王 淵，楊曉航，牛文民，朱先偉，王 強，劉思洋，王衛(wèi)剛,劉智斌*(.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 7046；.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 700；.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 7000)

電針迎香穴對嗅覺功能障礙大鼠胰島素樣生長因子-1的影響

王 淵1，楊曉航1，牛文民1，朱先偉1，王 強1，劉思洋2，王衛(wèi)剛3,劉智斌1*
(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

目的 探討電針迎香穴對嗅覺功能障礙大鼠胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）的影響。方法 將50只SD大鼠隨機分為5組，分別是正常組、嗅覺功能障礙組、嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組、嗅覺功能障礙+電針組、嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+電針組，電針干預(yù)迎香穴后，運用嗅覺迷宮實驗和對大鼠嗅球組織及血液中IGF-1進(jìn)行ELISA、免疫組織化學(xué)等方法進(jìn)行分析研究。結(jié)果 嗅覺功能障礙+電針組大鼠與正常組相比，其嗅覺功能明顯改善（P＜0.01），其嗅球組織及血液中IGF-1表達(dá)明顯升高（P＜0.05）,而嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+電針組大鼠與正常組相比，其嗅覺功能和嗅球組織及血液中IGF-1表達(dá)無明顯改善（P＞0.05）。結(jié)論 電針迎香穴對嗅覺功能障礙模型大鼠具有顯著干預(yù)效應(yīng),其作用機制可能是通過三叉神經(jīng)通路，促進(jìn)大鼠體內(nèi)IGF-1的產(chǎn)生，從而有利于嗅覺系統(tǒng)嗅感神經(jīng)元（ORN）再生，改善嗅覺功能障礙。

嗅覺功能障礙；胰島素樣生長因子-1；迎香穴

嗅覺在人類的各種生理、心理活動中發(fā)揮著重要作用。本研究針對嗅覺功能障礙所選穴位迎香，《玉龍歌》中所載：“不聞香臭從何治？迎香穴二穴可堪攻，先補后瀉分明效，一針未出氣先通”，其中歌賦中所載的“不聞香臭”即指現(xiàn)代醫(yī)學(xué)范疇的嗅覺功能障礙，包括嗅覺減退和嗅覺喪失，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，人群中嗅覺功能障礙實際總發(fā)生率20歲以上占19.1%，50歲以上高達(dá)24.5%，而在這些患病人群中，末梢神經(jīng)性嗅覺功能障礙患者占全體嗅覺功能障礙患者的30%以上[1-2]。因此，電針迎香穴被廣泛應(yīng)用于治療末梢神經(jīng)性嗅覺功能障礙[3-5]。嗅覺受體神經(jīng)細(xì)胞作為唯一具備持續(xù)再生能力的神經(jīng)元，其中含有各種氣味結(jié)合蛋白，通過一系列機制參與嗅覺的整個形成過程,胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)是調(diào)節(jié)嗅覺受體神經(jīng)再生的主要分子。本項目在前期研究基礎(chǔ)上，對于末梢神經(jīng)性嗅覺功能障礙動物模型，本研究團隊采用Triton X-100灌注大鼠雙側(cè)鼻孔進(jìn)行復(fù)制，采用電針迎香穴干預(yù)嗅覺功能障礙模型和切斷眶下神經(jīng)嗅覺功能障礙模型，通過嗅覺迷宮觀察大鼠行為學(xué)、ELISA法觀察大鼠嗅球組織及血液中IGF-1的表達(dá)、免疫組化法觀察鼠嗅球組織IGF-1的表達(dá)等方法，分析電針迎香穴干預(yù)嗅覺功能障礙的效應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康清潔級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量（250± 20）g，由西安交大實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（陜）2016.038)。隨機分為正常組、嗅覺功能障礙組、嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組、嗅覺功能障礙+電針組、嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+電針組，每組10只。

1.2 主要儀器及試劑

Morris水迷宮實驗系統(tǒng) （北京現(xiàn)代太極電子有限公司），Multiskan MK3全自動酶標(biāo)儀 （美國Bio-Rad公司），Rat Insulin-like Growth Factor 1 IGF-1(IGF-1)ELISA KIT（Thermo Fisher Scientific），SDZ-II型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品）。

1.3 模型制備

1.3.1 嗅覺功能障礙模型制備 麻醉劑采用0.3%戊巴比妥鈉，將大鼠麻醉后，選用由 PBS配制的0.7%Triton X-100，并將其吸注于微量注射器中，再將磨鈍的針頭探入大鼠的雙側(cè)鼻孔，一次性灌注量為100 μL,時間1 min[6]。

1.3.2 眶下神經(jīng)切斷模型制備 首先對大鼠雙側(cè)眶下皮膚區(qū)域進(jìn)行常規(guī)消毒，然后沿兩側(cè)眶下緣做一長約0.5 cm的水平切口，接著對視野內(nèi)的皮下脂肪進(jìn)行鈍性分離直至將眶下孔充分暴露出來，再將眶下神經(jīng)及其同名動靜脈進(jìn)行仔細(xì)分離，最后在避開血管的情形下，對眶下神經(jīng)施行切斷術(shù)[7]。

1.4 實驗方法

穴位選擇：迎香穴（雙側(cè)）。穴位定位：大鼠鼻孔外側(cè)上端，有毛與無毛交界處[8]。操作方法：常規(guī)消毒穴位，選擇30號、0.5寸“華佗牌”不銹鋼毫針，迎香向內(nèi)上方斜刺0.3 cm；電針儀正極和負(fù)極各接一側(cè)迎香穴，以穴區(qū)保持輕微抖動為適宜刺激強度，每次電針刺激10 min，每日1次，1個干預(yù)療程為5次，休息2 d，再進(jìn)行下一個干預(yù)療程，共觀察2個療程。對于正常組和嗅覺功能障礙模型組大鼠，每日于同一時間段進(jìn)行捉拿固定，不施加任何干預(yù)措施。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 嗅覺迷宮實驗 將圓形迷宮等分為6個小格，將新鮮鼠料(0.5 g)隨機置于大鼠僅靠嗅覺才能找到而不能直接看見的小格后面。將大鼠放置于迷宮中間，對于大鼠從進(jìn)入迷宮開始到用前爪抓住食物小球啃噬的時間進(jìn)行記錄，待大鼠進(jìn)食結(jié)束后將其放回籠中，將大鼠的排泄物和食物殘渣取出，為了防止對后面測試的干擾，用水和70%的乙醇對迷宮進(jìn)行清潔；陽性對照是將食物小球放置在大鼠能夠直接看見小格外。對于300 s(5次測試的平均值)內(nèi)未找到食物小球的大鼠，即定為嗅覺喪失[9]。

1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附測定 在療程結(jié)束后取下大鼠頭顱，參照The Rat Brain大鼠圖譜，使用電鉆在大鼠頭顱前囟前3.2 mm的位置對后界開窗，使得左側(cè)嗅球充分暴露，刀片采用厚度為0.5 mm的規(guī)格，在視野清晰的條件下，將其由后界垂直插入，進(jìn)一步將嗅球組織取出并切成碎片[10]，接下來依照每10 mg組織對應(yīng)100 μL PBS的比例將組織進(jìn)行勻漿，為了破壞細(xì)胞膜，采用超聲波對勻漿液進(jìn)行進(jìn)一步處理，最后將上清液吸出并且置于-80℃超低溫冰箱之中。對于嗅球組織中IGF-1的表達(dá)采用ELISA法進(jìn)行檢驗分析。

1.5.3 免疫組織化學(xué) 將大鼠嗅球組織進(jìn)行石蠟包埋并切片，采用梯度酒精和二甲苯對切片進(jìn)行水化,使用pH值6.0的0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液對抗原進(jìn)行修復(fù)，非特異性結(jié)合位點的封閉采用山羊血清工作液，在37℃ 30 min的條件下，滴加比例為1∶200的IGF-1R抗體并且在4℃條件下過夜，采用0.01 mol/L PBS對其進(jìn)行漂洗，將生物素化山羊抗鼠/兔IgG二抗滴加于其中，在37℃ 30 min的條件下，對其進(jìn)行PBS漂洗，將辣根過氧化酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白試劑滴加于其中，在37℃ 30 min的條件下，對其進(jìn)行PBS漂洗，并進(jìn)行DAB顯色，采用蘇木素將其輕度復(fù)染，接下來采用酒精梯度對其脫水，最后進(jìn)行中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 嗅覺迷宮實驗結(jié)果

與正常對照組相比，嗅覺功能障礙組與嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組在嗅覺迷宮中所用時間均大于300 s，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明這兩組大鼠嗅覺喪失；與嗅覺功能障礙組相比，嗅覺功能障礙+電針組大鼠在嗅覺迷宮實驗中所用的時間明顯縮短，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）而嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷+電針組大鼠在嗅覺迷宮實驗中所用的時間大于300 s，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 嗅覺迷宮實驗結(jié)果 (±s，s)

表1 嗅覺迷宮實驗結(jié)果 (±s，s)

注:與正常對照組比較，##P＜0.01；與嗅覺功能障礙組比較，**P＜0.01。

?

2.2 酶聯(lián)免疫吸附分析結(jié)果

與嗅覺功能障礙模型組比較,嗅覺功能障礙+電針組大鼠嗅球組織和血液中的IGF-1表達(dá)增加（P＜0.05），嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組大鼠嗅球組織和血液中的IGF-1表達(dá)無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠嗅球組織及血液中IGF-1的表達(dá) (n=10,±s，ng/mL)

表2 各組大鼠嗅球組織及血液中IGF-1的表達(dá) (n=10,±s，ng/mL)

注:與正常對照組比較，#P＜0.05；與嗅覺功能障礙組比較，*P＜0.05。

?

2.3 免疫組織化學(xué)分析結(jié)果

圖1，表3結(jié)果說明，與嗅覺功能障礙模型組比較,嗅覺功能障礙+電針組大鼠嗅球組織IGF-1的陽性表達(dá)明顯增加（P＜0.05），嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組大鼠嗅球組織中IGF-1的陽性表達(dá)無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠嗅球組織中IGF-1表達(dá)（免疫組化染色，IHC×400）

表3 各組大鼠嗅球中IGF-1的表達(dá) (n=10,±s，ng/mL)

表3 各組大鼠嗅球中IGF-1的表達(dá) (n=10,±s，ng/mL)

注:與正常對照組比較，#P＜0.05；與嗅覺功能障礙組比較，*P＜0.05。

3 討論

迎香穴的解剖學(xué)定位位于鼻翼外緣中點旁、當(dāng)鼻唇溝中，此位置恰好是作為三叉神經(jīng)分支之一的上頜支的分布區(qū)域，而鼻睫神經(jīng)由三叉神經(jīng)分支之一的眼支分出，其分布于嗅上皮區(qū)域，并包含在鼻腔粘膜中，在解剖學(xué)分布模式上三叉神經(jīng)與嗅覺神經(jīng)具有重疊分布性，且嗅覺的產(chǎn)生有賴于三叉神經(jīng)系統(tǒng)和嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)的協(xié)同作用，故我們推斷，通過電針刺激迎香穴可以對三叉神經(jīng)產(chǎn)生激活效應(yīng)。

嗅覺迷宮實驗結(jié)果表明，采用Triton X-100灌注能夠成功復(fù)制大鼠嗅覺功能障礙模型，嗅覺功能障礙組和嗅覺功能障礙+眶下神經(jīng)切斷組大鼠行為學(xué)中均以嗅覺喪失為主要表現(xiàn)。電針迎香穴干預(yù)嗅覺功能障礙大鼠后嗅覺顯著改善，然而，電針迎香穴嗅覺障礙+眶下神經(jīng)切斷大鼠后嗅覺無顯著改善。研究表明，作為三叉神經(jīng)主要分支之一的眶下神經(jīng)，在其完整的情況下，電針迎香穴發(fā)揮了改善嗅覺的作用，而在其被切斷后，電針迎香穴沒有發(fā)揮相應(yīng)效應(yīng)，故推斷電針迎香穴之所以能夠發(fā)揮對嗅覺功能障礙的良性調(diào)節(jié)效應(yīng)可能是基于三叉神經(jīng)的完整性之上的。

IGF-1由肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、脾細(xì)胞等十幾種細(xì)胞自分泌和旁分泌而成，是生長激素產(chǎn)生生理作用過程中必須的一種活性蛋白多肽物質(zhì)。IGF-1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞DNA的合成，是人體內(nèi)重要細(xì)胞有絲分裂的促進(jìn)劑，對維持細(xì)胞分化有關(guān)蛋白質(zhì)水平具有關(guān)鍵作用。有研究表明，嗅覺刺激可以增加IGF-1在體內(nèi)的產(chǎn)生，因此，本研究選擇IGF-1作為整個實驗的觀測指標(biāo)，而本實驗研究結(jié)果顯示，IGF-1濃度含量的變化與針刺的干預(yù)作用具有明顯相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，嗅覺功能障礙組大鼠嗅球或血液中的IGF-1表達(dá)減少，電針迎香穴干預(yù)嗅覺功能障礙大鼠后嗅球或血液中的IGF-1表達(dá)顯著增加，然而，電針迎香穴嗅覺障礙+眶下神經(jīng)切斷大鼠嗅球或血液中的IGF-1表達(dá)無顯著變化。提示經(jīng)電針迎香穴干預(yù)嗅覺障礙大鼠后能夠增加IGF-1的表達(dá)，且此干預(yù)效應(yīng)的發(fā)揮是基于三叉神經(jīng)通路的完整性之上的。

嗅覺障礙或嗅覺傳導(dǎo)通路失常與很多疾病密切相關(guān)，其嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。選用電針迎香穴時，三叉神經(jīng)被激活，一種類似嗅覺的信號向大腦進(jìn)行傳遞，大腦在這樣的信號影響下，促進(jìn)肝細(xì)胞、腎細(xì)胞等細(xì)胞旁細(xì)胞分泌和IGF-1，增加其產(chǎn)生，IGF-1的增加有利于嗅覺受體神經(jīng)的再生。因此，電針迎香穴可以改善大鼠嗅覺，促進(jìn)嗅覺受體神經(jīng)的再生，促進(jìn)大鼠體內(nèi)IGF-1的產(chǎn)生，其機制可能是基于三叉神經(jīng)的完整性而發(fā)揮良性調(diào)節(jié)效應(yīng)。

[1]劉巧平,劉建華.針刺內(nèi)迎香治療嗅覺下降[J]北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報（中醫(yī)臨床版）,2011,18(2):21-22.

[2]張 偉,張 羅.嗅覺功能障礙的診斷與治療[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,34(6):814-819.

[3]牛文民,劉智斌,楊曉航，等.嗅三針治療嗅覺功能障礙100例[J]陜西中醫(yī),2008,29(8):1054-1055.

[4]倪道鳳,劉劍峰,王 劍,等.國內(nèi)嗅覺障礙研究[J].中國醫(yī)學(xué)文摘?耳鼻咽喉科學(xué),2007,(4):212-213.

[5]郭 義.實驗針灸學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2008.

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[9]李小松,唐 玲,汪克建，等.小鼠嗅黏膜中水通道蛋白1對嗅覺形成的作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2010,32(23):2483-2487.

[10]JonasKO,MariaJ,Ingrid E,etal.Long-term episodic memory decline is associated with olfactory deficits only in carriers of ApoE-e4[J].Neuropsychologia.2016,85:1-9.

（本文編輯 匡靜之）

Effect of Yingxiang Acupoint on Insulin-like Growth Factors-1 in Olfactory Dysfunction Rats

WANG Yuan1,YANG Xiaohang1,NIU Wenmin1,ZHU Xianwei1,WANG Qiang1,LIU Siyang2,WANG Weigang3,LIU Zhibin1* (1.Shanxi University of Chinese Medicine,Xianyang,Shanxi 712046,China;2.Xi'an Medical College,Xi'an,Shanxi 710021,
China;3.The Affiliated Hospital of Shanxi University of Chinese Medicine,Xianyang,Shanxi 712000,China)

Objective To investigate the effect of Yingxiang acupoint on insulin-like growth factors-1 (IGF-1)in olfactory dysfunction rats.Methods The 50 SD rats were randomly assigned into five groups,normal control group,olfactory dysfunction group,olfactory dysfunction+infraorbital nerve transection group group,olfactory dysfunction+EA group,olfactory dysfunction+infraorbital nerve transection+EA group.After electro-acupuncture intervention at Yingxiang acupoint,the IGF-1 in olfactory bulb tissue and blood of rats was analyzed by using olfactory maze test,ELISA and immunohistochemistry methods.Results Compared with the normal group,the olfactory function of the olfactory dysfunction+EA group rats were significantly improved(P＜0.01),IGF-1 in the olfactory bulb tissue and blood increased significantly(P＜0.05).While the IGF-1 in olfactory dysfunction+infraorbital nerve cut+EA group had no significant improvement (P＞0.05).Conclusion Electroacupuncture Yingxiang acupoint has a significant intervention effect on olfactory dysfunction model rats and its mechanism may be through the trigeminal nerve pathway,promote the production of IGF-1 in rats.It is conducive to the olfactory mucosa olfactory sense(ORN)of neuronal regeneration and improve olfactory dysfunction.

olfactory dysfunction;insulin-like growth factors-1;Yingxiang acupoint

R245.3；R765

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.03.018

2016-07-11

國家自然科學(xué)基金項目（81273859）；陜西省教育廳專項科學(xué)研究項目（11JK0679）。

王 淵，男，副教授，研究方向：針灸推拿治療脊柱疾病和老年病的基礎(chǔ)與臨床研究。

*劉智斌，男，二級教授，E-mail:lzb210396@163.com。

本文引用：王 淵，楊曉航，牛文民，朱先偉，王 強，劉思洋，王衛(wèi)剛,劉智斌.電針迎香穴對嗅覺功能障礙大鼠胰島素樣生長因子-1的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（3）：298-301.