鄒柯涵，徐 敏，羅書(shū)笛，鄒國(guó)英，任碧瓊(.湖南省婦幼保健院病理科，湖南 長(zhǎng)沙 40008；.湖南省第二人民醫(yī)院病理科、檢驗(yàn)科，湖南 長(zhǎng)沙 40007)

CK、Ki67、Gly-3及P53在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

鄒柯涵1，徐 敏2，羅書(shū)笛2，鄒國(guó)英2，任碧瓊2
(1.湖南省婦幼保健院病理科，湖南 長(zhǎng)沙 410008；2.湖南省第二人民醫(yī)院病理科、檢驗(yàn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

目的 探討細(xì)胞角蛋白（CK）、核抗原（Ki67）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Gly-3）及抑癌基因P53在肝細(xì)胞癌（HCC）組織中的表達(dá)。方法 收集16例肝細(xì)胞肝癌患者癌組織及癌旁組織，采用免疫組化染色技術(shù)，分別檢測(cè)CK、Ki67、Gly-3及P53，分析其表達(dá)情況。結(jié)果 免疫組化檢測(cè)16例HCC癌組織中CK7、CK8/18、CK19的陽(yáng)性率分別為50%（8/16）、93.8%(15/ 16)以及62.5%（10/16），Ki67的陽(yáng)性率為75%（12/16），Gly-3陽(yáng)性率為87.5%（14/16），P53的陽(yáng)性率為50%（8/16）。結(jié)論HCC患者癌組織中CK、Ki67、Gly-3及P53的表達(dá)有不同程度的上調(diào)，其中以CK8/18陽(yáng)性率最高，Gly-3及Ki67次之，P53 及CK7相對(duì)較低。

肝細(xì)胞癌；免疫組化；細(xì)胞角蛋白；Ki67；Gly-3；P53

我國(guó)原發(fā)性肝癌患者數(shù)量占全球54%，好發(fā)于男性，高發(fā)年齡為30～50歲[1-2]，每年死于肝癌的人數(shù)達(dá)37萬(wàn)。肝細(xì)胞癌 （hepatocellular carcinoma, HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)的一種，占原發(fā)性肝癌的90%以上。與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌 (HICC)和肝細(xì)胞癌-肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌混合型等其它病理類型的原發(fā)性肝癌相比，HCC的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)行為、組織形態(tài)、臨床表現(xiàn)、治療方法以及預(yù)后等方面均有其明顯的特點(diǎn)，因此，了解HCC組織中表達(dá)的腫瘤相關(guān)蛋白及分子的表達(dá)有利于HCC的診斷及治療。

隨著免疫組織化學(xué)染色技術(shù)的應(yīng)用和不斷發(fā)展，越來(lái)越多的腫瘤相關(guān)分子的檢測(cè)可以在臨床開(kāi)展[3-4]，近期推出的一系列腫瘤相關(guān)蛋白特異性免疫組織染色為肝癌等惡性疾病的診斷提供新的方向。本文初步報(bào)道肝癌患者癌組織中的細(xì)胞角蛋白7、 8/18、19、Ki67、Gly-3以及P53突變基因的表達(dá)，為各種指標(biāo)的進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

收集湖南省第二人民醫(yī)院病理科2015年1月至2016年12月的外科手術(shù)切除的HCC患者癌組織標(biāo)本16例及癌旁組織16例。病人資料見(jiàn)表1。

1.2 方法

組織首先用10%的甲醛固定，然后切取腫瘤組織按脫水、透明、浸蠟、包埋程序處理，4 μm連續(xù)切片，首先進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，肝癌診斷由病理專業(yè)兩位副主任醫(yī)師復(fù)診，按Edmondson-Steiner法確定肝癌分化程度。

1.3 免疫組化檢測(cè)

表1 HCC患者基本信息及病理資料

采用EnVision 2步法，切片經(jīng)過(guò)烤片、脫蠟，乙醇由高至低濃度至入水，pH 6.0檸檬酸緩沖液中高溫高壓修復(fù)上氣后加熱2 min，蒸餾水沖洗，3%過(guò)氧化氫液10 min，PBS緩沖液洗滌 3遍，每遍3 min，加羊血清37℃封閉10 min，PBS緩沖液洗3遍，每遍3 min，加一抗(鼠抗人單克隆抗體，試劑盒提供的工作液)，37℃ 2 h，PBS清洗3遍，每遍3 min，加入二抗37℃ 30 min，PBS緩沖液浸 3遍，DAB顯色，蒸餾水沖洗，復(fù)染，封片。CK19需在高溫高壓修復(fù)后，37℃進(jìn)行1 min胃酶消化，PBS緩沖液洗3遍，加入一抗（試劑盒提供的工作液)。

1.4 儀器與試劑

免疫組化采用Leica BOND全自動(dòng)免疫組化及原位雜交染色系統(tǒng)。CK、Ki67及P53試劑為儀器配套試劑；Gly-3試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.5 染色結(jié)果判斷

CK、Gly-3在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，Ki67、P53在細(xì)胞核中表達(dá)。陽(yáng)性染黃色或棕黃色。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞陽(yáng)性率＜10%判定為陰性(-)；細(xì)胞陽(yáng)性率10%～30%為弱陽(yáng)性(+)；細(xì)胞陽(yáng)性率31%～60%為陽(yáng)性(++)；細(xì)胞陽(yáng)性率＞60%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織及癌旁組織HE染色

結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 CK7、CK8/18、CK19的表達(dá)

16例HCC患者癌組織中CK7陽(yáng)性表達(dá)8例，陽(yáng)性表達(dá)率為50.0%，癌旁組織僅1例弱陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性率為6.25%，二者差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；16例 HCC患者癌組織中CK8/18陽(yáng)性表達(dá)15例，陽(yáng)性表達(dá)率為93.8%，癌旁組織僅2例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率12.5%，二者差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；16例HCC患者癌組織中CK19陽(yáng)性表達(dá)10例，陽(yáng)性表達(dá)率為62.5%，癌旁組織全部無(wú)表達(dá)，二者差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），染色陽(yáng)性及陰性結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 癌組織及癌旁組織光鏡圖（HE×400）

圖2 CK7、CK8/18及CK19在HCC組織中的表達(dá)（免疫組化法×100）

2.3 Ki67、Gly-3及P53的表達(dá)

16例HCC患者癌組織中Ki67陽(yáng)性表達(dá)12例，陽(yáng)性表達(dá)率為75%，癌旁組織2例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率12.5%，二者差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；16例HCC患者癌組織中Gly-3陽(yáng)性表達(dá)14例，陽(yáng)性表達(dá)率為87.5%，癌旁組織全部無(wú)表達(dá)，二者差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；16例HCC患者癌組織中P53陽(yáng)性表達(dá)8例，陽(yáng)性表達(dá)率為50%，癌旁組織全部無(wú)表達(dá)，二者差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），染色陽(yáng)性及陰性結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 Gly-3、Ki67及P53在HCC組織中的表達(dá)（免疫組化法×100）

3 討論

細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）是角質(zhì)細(xì)胞中的主要骨架蛋白，它作為一種中間絲存在于所有上皮細(xì)胞及部分非上皮細(xì)胞，以維持上皮組織的完整性及連續(xù)性，根據(jù)分子量大小將其分為30種基因型。角蛋白在上皮源性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)異常表達(dá)，因此可作為腫瘤的輔助診斷指標(biāo)[5]，本研究發(fā)現(xiàn)不同的CK在HCC中有不同的表達(dá)率，CK8/18作為應(yīng)激蛋白幾乎在所有HCC組織中表達(dá)，癌旁組織也有不同程度的表達(dá)。不少研究表明CK7可以作為結(jié)直腸癌、原發(fā)性卵巢腫瘤以及肝癌等腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物[6-7]，但本研究的結(jié)果顯示CK7表達(dá)相對(duì)較低。CK19表達(dá)與細(xì)胞分化程度呈負(fù)相關(guān)[8]，表達(dá)CK19的肝癌侵襲性及惡性程度更嚴(yán)重[9]，本研究中有60%以上的HCC表達(dá)CK19，但未做進(jìn)一步臨床分析。

細(xì)胞增殖核抗原Ki67定位于細(xì)胞核，在細(xì)胞增殖周期中表達(dá)，G0期缺如，G1期時(shí)即可檢測(cè)出，可提示機(jī)體細(xì)胞增殖情況。Ki67的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，對(duì)其深入研究對(duì)于了解腫瘤的生物學(xué)行為和預(yù)后有重要價(jià)值[10-13]。Ki67標(biāo)記的是處于增殖周期中的細(xì)胞。該標(biāo)記陽(yáng)性率越高，腫瘤生長(zhǎng)越快，組織分化越差，對(duì)化療也越敏感。一般來(lái)說(shuō)，預(yù)后較差。本研究中Ki67在HCC患者癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率為75%。

Gly-3是通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨連接到細(xì)胞表面的肝磷脂蛋白聚糖的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成員[14]，Gly-3在細(xì)胞增殖和在特定組織中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用中具有負(fù)面作用[15]。然而，它在HCC中過(guò)表達(dá)最近也有報(bào)道[16-17]，與本研究結(jié)果相符。

P53是位于染色體17的短臂上的腫瘤抑制基因，通常調(diào)節(jié)細(xì)胞周期機(jī)制的活性。已觀察到p53基因的突變?cè)诙喾N類型的人類癌癥中具有高流行性，并且經(jīng)常伴隨點(diǎn)突變發(fā)生。研究報(bào)道HCC中p53突變的頻率在18%至67%之間[18]，p53突變蛋白陰性患者為肝癌發(fā)生的早期，在肝癌發(fā)生的中期檢測(cè)到突變型p53蛋白，這表明p53突變是啟動(dòng)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素[19]。本研究中的p53表達(dá)陽(yáng)性率為50%，準(zhǔn)備擴(kuò)大樣本與結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。

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（本文編輯 馬 薇）

Expression of CK,Ki67,Gly-3 and P53 in Hepatocellular Carcinoma Tissues

ZOU Kehan1，XU Min2,LUO Shudi2,ZOU Guoying2,REN Biqiong2
(1.Department of Pathology,Maternal and Child Health Hospital of Hunan Province,Changsha,Hunan 410008,China;2.Department of Pathology and Clinical Laboratory,the Second People's Hospital of Hunan Province,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To investigate the expression of cytokeratin (CK),nuclear antigen (Ki67),Gly-3 and P53 in hepatocellular carcinoma (HCC).Methods CK,Ki67,Gly-3 and P53 were detected by immunohistochemical staining technique in 16 patients with hepatocellular carcinoma (HCC)respectively.Results The positive rates of cytokeratin 7,cytokeratin 8/18 andcytokeratin 19 in HCC tissues were 50%(8/16),93.8%(15/16)and 62.5%(10/16),respectively.The positive rate of Ki67,Gly-3 and P53 were 75% (12/16),87.5% (12/16),and 50% (8/16),respectively.Conclusion The expression of CK, Ki67,Gly-3 and P53 were up-regulated in HCC patients,with the highest positive rate of CK8/18,followed by Gly-3 and Ki67.The expression of P53 and CK7 were relatively low in HCC patients.

hepatocellular carcinoma;immunohistochemistry;CK;Ki67;Gly-3;P53

R735.7

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.03.025

2016-12-09

鄒柯涵，女，病理醫(yī)師，E-mail：727266645@qq.com。

本文引用：鄒柯涵，徐 敏，羅書(shū)笛，鄒國(guó)英，任碧瓊.CK、Ki67、Gly-3及P53在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（3）：326-328.