的延長(zhǎng),在24～36 h之間水解度并無(wú)顯著變化.

不同字母表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異

Fig.1 Changes in degree of hydrolysis of wheat gluten protein treated by pancreatic enzymes

不同水解度的酶解液中肽的分子量分布也不同,結(jié)果如表1所示.隨著水解度的增大,各水解物中10 ku的大分子肽類物質(zhì)逐漸減少,被水解成小分子肽或氨基酸,3 ku以下的多肽則逐漸增加,所占比例最多,從最初的32.8%到最終的62.7%.水解度為22.4%的酶解液中小分子肽最多,而酶解至36 h時(shí),水解度和小分子肽含量均未進(jìn)一步增大和提高.

表1 不同DH的水解物中肽的分子量分布

Table 1 Molecular weight distribution of hydrolysates with different DH

水解物編號(hào)DH/%基于分子量的肽的分布/%>10ku5～10ku3～5ku<3kuWG26.7923.7621.4022.0232.82WG49.0411.4218.8225.0844.68WG812.326.1315.7626.7551.36WG1215.744.3513.8926.8754.89WG2422.451.749.4826.0762.71WG3621.731.869.8126.0262.31

2.2 不同水解度的小麥面筋蛋白水解物對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

將不同水解度的酶解物以1%的量添加到20 °P的超高濃麥汁中進(jìn)行酵母發(fā)酵,觀察其對(duì)酵母生長(zhǎng)和活性的影響,結(jié)果見圖2.水解度在6.8%～22.4%之間時(shí),隨著水解度的增大,酵母凈增長(zhǎng)量也增大,水解度22.4%組的酵母細(xì)胞凈增長(zhǎng)量為6.0 g/L,達(dá)到最大值,說(shuō)明酶解物的促酵母生長(zhǎng)作用與其水解度有一定的相關(guān)性.發(fā)酵結(jié)束后,發(fā)酵液中酵母活性均保持在85%以上,其中WG24組的酵母活性明顯高于其他組,達(dá)到94.8%.

不同字母表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異

圖2 不同DH的小麥面筋蛋白水解物對(duì)酵母增殖和活性的影響

Fig.2 Effect of wheat gluten protein hydrolysates with different DH on the proliferation and viability of brewer’s yeast

小麥面筋蛋白水解后的主要物質(zhì)是肽類物質(zhì),而肽類物質(zhì)的生理活性與其分子量的大小有關(guān).小麥面筋蛋白水解物中3 ku以下的多肽所占比例最多,說(shuō)明對(duì)促進(jìn)酵母生長(zhǎng)起主導(dǎo)作用的是小分子肽,與以往研究得出的結(jié)論一致.已有研究證實(shí)了有生理活性的主要是小分子肽,Zhao等[19]發(fā)現(xiàn)3 ku以下的大豆肽能顯著促進(jìn)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)與代謝.張清麗[20]發(fā)現(xiàn)3 ku以下的酪蛋白活性肽對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)代謝及乳酸發(fā)酵有很好的促進(jìn)作用.以上結(jié)果說(shuō)明，水解度為22.4%的小麥面筋蛋白酶解物的促酵母生長(zhǎng)效果最好,因此最佳的酶解時(shí)間為24 h.

2.3 小麥面筋蛋白水解物(WG24)添加量對(duì)酵母生長(zhǎng)代謝的影響

將酶解24 h得到的小麥面筋蛋白水解物以不同的量添加至培養(yǎng)基中，觀察酵母的生長(zhǎng)代謝.從圖3中的生物量曲線圖可以看出,酵母生長(zhǎng)經(jīng)過了延滯期和對(duì)數(shù)期后第8天生物量達(dá)到最大,經(jīng)過了兩天的穩(wěn)定期后進(jìn)入了衰亡期,細(xì)胞逐漸自溶,生物量降低.在第23天時(shí)最大生物量的WG1.0%組為6.4 g/L,對(duì)照組生物量最少為5.5 g/L,4組樣的最大凈增長(zhǎng)量與最大生物量結(jié)果一致,均為WG1.0%組>WG2.0%組>WG0.1%組>對(duì)照組,相比之下,添加1.0%的水解物對(duì)酵母的促生長(zhǎng)效果最好.這印證了上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,即水解物的添加可以促進(jìn)酵母生長(zhǎng),但是其促進(jìn)作用并不總隨著水解物添加量的增大而增加,過多的水解物在一定程度上會(huì)抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng),抑制原因尚待進(jìn)一步探究.

圖3 小麥面筋蛋白水解物添加量對(duì)釀酒酵母增殖的影響

Fig.3 Effect of wheat gluten protein hydrolysates with different amounts on proliferation of brewer’s yeast

2.4 小麥面筋蛋白水解物添加量對(duì)酵母發(fā)酵性能的影響

游離氨基氮(FAN)是麥汁中能夠被酵母直接利用的含氮物質(zhì),主要是游離氨基酸和銨離子以及小分子肽(二肽和三肽),酵母的生長(zhǎng)代謝伴隨著氮源的吸收利用[21].從圖4可知,20 °P的超高濃麥汁最初FAN含量是180 mg/L左右,添加不同量的小麥面筋蛋白水解物(WG24)后,FAN含量均有不同程度提高,WG0.1%組的最初FAN是200 mg/L,而WG1.0%和WG2.0%組的FAN含量分別是390和580 mg/L,充足的氮源可以保證酵母細(xì)胞的快速生長(zhǎng),從而有利于啤酒的發(fā)酵.在發(fā)酵前12 d,酵母細(xì)胞大量生長(zhǎng)繁殖,伴隨著氮源物質(zhì)的大量消耗,而前2 d的FAN下降速度相對(duì)較快,12 d之后,FAN含量又有小幅度的上升,然后趨于平穩(wěn).這是因?yàn)殡S著發(fā)酵的進(jìn)行,在后期由于乙醇的大量產(chǎn)生和其他產(chǎn)物的積累,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用,從而使其自溶,胞內(nèi)的氮類物質(zhì)進(jìn)入發(fā)酵液中,FAN含量小幅地上升[22].發(fā)酵結(jié)束后,各組殘留FAN含量不同,并不是所有的氮源都能被吸收利用,有些多肽類氮源要用于穩(wěn)定啤酒的泡沫和多肽類復(fù)雜物質(zhì)的代謝合成[23].各組的FAN利用率分別是71%、60%、47%和41%,說(shuō)明初始FAN含量越低,利用量越少,但是利用率卻越高.WG1.0%組添加了水解物后FAN含量比對(duì)照組增加了200 mg/L,結(jié)束時(shí)FAN消耗比對(duì)照組多50 mg/L,說(shuō)明水解物在高濃麥汁中能被酵母有效的利用25%,WG2.0%組也有同樣的結(jié)果.

圖4 小麥面筋蛋白水解物添加量對(duì)釀酒酵母發(fā)酵利用FAN的影響

Fig.4 Effects of wheat gluten hydrolysate with different amounts on FAN utilization rate of brewer’s yeast

在釀酒酵母生長(zhǎng)代謝的過程中不僅有氮源物質(zhì)的消耗吸收,同時(shí)也伴隨著糖的吸收利用,如圖5所示.在20 °P的超高濃麥汁發(fā)酵中,4組最初的糖度基本一致,隨著酵母的生長(zhǎng)繁殖,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗,在前4天,4組的降糖速率差距不大,而從第4天到第12天之間,各自的耗糖速度出現(xiàn)差異,WG2.0%組最慢,發(fā)酵12天之后,酵母停止生長(zhǎng),糖度基本保持穩(wěn)定.此時(shí),WG1.0%組的表觀發(fā)酵度達(dá)到了84%,WG0.1%組的發(fā)酵度則是82%左右,對(duì)照組也發(fā)酵結(jié)束,達(dá)到了80%,但是WG2.0%組卻只有76%,氮源的充足可以使酵母快速生長(zhǎng)繁殖,大量消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),但是過量的氮源在某種程度上又會(huì)抑制酵母的生長(zhǎng),所以氮源的適量補(bǔ)充是很有必要的.

圖5 小麥面筋蛋白水解物添加量對(duì)釀酒酵母降糖的影響

Fig.5 Effects of wheat gluten hydrolysate with different amounts on sugar consumption of brewer’s yeast

酵母細(xì)胞吸收氮源和糖類以及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過程中,一部分用于自身的繁殖,另一部分則用于乙醇以及其他高級(jí)醇和酯類等風(fēng)味物質(zhì)的合成.發(fā)酵過程中的乙醇含量如圖6所示,在酵母生長(zhǎng)的前12 d內(nèi),乙醇含量逐漸增加,之后發(fā)酵結(jié)束,乙醇含量保持恒定.在乙醇生成的整個(gè)過程中,WG1.0%組的乙

圖6 小麥面筋蛋白水解物的添加量對(duì)釀酒酵母乙醇生成的影響

Fig.6 Effects of wheat gluten hydrolysate with different amounts on ethanol yield of brewer’s yeast

醇含量始終是4組中最高的,達(dá)7.6%之多,比乙醇含量最少的對(duì)照組提高了15%,而WG0.1%和WG2.0%組的乙醇含量相對(duì)于對(duì)照組也有一定的提高.綜合以上結(jié)果,可以得出小麥面筋蛋白水解物的最適添加量為1.0%(見表3).這進(jìn)一步說(shuō)明了小麥蛋白水解物在超高濃度麥汁中能夠有效促進(jìn)釀酒酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵,是啤酒釀造的一種有效氮源.

表3 添加1.0%的小麥蛋白水解物對(duì)釀酒酵母發(fā)酵性能的影響

Table 3 Effects of 1.0% wheat gluten hydrolysates on fermentation performance of brewer’s yeast

項(xiàng)目發(fā)酵周期/d凈增長(zhǎng)量/(g·L-1)表觀發(fā)酵度/%終殘?zhí)?°PFAN利用量/(mg·L-1)乙醇產(chǎn)量/%對(duì)照組125.81803.72131.06.6WG1.0%126.08843.02185.07.6變化率/%04.6523.2041.215.2

3 結(jié)語(yǔ)

小麥面筋蛋白水解物在20 °P的超高濃麥汁中對(duì)釀酒酵母的增殖、活性保持以及發(fā)酵代謝具有促進(jìn)作用,在啤酒發(fā)酵中可作為酵母的有效氮源.胰酶處理小麥面筋蛋白時(shí),其中水解度達(dá)22.4%的水解物添加量為1.0%時(shí)對(duì)酵母的促進(jìn)效果最佳,可使酵母活性達(dá)94.8%,殘?zhí)橇拷档?3.2%,乙醇產(chǎn)量提高15.2%.文中的研究明確了小麥面筋蛋白水解物對(duì)于提高酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵性能的作用,在啤酒生產(chǎn)中有潛在的應(yīng)用價(jià)值和指導(dǎo)意義.

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