王曉麗，畢振威，王永山，潘群興，歐陽偉，夏興霞，諸玉梅

（江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所 農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室 國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014）

·研究論文·

H3N2亞型犬流感病毒NP蛋白的表達純化及多克隆抗體制備

王曉麗，畢振威，王永山，潘群興，歐陽偉，夏興霞，諸玉梅

（江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所 農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室 國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014）

將分離的H3N2亞型犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）株的核蛋白（NP）基因克隆至原核表達載體pET28a（+）中，構建重組表達質粒pET-NP，然后轉化大腸桿菌E.coli Rosetta（DE）感受態(tài)細胞，經IPTG誘導后，采用SDS-PAGE和Western blot進行分析。結果顯示，大腸桿菌表達的重組NP蛋白的分子量約為61 kDa，與預期相符，并能與犬CIV陽性血清發(fā)生特異性反應。將表達的重組NP蛋白進行純化后，免疫大白兔制備抗NP蛋白多克隆抗體血清，Western blot檢測該血清可與CIV的NP蛋白發(fā)生特異性反應，間接ELISA檢測該多克隆抗體血清的效價達1∶30 000，顯示了較高的抗體效價。本研究為CIV快速檢測方法的建立和流行病學調查奠定了科學依據。

犬流感病毒；H3N2亞型；核蛋白；原核表達；多克隆抗體

犬流感（canine influenza，CI）是由犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）感染犬引起咳嗽、噴嚏、流涕、發(fā)熱、呼吸困難等癥狀的呼吸系統(tǒng)傳染病[1]。自2007年韓國發(fā)生由禽源H3N2亞型流感病毒引起的犬流感疫情以來，該亞型流感病毒已在犬中廣泛傳播，被認為是犬流感新的病原體[2,3]。血清學調查顯示我國家犬普遍呈現(xiàn)H3N2亞型犬流感病毒抗體陽性[4,5]，在廣東省、江蘇省、北京市、遼寧省和浙江省等地均分離出多株禽源H3N2亞型的犬流感病毒[6-9]。除了H3N2亞型犬流感病毒外，目前已發(fā)現(xiàn)多種亞型A型流感病毒也可以感染犬，包括人流感病毒H3N2亞型、2009年中國流行的H1N1亞型、馬流感病毒H8N3亞型、高致病性禽流感病毒H5N1亞型、低致病性禽流感病毒H9N2亞型和H10N8亞型[10]。因此，犬可能在流感病毒的儲存、傳播和進化中扮演著重要的角色，其公共衛(wèi)生意義值得高度重視。

A型流感病毒屬于正粘病毒科，基因組由8個獨立的RNA片段組成，編碼聚合酶蛋白（PB2和PB1）、核蛋白（NP）、血凝素蛋白（HA）、神經氨酸酶蛋白（NA）、基質蛋白（M1和M2）和非結構蛋白（NS1和NS2）[11]。其中，NP蛋白由A型流感病毒基因片段5編碼，編碼區(qū)長1497 bp，共編碼498個氨基酸，它是構成病毒核衣殼的主要蛋白成分，在病毒基因組的轉錄和復制以及決定病毒的宿主特異性方面都具有重要的作用。同時，核蛋白在病毒蛋白中相對保守，是流感病毒A、B、C型劃分的依據和診斷基礎[12]。2012年，我們在江蘇省南京市分離到了1株亞型犬流感病毒，其HA、NA和NP基因序列均顯示與我國流行的H3N2亞型CIV具有最高的親緣性，將其命名為A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）[13]。本研究原核表達了該毒株的NP基因，并將其表達純化后制備了多克隆抗體血清。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 T4 DNA連接酶、EcoRⅠ和HindⅢ、DNA Marker、IPTG和DNA凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司；含有犬流感病毒A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）株NP基因（GenBank登錄號:KF322107）的重組克隆質粒pMD18-NP由本實驗室構建和保存[13]；pET-28a(+)、菌種E.coli DH5α和E.coli Rosetta（DE3）均購自Invitrogen公司；Ni-NTA His-Bind Resin購自Novagen公司；DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗犬IgG抗體由本試驗室制備和保存[14]；CIV陽性血清為自然感染H3N2亞型CIV發(fā)病犬的血清。

1.2 引物設計 設計擴增NP基因引物，并添加酶切位點EcoRⅠ和Hind III，使之能夠正確克隆到pET28a（+）表達載體中，且下游引物中缺失掉NP基因的終止密碼子，從而使NP基因下游能與His標簽融合表達以提高純化效率，以上引物由上海Invitrogen公司合成。NP-F:5'-CAGAATTCATGGCGTCTCAAGG CACCPCR-3'（下劃線為EcoRⅠ）；NP-R:5'-GC CAAGCTTCATTGTCATACTCCTCTGC-3'（下劃線為Hind III）。

1.3 NP基因原核表達質粒的構建 以克隆質粒pMD18-NP為模板，用PCR方法擴增CIV的NP基因。反應條件:94℃預變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min?；厥誑P基因的PCR擴增產物，將其與原核表達載體pET-28a(+)分別用EcoR Ⅰ與Hind III雙酶切，酶切片段純化回收后用T4 DNA連接酶進行連接，轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，培養(yǎng)后提取重組質粒，用EcoRⅠ和Hind III雙酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得重組表達質粒pET-NP。

1.4 原核表達質粒的誘導表達 將原核表達質粒pETNP分別轉化宿主菌E.coli BL21（DE3）和E.coli Rosetta（DE3），挑取單克隆接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振搖培養(yǎng)至菌液OD600為0.8時，加入誘導劑IPTG至終濃度1 mmol/L，37℃誘導培養(yǎng)4 h。離心收集菌體，經超聲波裂解后離心，將菌體、裂解上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。同步設立E.coli BL21（DE3）、E.coli Rosetta（DE3）和pET28a (+)轉化菌培養(yǎng)物做對照。

1.5 重組NP蛋白的免疫原性分析 將誘導表達菌體蛋白經10% SDS-PAGE分離，轉印到硝酸纖維素膜（NC膜）上，采用50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜，封閉結束后，用PBS沖洗3次；以犬CIV陽性血清（1∶100）為一抗，37℃作用30 min，用PBS沖洗3次；HRP標記的兔抗犬IgG（1∶1000）為二抗，37℃作用30 min，用PBS沖洗3次；DAB底物顯色，進行Western blot檢測。

1.6 重組NP蛋白的純化 大腸桿菌表達的重組NP蛋白主要以包涵體的形式存在。因此，將誘導培養(yǎng)的重組菌以10 800×g 離心15 min，用平衡緩沖液（含8 mol/L尿素、250 mmol/L咪唑的PBS緩沖液）4℃溶解包涵體并超聲裂解至澄清，4℃、10 800×g離心30 min，收集上清，按Ni-NTA His-Bind Resin使用說明書方法純化表達的重組NP蛋白。紫外分光光度計測定蛋白濃度，并用SDS-PAGE測定蛋白純度。

1.7 抗NP蛋白多克隆抗體的制備 將純化的重組NP蛋白以1 mg/只的劑量免疫大白兔。首次免疫用等體積弗氏完全佐劑乳化抗原，以后每隔14 d用弗氏不完全佐劑乳化抗原，進行免疫。5免后d 7心臟采血分離血清，按步驟1.5進行Wertern blot分析。以純化的重組NP蛋白為包被抗原，采用方陣方法建立間接ELISA試驗，測定所制備抗NP蛋白多克隆抗體血清的抗體效價。

2 結果

2.1 重組表達質粒pET-NP的構建與鑒定 PCR擴增CIV的NP基因閱讀框后，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)約1500 bp的DNA片段，與CIV的NP基因的理論值（1497 bp）相符合。將NP基因與原核表達載體pET28a（+）連接，構建重組表達質粒pET-NP，經EcoRⅠ與Hind III雙酶切，可得到約1500 bp的NP基因片段和5000 bp的pET28a(+)表達載體片段，與預期大小DNA片段相符合（圖1）。

2.2 原核表達質粒的誘導表達 將pET-NP轉化的重組菌pET-NP/E.coli BL21（DE3）和pET-NP/E.coli Rosetta（DE3）分別誘導表達后，用SDS-PAGE分析，在分子量約61 kDa處均出現(xiàn)一特異條帶。CIV的NP基因全長1497 bp，編碼498個氨基酸，加上pET28a（+）表達載體的氨基酸序列，其NP蛋白分子量的理論值為61.6 kDa，兩者相符，而空載體pET28a（+）作為對照均未出現(xiàn)此目的條帶。Western blot分析顯示兩種宿主菌表達的目的蛋白均能夠與犬CIV陽性血清發(fā)生特異性反應，表明表達產物具有較好的抗原反應性（圖2、3）。比較圖2和圖3中的目的蛋白條帶，重組質粒pET-NP在E.coli Rosetta （DE3）中的NP蛋白表達量明顯高于E.coli BL21 （DE3）。

圖1 重組質粒pET-NP酶切鑒定結果Fig.1 Identifi cation of the recombinant plasmid pET-NP by restriction digestionM∶ DNA分子量標準(DL5000); 1∶ NP基因; 2∶ 重組質粒pET-NP雙酶切結果M∶ DNA Marker(DL5000); 1∶ NP; 2∶ Recombinant plasmid pETNP digested by EcoRⅠand Hind III

圖2 pET-NP/E.coli BL21 (DE3) 重組菌的SDS-PAGE和Western blot分析結果Fig.2 Analysis of the expressed recombinant NP protein in E.coli BL21 (DE3) by SDS-PAGE and Western blotM∶ 低分子量蛋白質標準; 1∶ 誘導后的E.coli BL21 (DE3); 2∶ 誘導后的pET-NP/E.coli BL21 (DE3) 重組菌; 3∶ 誘導后的pET-NP/ E.coli BL21 (DE3) 重組菌的Western blot結果M∶ Protein Marker; 1∶ E.coli BL21 (DE3); 2∶ pET-NP/ E.coli BL21 (DE3） induced with IPTG; 3∶ Induced pET-NP/ E.coli BL21 (DE3) in Western blot

圖3 pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) 重組菌的SDS-PAGE和Western blot分析結果Fig.3 Analysis of the expressed recombinant NP protein in E.coli Rosetta (DE3) by SDS-PAGE and Western blotM∶ 低分子量蛋白質標準; 1∶ 誘導后的E.coli Rosetta (DE3)；2∶ 誘導后的pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) 重組菌; 3∶ 誘導后的pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) 重組菌的Western blotM∶ Protein Marker; 1∶ E.coli Rosetta (DE3) after induction; 2∶pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) after induction; 3∶ Induced pETNP/E.coli Rosetta (DE3) in Western blot

圖4 重組NP蛋白的純化結果Fig.4 SDS-PAGE and Western blot result of the expressed and purifi ed recombinant NP proteinM∶ 低分子量蛋白質標準; 1∶ 誘導后的pET-NP/E.coli Rosetta (DE3) 重組菌的超聲破碎上清液; 2～6∶ 純化的重組NP蛋白, 濃度分別為0.5、1.8、0.5、0.2、0.1 mg/mL; 7∶ 純化的重組NP蛋白的Western blotM∶ Protein Marker; 1∶ Lysate of pET-NP/E.coli Rosetta(DE3) after induction; 2-6∶ Purifi ed recombinant NP protein, and the concentrations were 0.5, 1.8, 0.5, 0.2, 0.1 mg/mL respectively; 7∶Purifi ed recombinant NP protein in Western blot

2.3 重組NP蛋白的純化 將超聲破碎的pET-NP/E.coli Rosetta(DE3) 菌液上清用SDS-PAGE分析，結果見圖4。表達產物在上清中含量較高，說明重組NP蛋白主要以可溶形式存在于菌體內。將超聲后的菌液上清采用Ni-NTA His·Bind Resin親和層析純化，5倍柱體積的Elution buffer洗脫，分別收集洗脫液。SDS-PAGE電泳結果顯示純化后的蛋白條帶單一，分子量大小均為61 kDa，蛋白濃度依次為0.5、1.8、0.5、0.2、0.1 mg/mL。

2.4 抗NP蛋白多克隆抗體的制備 大量誘導表達目的蛋白NP并經鎳柱純化后，與佐劑混合乳化免疫大白兔，免疫5次后采血分離血清。Western blot檢測結果表明，制備的抗NP蛋白多克隆抗體血清可以與純化的重組NP蛋白發(fā)生特異性反應，在約61 kDa處出現(xiàn)1條特異性的蛋白帶，與SDS-PAGE的分析結果一致。以純化的犬流感病毒為包被抗原，建立間接ELISA試驗，采用方陣試驗方法確定抗原包被濃度為14 μg/mL，檢測犬血清的稀釋濃度為1∶200。用建立的間接ELISA試驗對制備的抗NP蛋白多克隆抗體血清進行檢測，其抗體效價可達1∶ 30 000，具有較高的抗體效價。

3 討論

A型流感病毒是人類、鳥類和低等哺乳動物的重要病原體。近年來，許多不同亞型的流感病毒在犬體內被廣泛地檢測到[15-17]，犬流感病毒受到越來越多的關注?，F(xiàn)已證實在中國和韓國出現(xiàn)的H3N2亞型犬流感病毒能在犬群中有效傳播和傳染，2015年初美國芝加哥5000只犬發(fā)生H3N2亞型犬流感疫情，表明該亞型犬流感病毒顯示出不斷擴大的趨勢[10]。此外，流感病毒的重配事件往往容易引起流感的大流行，2012年韓國報道從犬體內分離到1株由H3N2亞型犬流感病毒HA基因和2009年甲型H1N1流感病毒其他7個基因片段重配的H3N1亞型犬流感病毒重配株[18]。犬與人類接觸密切，犬流感病毒HA基因與人流感病毒的重配可能會增加人際間流感的流行，CIV可能對人類健康造成危害或隱患。因此，建立一種能夠檢測不同亞型流感病毒的快速檢測方法，對犬進行系統(tǒng)有效的流感流行病學監(jiān)測，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

流感病毒檢測的常用方法為病毒的分離鑒定和血清學方法。流感病毒散毒周期短，有些臨床癥狀不明顯，給病毒的分離帶來困難，病毒分離周期也較長。血清學調查可采用間接血凝抑制（HI）試驗，該方法依賴于流感病毒表面的糖蛋白的血凝性，但其表面糖蛋白存在較高的抗原變異性[19]。CIV的NP蛋白相對保守，可用于不同亞型犬流感病毒的檢測，主要用于各種ELISA診斷試劑盒中。我們前期從南京市寵物醫(yī)院具有呼吸道癥狀的犬群中分離到1株H3N2亞型CIV，其NP基因與H3N2亞型犬流感病毒中國毒株具有較高的同源性和親緣關系[13]，因此本研究選擇當地流行株的NP蛋白進行原核表達，并制備抗NP蛋白多克隆抗體血清。

利用大腸桿菌表達重組蛋白，具有周期短、成本低、易于純化等優(yōu)點。pET表達系統(tǒng)是一種方便有效的原核表達系統(tǒng)，因此選用pET28a（+）原核表達載體構建了pET-NP重組表達質粒。由于選用E.coli BL21（DE3）宿主菌進行表達時蛋白表達量較低，同時我們發(fā)現(xiàn)此NP基因中有較多稀有密碼子，因此選用了具有定向改善稀有密碼子的表達限制性質的E.coli Rosetta（DE3）作為受體菌，提高了NP蛋白基因在大腸桿菌中的表達水平。為了提高重組NP蛋白的純化效率，設計下游引物時對NP基因的終止密碼子進行了缺失，使表達的重組NP蛋白的上游和下游均含有載體的His標簽。通過Western blot和間接ELISA方法檢測證實重組NP蛋白仍然保持了較好的抗原性，在免疫學檢測和診斷實驗技術中具有較為廣泛應用前景。

綜上所述，本研究成功表達了H3N2亞型CIV的NP蛋白，并制備了兔抗CIV NP蛋白多克隆抗體血清，為建立CIV NP蛋白ELISA抗原檢測方法和抗體檢測方法以及研究NP蛋白的結構與功能奠定了良好的基礎。

[1] Li S, Shi Z, Jiao P, et al. Avian-origin H3N2 canine influenza A viruses in Southern China[J]. Infect Genet Evol, 2010, 10(8)∶ 1286-1288.

[2] Song D, Kang B, Lee C, et al. Transmission of avian influenza virus (H3N2) to dogs[J]. Emerg Infect Dis, 2008, 14(5)∶ 741-746.

[3] Su S, Chen Y, Zhao F R, et al. Avian-origin H3N2 canine influenza virus circulating in farmed dogs in Guangdong, China[J]. Infect Genet Evol, 2013, 19∶ 251-256.

[4] 粟碩, 李華濤, 陳濟鐺, 等. 犬流感（H3N2亞型）血清學調查[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2013, 40(2)∶ 201-204.

[5] Yin X, Zhao F R, Zhou D H, et al. Serological report of pandemic and seasonal human influenza virus infection in dogs in southern China[J]. Arch Virol, 2014, 159(11)∶2877-2882.

[6] Li S, Shi Z, Jiao P, et al. Avian-origin H3N2 canine influenza A viruses in Southern China[J]. Infect Genet Evol, 2010, 10(8)∶ 1286-1288.

[7] Lin Y, Zhao Y, Zeng X, et al. Genetic and pathobiologic characterization of H3N2 canine influenza viruses isolated in Jiangsu Province of China in 2009～2010[J]. Vet Microbiol, 2012, 158(3-4)∶ 247-258.

[8] Sun Y, Sun S, Ma J, et al. Identification and characterization of avian-origin H3N2 canine influenza viruses in northern China during 2009～2010[J]. Virology, 2013, 435(2)∶ 301-307.

[9] Teng Q, Zhang X, Xu D, et al. Characterization of an H3N2 canine influenza virus isolated from Tibetan mastiffs in China[J]. Vet Microbiol, 2013, 162(2-4)∶345-352.

[10] 于志君, 張醒海, 張坤, 等. 犬流感研究新進展[J]. 中國病原生物學雜志, 2015, 10(8)∶ 768-771.

[11] Wong S S, Yuen K Y. Avian influenza virus infections in humans[J]. Chest, 2006, 129(1)∶ 156-168.

[12] 李娜. A型禽流感病毒核蛋白研究進展[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志, 2007, 26(2)∶ 35-37.

[13] 王曉麗, 畢振威, 王永山, 等. 一株H3N2亞型犬流感病毒的分離與進化分析[J]. 中國動物傳染病學報, 2015, 23(2)∶ 32-40.

[14] 畢振威, 王永山, 范紅結, 等. 非典型犬瘟熱病毒核衣殼蛋白基因序列分析及其在大腸桿菌中的表達[J]. 中國預防獸醫(yī)學報, 2011, 33(8)∶ 625-629.

[15] Su S, Tian J, Hong M, et al. Global and quantitative proteomic analysis of dogs infected by avian-like H3N2 canine influenza virus[J]. Front Microbiol, 2015, 6∶ 228. [16] Songserm T, Amonsin A, Jam-on R, et al. Fatal avian influenza A H5N1 in a dog[J]. Emerging Infect Dis, 2006, 12(11)∶ 1744-1747.

[17] Sun X, Xu X, Liu Q, et al. Evidenceofavian-like H9N2 influenza A virus among dogs in Guangxi, China[J]. Infect Genet Evol, 2013, 20∶ 471-475.

[18] Moon H, Hong M, Kim J K, et al. H3N2 canine influenza virus with the matrix gene from the pandemic A/ H1N1 virus∶ infection dynamics in dogs and ferrets[J]. Epidemiol Infect, 2015, 143(4)∶ 772-780.

[19] Yang M, Berhane Y, Salo T, et al. Development and application of monoclonal antibodies against avian influenza virus nucleoprotein[J]. J Virol Methods, 2008, 147 (2)∶ 265-274.

EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT NUCLEOPROTEIN OF H3N2 SUBTYPE CANINE INFLUENZA VIRUS

(Ministry of Agriculture National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products, Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology, Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

The nucleoprotein (NP) gene of H3N2 subtype Canine infl uenza virus (CIV) A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2) isolated from Nanjing, China, was cloned into pET-28a(+) for generation of a recombinant plasmid pET-NP. The resulting recombinant pET-NP was then transformed into E.coli Rosetta(DE3) competent cells following by induction with IPTG. The expression of the NP protein was detected in SDS-PAGE and Western blot. The results showed that the recombinant NP was 61 kDa protein corresponding to the expected molecular mass and reacted with the antiserum against H3N2 subtype CIV. The recombinant NP of CIV was purifi ed via Ni-NTA affi nity chromatography and the polyclonal antibodies were produced by immunizing rabbits with purifi ed recombinant NP. Western blot indicated that the polyclonal antibodies specifically recognized the recombinant NP. The polyclonal antibodies were titrated in indirect ELISA using the purifi ed recombinant NP as the coating antigen and the titer was as high as 1∶30 000. The availability of the recombinant NP and polyclonal antibodies laid a foundation for development of rapid detection and epidemiological methods for CIV.

Canine infl uenza virus; H3N2 subtype; nucleoprotein; prokaryotic expression; polyclonal antibody

S852.659.5

A

1674-6422（2017）01-0001-06

2016-04-26

江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX（15）1065）

王曉麗，女，碩士，副研究員，主要從事新型獸用疫苗與檢測試劑盒研究

王永山，E-mail:wangys63@126.com

WANG Xiao-li, BI Zhen-wei, WANG Yong-shan, PAN Qun-xing, OUYANG Wei, XIA Xing-xia, ZHU Yu-mei