李素一,池洪樹,陳 斌,張曉佩,許斌福

愛德華氏菌屬(Edwardsiella)為腸桿菌科革蘭氏陰性桿菌,是人獸共患的重要致病菌,傳統(tǒng)上分為遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、鯰魚愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)和?？茞鄣氯A氏菌(Edwardsiellahoshinae)3個種[1-2]。其中,遲緩愛德華氏菌和鯰魚愛德華氏菌是水產(chǎn)動物的主要致病菌,?？茞鄣氯A氏菌是鳥類和爬行動物的致病菌。鯰魚愛德華氏菌只感染魚類,可引起鯰魚的腸道敗血癥。而遲緩愛德華氏菌 (E.tarda) 具有廣泛的宿主適應性,能感染淡水海水養(yǎng)殖魚類、爬行動物、兩棲動物和哺乳類等多種動物;流行性廣、易暴發(fā)、危害大,是水產(chǎn)上常見的致病菌[3-4]。魚類遲緩愛德華氏菌是大菱鲆、鰻鱺等多種重要經(jīng)濟魚類的首要病原之一,一旦暴發(fā)感染往往導致魚類的大量死亡,危害極其嚴重[5-6];同時該菌也可感染人類,引起細菌性胃腸炎、腹瀉、敗血癥等,威脅著人類的公共衛(wèi)生安全[7-8]。愛德華氏菌分布廣泛,宿主多樣,因此多樣性分析對了解愛德華氏菌菌群的種屬關(guān)系或變異情況、掌握其流行規(guī)律、研發(fā)疫苗、制定精準的免疫防控策略具有重要的指導意義。遲緩愛德華氏菌的分型傳統(tǒng)上以生理生化和血清分型為主,隨著基因測序技術(shù)的產(chǎn)生,16S rRNA、hsp60等基因測序分析的方法逐步應用到遲緩愛德華氏菌的鑒定與分型中。傳統(tǒng)的血清型分析主要是基于菌體表面抗原與特異性血清抗體發(fā)生凝集反應來進行鑒定分型,具有特異、靈敏、快速、簡便的優(yōu)點,但存在無法精準對遲緩愛德華氏菌進行鑒定與分型的局限。例如陳翠珍[9]用菌體-血清凝集的方法對130株分離自牙鲆的遲緩愛德華氏菌分離株進行血清分型,結(jié)果表明均為同種血清型。研究表明,16S rRNA在漫長的進化史中高度保守,被稱為是細菌進化的分子鐘,聯(lián)合hsp60等基因測序?qū)t緩愛德華氏菌進行分子層面分型分析的方法具有更高的種間與種內(nèi)分辨率,能補充利用血清學分型方法的不足。本研究對本室近年來分離保存和收集的來源于我國華東地區(qū)(福建、山東、浙江)與華南的廣東地區(qū)的17株遲緩愛德華氏菌進行多樣性分析,以期為遲緩愛德華氏菌的區(qū)系劃分提供參考,為遲緩愛德華氏菌疫苗的開發(fā)設(shè)計和免疫防控策略制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 愛德華氏菌菌株 本研究所用的愛德華氏菌菌株信息如表1所示,其中17株由本室保存的遲緩愛德華氏菌分離株來自我國華東地區(qū)(福建、浙江、山東)及華南地區(qū)(廣東),其中12株遲緩愛德華氏菌分離自鰻鱺(包括歐洲鰻鱺、日本鰻鱺、花鰻鱺),4株分離自大菱鲆,1株分離自鱖魚。

1.1.2 主要試劑及材料 細菌培養(yǎng)基TSB、TSA購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,細菌DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技有限公司,PCR引物由上海生工有限公司合成,PCR克隆試劑盒(Ex Taq酶、dNTP等)、PMD18-T克隆載體購自大連寶生物工程有限公司(Takara),宿主菌Escherichiacoli(DH5α)由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 細菌復蘇鑒定及基因組DNA提取 復蘇保存于-80 ℃菌株,在TSA平板上劃線,28 ℃培養(yǎng)36 h,挑取單菌落于10 mL TSB培養(yǎng)液,在28 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)過夜。按1%接種于新的10 mL TSB培養(yǎng)液,培養(yǎng)至OD600≈1.0。利用API-20E生化鑒定系統(tǒng)再次對標本遲緩愛德華氏菌分離株進行生化鑒定,確定為遲緩愛德華氏菌后,用于后續(xù)試驗。收集5 mL細菌培養(yǎng)液,用天根細菌DNA提取試劑盒(DP304-03)按操作說明提取菌株基因組DNA,作為PCR擴增的模板。其余5 mL培養(yǎng)液在10 000 r/min條件下常溫離心5 min收集菌體,用1 mol/L PBS(pH7.0)洗滌,再次10 000 r/min條件下常溫離心5 min后用1 mol/L PBS(pH7.0)重懸,制備濃度為3×108CFU/mL的菌液,用于菌體-血清凝集試驗。

1.2.2 血清型分析 參考許斌福等[10]的方法分別制備了遲緩愛德華氏菌ATCC15947、ETY及鯰魚愛德華氏菌EIV的兔抗O血清。參考陳斌[11]等的方法,將1.2.1所制備的遲緩愛德華氏菌菌液加入96孔微孔板,每孔25 μL,分別加入同體積倍比稀釋的ATCC15947、EIV、ETY 3種愛德華氏菌兔抗O血清以及正常兔血清并混勻,試驗設(shè)3組重復,在37 ℃條件下靜置溫育30 min后觀察凝集結(jié)果。

1.2.3 PCR擴增16S rRNA與hsp60基因序列 利用細菌16S rRNA (16S small subunit ribosomal RNA)基因通用引物及參照NCBI基因庫中的hsp60 (heat shock protein 60)基因序列,設(shè)計引物擴增遲緩愛德華氏菌的16S rRNA及hsp60基因部分序列。根據(jù)Ex Taq(Takara)試劑盒使用說明配制PCR反應體系,進行PCR擴增。16S rRNA產(chǎn)物預期大小為1 508 bp,hsp60基因產(chǎn)物預期大小約1 099 bp。本研究使用的引物及產(chǎn)物大小如表2所示。

表2 16S rRNA及hsp60基因引物

PCR反應體系(50 μL):10×Ex Taq Buffer 5 μL,dNTP Mixture (10 mmol/L) 4 μL,Ex Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 1 μL,上下游引物(10 mmol/L) 各1 μL,模板1 μL,ddH2O 37 μL。

16S rRNA的PCR反應程序為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min ,72 ℃ 1 min,30個循環(huán);72 ℃ 10 min。hsp60的PCR反應程序為:94 ℃ 5 min ;94 ℃ 1 min,51 ℃ 1 min ,72 ℃ 1 min,30個循環(huán);72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收PCR產(chǎn)物,與PMD18-T克隆載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α,經(jīng)PCR驗證具有插入片段的陽性質(zhì)粒送Takara公司測序,取3次平行測序結(jié)果一致的序列為最終序列,提交到GenBank,獲得序列登錄號(表4)。

1.2.4 序列分析與系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 將所得的16S rRNA及hsp60序列,在NCBI上BLAST比對分析。16S rRNA序列和hsp60序列集合分別使用MEGA11進行1 000次Bootstrap采樣及多序列比對,并構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1 血清型分析 菌體凝集試驗顯示(表3),分離自浙江的日本鰻鱺遲緩愛德華氏菌ETY的抗O血清能與大部分魚源遲緩愛德華氏菌發(fā)生凝集反應,其中包括分離自山東地區(qū)大菱鲆的所有遲緩愛德華氏菌分離株;與分離自福建地區(qū)日本鰻鱺的ET080511的凝集效價最高,為212,但不與人源遲緩愛德華氏菌ATCC15947凝集。ATCC15947作為人源遲緩愛德華氏菌標準株,其抗O血清除了能凝集本菌外,僅與魚源遲緩愛德華氏菌WY37產(chǎn)生效價較低的凝集反應。鯰魚愛德華氏菌EIV的抗O血清只能與自身EIV菌株發(fā)生凝集,無法與其他任何魚源或人源的遲緩愛德華氏菌發(fā)生凝集。

表3 各菌株與3種抗O血清的凝集結(jié)果

2.2 基于16S rRNA及hsp60序列的遺傳進化分析 將PCR擴增獲得的ET0898等17株遲緩愛德華氏菌及鯰魚愛德華氏菌EIV的16S rRNA序列及hsp60序列上傳至NCBI,獲得基因序列號,并在GenBank中與已知的相關(guān)序列進行比對分析,同時從NCBI下載?？茞鄣氯A氏菌屬(E.hoshinae)ATCC35051、及大腸桿菌BCE049的16S rRNA與hsp60序列作為構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的參照(表4)。一共21個16S rRNA及hsp60序列用于構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表4 用于構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的菌株16S rRNA及hsp60

基于16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖1顯示,絕大部分魚源遲緩愛德華氏菌進化同源性較高,其中來源于山東大菱鲆的遲緩愛德華氏菌分離株聚為一支;來源于福建的遲緩愛德華氏菌ET0898、ET080814、ET080813、ET080511、ET030908、JS60516NA2、來源于浙江的遲緩愛德華氏菌ETY、來源于山東的遲緩愛德華氏菌EIB202、LTB4、WY28、WY37及來源于廣東的遲緩愛德華氏菌GhAn080310 brainA、GhAn080313 kidneyA、GhAn080314 kidneyA相聚類;來源于福建的AL60306NA1與來源于廣東的E29L、GK4及人源遲緩愛德華氏菌ATCC15947相聚,而鯰愛德華氏菌EIV及?？茞鄣氯A氏菌ATCC35051與魚源遲緩愛德華氏菌有一定的進化距離。

注:從左到右排列依次是菌株名稱、宿主來源、分離地區(qū)。

圖2顯示,基于hsp60部分序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)果顯示:6株來源于福建的遲緩愛德華氏菌(ET0898、ET080814、ET080813、ET080511、ET030908、JS60516NA2)、1株來源于浙江的遲緩愛德華氏菌ETY、4株來源于山東的遲緩愛德華氏菌(EIB202、LTB4、WY28、WY37)及3株來源于廣東的遲緩愛德華氏菌(GhAn080310 brainA、GhAn080313 kidneyA、GhAn080314 kidneyA)相聚類。來源于福建的遲緩愛德華氏菌AL60306NA1與來源于廣東的遲緩愛德華氏菌E29L、GK4及人源遲緩愛德華氏菌ATCC15947相聚。這兩個結(jié)果與16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進化樹一致。有差異的是,鯰魚愛德華氏菌EIV與遲緩愛德華氏菌GK4聚為一支。此外,?？茞鄣氯A氏菌ATCC35051與所有的遲緩愛德華氏菌及鯰魚愛德華氏菌顯示出明顯的進化差距。

注:從左到右排列依次是菌株名稱、宿主來源、分離地區(qū)。

3 討 論

遲緩愛德華氏菌是全球范圍內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)最重要致病菌之一,具有廣泛的表型和遺傳多樣性[12-13]。隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的蓬勃發(fā)展,不同區(qū)域和宿主來源的遲緩愛德華氏菌分離株也在不斷增加[14],對遲緩愛德化氏菌分離株進行多樣性分析既有助于推進愛德華氏菌的流行病學研究,又為疫苗開發(fā)提供依據(jù)。

細菌菌體O抗原與血清的凝集反應操作簡便、敏感性高,是常用于判定細菌血清型的基本分型方法[15]。細菌菌體O抗原是由多糖重復單元構(gòu)成的多聚糖,具有多樣性,基于O抗原的細菌血清凝集方法是劃分細菌血清型的主要標準。本研究前期制備了遲緩愛德華氏菌ETY、ATCC15947及鯰魚愛德華氏菌EIV的菌體O抗原及抗O血清,利用三種抗愛德華氏菌抗O血清與標本遲緩愛德華氏菌進行凝集反應,初步判斷遲緩愛德華氏菌分離株的血清學類型。凝集試驗結(jié)果顯示,分離自我國華東與華南地區(qū)的的大部分遲緩愛德華氏菌O抗原血清型相似,但遲緩愛德華氏菌福建株AL60306NA1和廣東株E29L與三種菌體O抗原均不發(fā)生凝集,說明魚源遲緩愛德華氏菌存在不同的血清型。魚源遲緩愛德華氏菌(ETY)兔抗O血清可與大部分魚源遲緩愛德華氏菌菌體發(fā)生凝集反應,不與人源遲緩愛德華氏菌(ATCC15947)菌體發(fā)生凝集反應,人源遲緩愛德華氏菌(ATCC15947)兔抗O血清與大部分的魚源遲緩愛德華氏菌菌體不發(fā)生凝集反應,說明魚源和人源的遲緩愛德華氏菌存在血清型差異。鯰魚愛德華氏菌兔抗O血清不與遲緩愛德華氏菌菌體發(fā)生凝集反應,說明愛德華氏菌種間差異明顯。

16S rRNA由于高度保守、易于分析,常用于細菌的分子鑒定與分型,以補充常規(guī)細菌鑒定或分類的不足。蔣德明等[16]通過對15株粘細菌的16S rRNA序列的系統(tǒng)進化關(guān)系的分析表明,在形態(tài)上差異較小的菌株,在16S rRNA上的同源性差異卻較大,最大差異達到了4.4%;另外根據(jù)形態(tài)歸為同一個屬不同種的菌株,它們的16S rRNA同源性卻在99%以上。目前一些重要的水產(chǎn)致病菌例如創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、假單胞菌等也常用16S rRNA序列的聚類分析來進行分子鑒定和分型[17-18]。熱休克蛋白hsp60是另一類高度保守的持家基因,同時具有比16S rRNA更豐富的多變性,已被證明在分類學上的分辨率鑒定及近緣細菌間的系統(tǒng)發(fā)育分析優(yōu)于16S rRNA[19]。因此學者們通常聯(lián)合16S rRNA及hsp60聚類結(jié)果,進行細菌的親緣進化關(guān)系及分類分析[20-21]。為進一步對標本愛德華氏菌進行分子系統(tǒng)進化性的分析,本研究克隆并測序標本遲緩愛德華氏菌的16S rRNA與熱休克蛋白基因hsp60部分基因序列,構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹。

基于16S rRNA及hsp60部分基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹結(jié)果一致顯示,絕大部分魚源遲緩愛德華氏菌分離株進化同源性較高。人源的遲緩愛德華氏菌分離株ATCC15947與以上魚源遲緩愛德華氏菌有一定的進化距離,但與來源于福建的魚源遲緩愛德華氏菌AL60306NA1(16S rRNA系統(tǒng)進化樹中)或與來源于廣東的魚源遲緩愛德華氏菌E29L(hsp60系統(tǒng)進化樹中)相聚,說明不同種屬來源的遲緩愛德華氏菌存在一定的親緣關(guān)系。同時,AL60306NA1與E29L在菌體-血清凝集試驗中顯示不與3種血清中的任何一種凝集,說明AL60306NA1與E29L血清型與其他魚源遲緩愛德華氏菌不同。

另外,在16SrRNA系統(tǒng)進化樹中,來源于廣東的魚源遲緩愛德華氏菌GK4、E29L及來源于福建的魚源遲緩愛德華氏菌AL60306NA1與人源遲緩愛德華氏菌ATCC15947聚類;在hsp60系統(tǒng)進化樹中,GK4、E29L、AL60306NA1顯示與人源遲緩愛德華氏菌ATCC15947及人源鯰魚愛德華氏菌EIV聚類。但在菌體-血清凝集實驗中,E29L與AL60306NA1均不與3種抗O血清反應,而GK4與遲緩愛德華氏菌ETY的抗O血清有凝集反應。以上結(jié)果說明作為人獸共患菌株,愛德華氏菌菌株可能通過食物鏈等在水產(chǎn)動物與人之間交叉?zhèn)魅綶22-23]。同時說明遲緩愛德華氏菌的血清分型與分子系統(tǒng)進化分析結(jié)果不具有絕對的相關(guān)性。這提示要更好地防控愛德華氏菌,不僅要進行分子層面的聚類分析,還應結(jié)合對菌體表面抗原的免疫原性等進行必要分析。

利益沖突：無

引用本文格式：李素一,池洪樹,陳斌,等.我國華東與華南地區(qū)養(yǎng)殖魚類遲緩愛德華氏菌分離株的多樣性分析[J].中國人獸共患病學報,2024,40(2):147-153. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.022