童 武，李國新，鄭 浩，劉 飛，梁 超，田 青，李 林，曹艷云，武吉強，王 濤，鄭旭晨，單同領(lǐng)，童光志

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241； 2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,揚州 225009 ）

·研究論文·

豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）最小免疫劑量測定

童 武1,2，李國新1,2，鄭 浩1,2，劉 飛1，梁 超1，田 青1，李 林1，曹艷云1，武吉強1，王 濤1，鄭旭晨1，單同領(lǐng)1,2，童光志1,2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241； 2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,揚州 225009 ）

為了確定豬偽狂犬病基因缺失滅活疫苗（PRV JS-2012-△gI/gE株）的最小免疫劑量，本研究將25頭14日齡仔豬（豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型病原抗體均為陰性）隨機分成5組，每組5頭。第1～4組分別接種豬偽狂犬病滅活疫苗（PRV JS-2012-△gI/gE株）0.5、1、2、3 mL/頭，免疫28 d后各組參照第1次免疫的劑量分別加強免疫1次，第5組實驗豬不做處理作為陰性對照。免疫后，每周采集各組豬血清檢測抗體水平。待第2次免疫28 d后，5組實驗豬均滴鼻接種PRV JS-2012株第5代強毒2 mL， 含病毒105.0TCID50/頭。結(jié)果表明：第1次免疫后14 d，第2～4組豬 PRV gB 抗體全部轉(zhuǎn)為陽性，而第1組豬在第1次免疫后21 d全部轉(zhuǎn)陽。攻毒后，第1組有1頭豬發(fā)病，表現(xiàn)精神沉郁、厭食和輕微神經(jīng)癥狀，其余4頭豬有一過性的發(fā)熱，無任何其他異常臨床表現(xiàn)，保護率為80%；第2～4組，實驗豬只有一過性的發(fā)熱，無任何其他異常臨床表現(xiàn)，保護率為100%；第5組豬在攻毒后48 h，體溫迅速上升到41℃以上，并表現(xiàn)為明顯的精神沉郁、厭食和神經(jīng)癥狀，發(fā)病率為100%，死亡率為40%。由此確定豬偽狂犬病滅活疫苗（JS-2012-△gI/gE株）最小免疫劑量為1 mL/頭。

偽狂犬病毒；滅活疫苗; 最小免疫劑量

豬偽狂犬病是影響我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要傳染性疾病之一，由偽狂犬病毒感染（Pseudorabies virus，PRV）引起的，以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征[1]。不同年齡段的豬都可感染，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率，及種豬不育[1-3]。我國于20世紀40年代、60年代分別在貓和豬群中發(fā)現(xiàn)PRV，至今該病毒仍在我國豬群中廣泛流行，嚴重威脅著我國豬群的健康[4]，并造成了嚴重經(jīng)濟損失[5]。對豬偽狂犬病的防控與凈化最有效的手段是接種基因缺失疫苗并配合血清學(xué)檢測來完成[6,7]。20世紀90年代我國從匈牙利引進Bartha k61疫苗株，對豬群進行免疫防控，偽狂犬疫情得到了有效的控制。但2011年以來，我國免疫豬群大面積爆發(fā)了偽狂犬疫情，經(jīng)專家證實該疫情由偽狂犬病毒變異株引起。偽狂犬病毒變異毒株感染豬較經(jīng)典偽狂犬強毒感染豬的發(fā)病速度更快、臨床癥狀和病理變化更嚴重、死亡率也更高。同時免疫保護性試驗結(jié)果表明，Bartha k61疫苗免疫豬不能有效抵抗偽狂犬病毒變異株的攻擊[8-13]。

目前，豬偽狂犬病毒變異株已經(jīng)在全國范圍內(nèi)流行，疫病防控形勢嚴峻，國內(nèi)很多研究學(xué)者都在研制針對偽狂犬病毒變異株的疫苗[14-19]。本實驗室運用同源重組的方法成功構(gòu)建出了偽狂犬病疫苗候選株P(guān)RV JS-2012-△gI/gE，以PRV JS-2012-△gI/gE毒株為種毒研制豬偽狂犬病活疫苗和滅活疫苗[20]。本研究采用不同劑量的豬偽狂犬病滅活疫苗（PRVJS-2012-△gI/gE株），對仔豬進行免疫，然后滴鼻接種PRV JS-2012第5代強毒，檢測滅活疫苗的免疫效果，從而確定其最小免疫劑量。

1 材料與方法

1.1 疫苗 豬偽狂犬病滅活疫苗（PRV JS-2012-△gI/ gE株）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬病研究室制備并保存。

1.2 實驗豬、實驗試劑及耗材 陰性實驗豬均購自南京某豬場；偽狂犬病毒gB和gE抗體檢測試劑盒均購自IDEXX公司；動物實驗所用的注射器、采血器、防護服、體溫計等均購自上?；羯锟萍加邢薰?。

1.3 動物試驗 將25頭14日齡PRV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型抗原抗體均為陰性的健康仔豬隨機分成5組，每組5頭。第1～4組分別接種豬偽狂犬病滅活疫苗（PRV JS-2012-△gI/ gE株）0.5、1、2、3 mL/頭，免疫28 d后各組參照第1次免疫的劑量分別加強免疫1次，第5組實驗豬不做處理作為陰性對照。待第2次免疫后28 d，5組實驗豬均滴鼻接種PRV JS-2012第5代強毒2 mL， 含105TCID50/ 頭，觀察臨床表現(xiàn)（體溫、呼吸癥狀、食欲、生長狀態(tài)和神經(jīng)癥狀等）。同時，分別在免疫后0、7、14、21、28、35、42、49、56 d，以及攻毒后1～14 d采集血液并分離血清。攻毒后14 d剖殺剩余實驗豬，進行組織病理學(xué)觀察。

1.4 PRV ELISA抗體檢測 將攻毒前不同時間點采集的豬血清，按IDEXX公司 PRV gB和gE抗體檢測試劑盒說明檢測針對PRV的特異性gB和gE抗體變化。

1.5 臨床及組織病理變化觀察 對攻毒試驗中發(fā)病死亡或試驗結(jié)束剖殺的仔豬，進行病理剖檢。取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結(jié)等組織進行眼觀病變并拍照。所取組織臟器用10%中性福爾馬林固定，制作病理切片，在顯微鏡下觀察病理變化。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 各疫苗免疫組的實驗豬在兩次接種疫苗后均無過敏反應(yīng)，接種部位無炎性反應(yīng)。疫苗接種后除個別仔豬出現(xiàn)短暫的厭食外，其余實驗豬均無異常表現(xiàn)。攻毒后，第1組有1頭豬d 3開始發(fā)病，表現(xiàn)精神沉郁、厭食和輕微的神經(jīng)癥狀，其余4頭只有一過性的發(fā)熱，無任何其他異常臨床表現(xiàn)，保護率為80%；第2～4組實驗豬有一過性的發(fā)熱，無任何其他異常臨床表現(xiàn)，保護率為100%；第5組在攻毒后48 h，5頭實驗豬體溫均迅速上升到41℃以上，并表現(xiàn)為明顯的精神沉郁、厭食和神經(jīng)癥狀，并在攻毒后的d 6和d 7各死亡1頭仔豬，發(fā)病率為100%，死亡率為40%，結(jié)果詳見表1。

表1 不同劑量組免疫攻毒后臨床表現(xiàn)統(tǒng)計結(jié)果Table 1 Protection effi cacy of swine pseudorabies inactivated vaccine with different dosage

2.2 PRV的特異性抗體監(jiān)測 PRV gB抗體檢測結(jié)果顯示，第2～4組在第1次免疫后7 d開始轉(zhuǎn)陽，d 14全部轉(zhuǎn)陽。第1組在第1次免疫后14 d開始轉(zhuǎn)陽，d 21全部轉(zhuǎn)陽，抗體轉(zhuǎn)陽情況整體要比第2～4組晚1周。第5組在對應(yīng)的各時間點PRV gB抗體均為陰性。PRV gE抗體在攻毒前的各個時間點均為陰性（圖1）。

2.3 臨床眼觀病理變化 對攻毒后死亡或試驗結(jié)束迫殺的仔豬進行解剖。取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結(jié)等組織進行眼觀病變拍照，結(jié)果見圖2。第1組少數(shù)實驗豬腦脊液明顯增多，腦膜腫脹增厚、血管擴張，并伴隨少量出血；肺臟輕度氣腫，并伴有出血、壞死，肉實變；腹股溝淋巴結(jié)輕微充血腫脹；脾臟邊緣輕微淤血且腫大；腎臟可見少量點狀出血；肝臟邊緣淤血壞死。第2組個別實驗豬腦脊液稍有增多；肺臟輕度氣腫；腹股溝淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、肝臟未見明顯眼觀病理變化。第3～4組（2 mL和3 mL疫苗接種組），所有實驗豬的腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結(jié)等組織臟器均未見明顯眼觀病理變化。第5組（空白對照組）病死或最終存活的實驗仔豬大都體型消瘦且被毛粗亂，剖檢見腦脊液明顯增多、腦膜腫脹且明顯增厚，血管擴張并伴隨嚴重出血；肺臟氣腫，并伴有出血、壞死、大面積肉實變；腹股溝淋巴結(jié)明顯充血腫脹；脾臟邊緣明顯淤血且腫大，腎臟可見大量點狀出血；肝臟邊緣嚴重淤血壞死。

2.4 組織病理學(xué)觀察 對攻毒后死亡或試驗結(jié)束迫殺的仔豬進行解剖后，每頭豬取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹股溝淋巴結(jié)組織，用10% 中性福爾馬林固定，選取腦、肺臟、肝臟進行病理切片制作，結(jié)果見圖3。第1組實驗豬腦膜表面血管高度擴張充血、出血，腦水腫；肺臟淤血水腫；肝臟淤血。第2組實驗豬腦網(wǎng)膜血管擴張充血、炎性滲出；肺臟組織未見明顯病理變化；肝臟未見淤血。第3組實驗豬腦和肺臟組織均未見明顯病理變化；肝臟未見淤血。第4組實驗豬腦和肺臟組織均未見明顯病理變化；肝臟未見淤血。第5組實驗豬腦腦蛛網(wǎng)膜下腔嚴重出血并擴張、腦膜出血，腦水腫；肺泡出血，細支氣管出血；肝臟淤血。

3 討論

2011年以來，由PRV變異株引起的豬偽狂犬病在我國大面積爆發(fā)并流行，且傳統(tǒng)的偽狂犬病疫苗已不能為免疫豬群提供完全的保護，防控形勢嚴峻。因此本實驗針對偽狂犬病毒變異株的疫苗研究迅速展開。童武等[20]運用同源重組的方法成功構(gòu)建出了偽狂犬病疫苗候選株P(guān)RV JS-2012-△gI/gE，以PRV JS-2012-△gI/gE毒株為種毒研制豬偽狂犬病活疫苗和滅活疫苗，結(jié)果表明該活疫苗與滅活疫苗對仔豬均安全，且具有很好的免疫原性。本研究主要是測定豬偽狂犬病滅活疫苗（PRV JS-2012-△gI/ gE株）的最小免疫劑量。研究結(jié)果顯示，0.5 mL疫苗免疫組在首次免疫后14 d開始轉(zhuǎn)為陽性，1、2、3 mL疫苗免疫組首免后7 d開始轉(zhuǎn)陽，比0.5mL疫苗免疫組提前大約1周；在臨床癥狀方面，對照組具有明顯的神經(jīng)現(xiàn)象并出現(xiàn)死亡，0.5 mL疫苗免疫組攻毒后有輕微神經(jīng)癥狀，1、2、3 mL疫苗免疫組（除一過性發(fā)熱以外）均表現(xiàn)正常；在病理變化方面，對照組病主要臟器（肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、腹股溝淋巴結(jié)）均出現(xiàn)比較明顯的病變；0.5 mL疫苗免疫組在腦組織、肺臟、肝臟和腹股溝淋巴結(jié)也有較明顯的肉眼變化，其余疫苗免疫組的組織臟器基本未出現(xiàn)明顯病變；在組織病理切片方面，對照組腦組織病變嚴重、肺泡及肝細胞均有充血，0.5 mL疫苗免疫組腦組織也有較為嚴重的出血、肺泡水腫和肝細胞病變，其他疫苗免疫組的組織切片病變不明顯。

圖1 免疫后各組豬血清中PRV特異性抗體動態(tài)變化Fig. 1 PRV specifi c antibody responses in piglets of different groups after imoculation注∶ S/N 值小于0.6 判定為抗體陽性. A∶ PRV gB抗體; B∶ PRV gE抗體Note∶ S/N ratios less than 0.6 were considered positive. A∶ PRV gB specifi c antibody; B∶ PRV gE specifi c antibody

圖2 攻毒后仔豬的剖解病變觀察Fig. 2 The autopsy lesions of piglets after challenge

圖3 攻毒后仔豬不同組織的病理切片觀察（HE，200×）Fig. 3 Pathological section observation of differet tissues in piglets after challenge（HE, 200×）

研究結(jié)果表明，在一定的范圍內(nèi)，隨著免疫劑量的提高，免疫豬的抗體產(chǎn)生時間越早，攻毒后的臨床癥狀和病理變化越輕，豬偽狂犬病滅活疫苗的免疫保護效力與免疫劑量呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)豬偽狂犬病滅活疫苗免疫不能夠阻止強毒感染，即使是高劑量（3 mL）免疫豬在攻毒后也會有一過性的發(fā)熱反應(yīng)，但滅活疫苗免疫能夠阻止豬發(fā)病（除一過性發(fā)熱外）和減少排毒。綜合以上數(shù)據(jù)，我們確定豬偽狂犬病滅活疫苗（PRV JS-2012-△gI/gE株）的最小免疫劑量為1mL/頭份。

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DETERMINATION OF THE MINIMUM IMMUNIZATION DOSE OF SWINE PSEUDORABIES INACTIVATED VACCINE

TONG Wu1,2, LI Guo-xin1,2, ZHENG Hao1,2, LIU Fei1, LIANG Chao1, TIAN Qing1, LI Lin1, CAO Yanyun1, WU Ji-qiang1, WANG Tao1, ZHENG Xu-chen1, SHAN Tong-ling1,2, TONG Guang-zhi1,2

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In order to determine the minimum immune dose of the inactivated vaccine of swine Pseudorabies (PRV JS - 2012 - gI/gE strains), twenty fi ve 14-day-old piglets, seronegative for Pseudorabies virus(PRV), Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), Porcine circovirus (PCV2) and Classical swine fever virus (CSFV)antibodies, were selected randomly and divided equally into 5 groups. Pigs in group 1, 2, 3 and 4 were injected with 0.5, 1, 2 and 3 mL of swine pseudorabies inactivated vaccines (PRV JS -2012- gI/gE strains), respectively. Twenty eight days later, a booster vaccination was given at the same dosage. Group 5 was control group without vaccination. On 28 days post second immunization, all pigs were infected with 105TCID50JS-2012-F5 strain. The results showed that PRV gB antibodies were positive in group 2-4 at 14 dpi(days post infection), while the gB antibodies became positive in group 1 at 21 dpi. After infected with JS-2012-F5 strain, one piglet in group 1 showed clinical symptoms of pseudorabies disease, and the others only showed transient fever without any other abnormal clinical manifestations, which meant the protection rate was 80%. In group 2-4, piglets showed transient fever without any other clinical symptoms, so the protection rate was 100%. The temperature of the piglets in group 5 rose quickly above 41℃ after infected with JS-201-F5 for 48 hours, and the piglets showed obvious depression, anorexia and neurological symptoms, which indicated the incidence rate in control group was 100%. According to the above results, the minimal effective dose of vaccines against Pseudorabies virus was 1 mL per piglets.

Pseudorabies virus; inactivated vaccine; minimum immunization dose

S852.659.1

A

1674-6422（2017）01-0026-06

2016-03-30

上海市自然科學(xué)基金項目（14ZR1448900)；上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目（滬農(nóng)科攻字（2015）第1-7號）；國家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-36）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203039）

童武，男，碩士，助理研究員，主要從事豬偽狂犬病毒及其疫苗的研究

童光志，E-mail:gztong@shvri.ac.cn