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炭疽實驗室生物安全

2017-04-11 07:43:59謝雙靳曉軍李京京程洪亮陸兵
生物技術(shù)通訊 2017年3期
關(guān)鍵詞:芽胞炭疽桿菌

謝雙,靳曉軍,李京京,程洪亮,陸兵

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071

炭疽實驗室生物安全

謝雙,靳曉軍,李京京,程洪亮,陸兵

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071

近年來,炭疽自然疫情和實驗室相關(guān)事故頻發(fā),有關(guān)炭疽生物安全問題再次引發(fā)關(guān)注。本文簡要介紹炭疽芽胞桿菌基本特點和目前對炭疽的治療及預(yù)防概況,再結(jié)合歷年來炭疽實驗室典型生物安全事故,分析并總結(jié)國內(nèi)外實驗室生物安全管理的經(jīng)驗教訓(xùn),針對性地提出炭疽實驗室管理問題及對策,供炭疽實驗活動和實驗室生物安全管理參考。

炭疽芽孢桿菌;炭疽;實驗室事故;炭疽實驗室生物安全

2016年8月初,俄羅斯西伯利亞亞馬爾-涅涅茨自治區(qū)暴發(fā)炭疽疫情,造成1名兒童死亡,90多人接受入院治療,2500頭以上的馴鹿死亡[1]。近年來,國內(nèi)外相繼報道過不同程度、不同原因的自然發(fā)生的炭疽疫情[2]。同時,炭疽實驗室事故也頻頻發(fā)生,給周圍環(huán)境和人員帶來巨大的生物安全隱患。本文介紹了炭疽及炭疽芽胞的基本情況和目前對炭疽這一古老疾病的治療研究進(jìn)展,并以炭疽為例,討論高致病性病原微生物實驗室生物安全問題及對策。

1 炭疽芽胞桿菌

1.1 炭疽芽胞桿菌基本特性

早在19世紀(jì),羅伯特·科赫就根據(jù)炭疽提出了著名的科赫法則,并由此向世人證明了炭疽芽胞桿菌就是炭疽病的病原菌。炭疽芽胞桿菌是革蘭陽性桿菌,通常直徑為1~1.5μm,長3~10 μm,在顯微鏡下呈“車箱”似的鏈條狀連在一起。炭疽芽胞桿菌無運動性,能在血平板上快速生長、無溶血環(huán),特定條件下形成芽胞。炭疽芽胞菌落為灰白色不規(guī)則圓形,直徑4~5 mm,菌落邊緣呈毛玻璃狀。在活體組織中炭疽芽胞桿菌不會形成芽胞,但是當(dāng)感染后的機(jī)體組織暴露于空氣中,炭疽芽胞桿菌就會很快形成芽胞。而一旦形成芽胞,其致病性和感染性就會大大增加。

相對于多數(shù)細(xì)菌繁殖體,由炭疽芽胞桿菌等所形成的芽胞能高效抵抗一系列致死性處理,如脫水、高溫、紫外線照射、大量有毒化學(xué)劑及蛋白酶和溶菌酶的酶解[3]。因此,炭疽芽胞在休眠狀態(tài)時在自然界能保持幾十年甚至幾百年的生存能力,一旦環(huán)境條件合適,芽胞在幾小時內(nèi)就會出芽并快速增殖。這次西伯利亞炭疽疫情暴發(fā)的“始作俑者”就是在地下休眠了75年的炭疽芽胞[1]。炭疽芽胞的穩(wěn)定性及方便儲存和運輸?shù)忍攸c,也是其作為生物武器或生物恐怖劑應(yīng)用的主要原因之一。

1.2 炭疽芽胞桿菌致病機(jī)理

炭疽芽胞桿菌的毒力基因決定簇位于2個獨立于染色體外的大質(zhì)粒pXO1和pXO2上,這2個質(zhì)粒分別編碼炭疽毒素和聚D-谷氨酸莢膜。炭疽毒素由3種共同起作用的蛋白質(zhì)組成,即水腫因子、保護(hù)性抗原和致死因子。當(dāng)保護(hù)性抗原與水腫因子和致死因子結(jié)合后,就會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性,并在感染組織(如肺部)產(chǎn)生液體(水腫)。水腫因子是一種腺苷酸環(huán)化酶,它能促進(jìn)環(huán)腺苷酸的聚集,造成機(jī)體水和離子代謝的失調(diào)。致死因子是金屬肽酶,它能切斷蛋白質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng),嚴(yán)重影響免疫應(yīng)答所必需的細(xì)胞功能并造成細(xì)胞死亡[4]。毒素蛋白的組合能抵御宿主的防御并干擾細(xì)胞功能;聚合氨基酸莢膜能夠保護(hù)炭疽芽胞桿菌免受吞噬細(xì)胞的攻擊,兩者結(jié)合能給宿主帶來致命的傷害。即使在使用抗生素殺死了病人體內(nèi)的細(xì)菌后,炭疽毒素的作用仍能奪走病人性命。

2 炭疽及其防治

炭疽是一種人畜共患的急性傳染病,根據(jù)感染的方式可分為體表感染型(皮膚)炭疽、經(jīng)口感染型(腸)炭疽、吸入感染型(肺)炭疽、腦膜炎型炭疽、炭疽敗血癥[5],以及近年來西歐部分國家陸續(xù)出現(xiàn)的因注射海洛因引起的注射型炭疽[6]。

2.1 炭疽的臨床治療

針對炭疽病原治療,通常推薦環(huán)丙沙星(或青霉素G)+克林霉素聯(lián)合用藥;疑似出現(xiàn)腦膜炎并發(fā)癥的推薦用藥為環(huán)丙沙星(或青霉素G)+美羅培南+利奈唑胺聯(lián)合用藥。以上療程至少2~3周,直到滿足臨床穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)[7]。

針對皮膚炭疽的局部治療,可用1∶10 000高錳酸鉀沖洗,并敷以抗生素軟膏。為防止敗血癥的發(fā)生,切忌按壓皮膚病灶及外科手術(shù)。

2.2 炭疽疫苗

1954年,前蘇聯(lián)首先篩選出人用減毒活疫苗STI,并投入臨床使用。我國于1958年研制成功A16R減毒活疫苗,并在1961年開始由蘭州生物制品研究所生產(chǎn)[8]。該菌株無莢膜質(zhì)粒,主要成分是培養(yǎng)形成的炭疽芽胞,接種方式為皮上劃痕,但存在接種劑量難以保證等問題,每年須加強(qiáng)接種1次。美國上世紀(jì)50年代就開始炭疽疫苗的研究,1970年,美國FDA批準(zhǔn)通過了人用炭疽疫苗AVA(anthrax vaccine absorbed),所使用的是有毒素質(zhì)粒而沒有莢膜質(zhì)粒的V770-NP1-R株。該疫苗的接種方式為18個月內(nèi)肌內(nèi)注射6次,然后每年加強(qiáng)接種1次。AVP(anthrax vaccine precipitated)是英國上市的人用炭疽疫苗,所使用的是Sterne菌株。但這些疫苗均成分復(fù)雜,批間變異大,難定性定量,不能完全有效地預(yù)防一些特定的炭疽菌株。

總的來說,目前的人用炭疽疫苗仍會帶來一些令接種者難以接受的副反應(yīng),有效免疫保護(hù)力的持續(xù)時間也比較短,需要每年都進(jìn)行加強(qiáng)性免疫接種,尤其對吸入型炭疽感染保護(hù)不佳。目前新型炭疽疫苗如保護(hù)性抗原(PA)組分疫苗、DNA疫苗[9]等的設(shè)計策略都主要考慮疫苗的成分是否更加穩(wěn)定、更加可控,是否有更高的保護(hù)率以及更簡單的接種程序。

3 炭疽實驗室生物安全事故及分析

自然發(fā)生的炭疽疫情通常發(fā)生在處理感染性動物或動物產(chǎn)品(如羊毛、羊皮)的人群中,發(fā)病表現(xiàn)出明顯的職業(yè)接觸特點,多數(shù)患者為農(nóng)牧民、皮毛加工及運輸工人、屠宰廠工人等職業(yè)人群,而且多為皮膚炭疽。

相對于自然發(fā)生的炭疽疫情,炭疽實驗室獲得性感染的途徑和種類就復(fù)雜許多,主要包括:①注射器、針頭等銳器刺傷可能引起的皮膚炭疽感染;②工作人員皮膚裸露操作感染性炭疽樣本可能引起的直接接觸感染;③不戴口罩操作或?qū)嶒瀰^(qū)喝水等危險行為可能引起的腸炭疽感染;④炭疽芽胞氣溶膠可能引起的吸入性炭疽感染。

3.1 典型炭疽實驗室生物安全事故

1979年前蘇聯(lián)斯維爾德洛夫斯克暴發(fā)大面積炭疽疫情[10],據(jù)事故相關(guān)人員后期的著作描述,系當(dāng)?shù)厣镂淦魃a(chǎn)基地的炭疽生產(chǎn)車間工作人員卸下排風(fēng)系統(tǒng)過濾器后未及時安裝,只留下一張紙條告知下一班工作人員,而第二天上班的同事未做處理就開始工作,使得車間在排風(fēng)系統(tǒng)沒有安裝過濾器的情況下運行,導(dǎo)致含炭疽芽胞的粉塵直接排出車間,污染了周邊環(huán)境,直接導(dǎo)致大量人員感染并致死。

1991年,美國馬里蘭一軍方實驗室發(fā)現(xiàn)丟失了27份樣本,樣本主要為感染炭疽和埃博拉的動物組織,并且至今仍不知這些樣本的去向。該實驗室還在周末和晚上未經(jīng)授權(quán)的情況下開展炭疽實驗[11]。

2001年9月和10月,至少有5封裝有大量炭疽芽胞的信件分別郵寄給了位于哥倫比亞特區(qū)的美國參議員以及位于紐約市和佛羅里達(dá)州博卡拉頓市的媒體機(jī)構(gòu)[12]。郵件至少使22人感染炭疽,5人死亡。美國當(dāng)局最終在2010年得出結(jié)論,即美國陸軍傳染病醫(yī)學(xué)研究所(USAMRIID)布魯斯·E·埃文斯博士利用實驗室保存的炭疽菌株惡意制造了這場炭疽郵件事件,證據(jù)之一是布魯斯有大量時間單獨留在生物安全三級實驗室,并無法提供充分的工作理由。

2002年,美國實驗室人員將炭疽樣本帶出高等級生物安全實驗室之前,未按照正確的消毒滅菌方法處理,導(dǎo)致炭疽樣本在未完全失活的情況下被攜出實驗室,而樣本接收者在有外傷并且未戴手套的情況下轉(zhuǎn)移炭疽樣本瓶,事故最終導(dǎo)致1人感染炭疽,實驗室外環(huán)境也可能存在污染風(fēng)險[13]。事實上,類似事件層出不窮。2014年6月5日,美國亞特蘭大CDC的實驗人員在BSL-3實驗室對活炭疽進(jìn)行滅活時,沒有遵循正確程序,導(dǎo)致殘留活炭疽,并且在沒有有效防護(hù)的情況下將活炭疽轉(zhuǎn)移到了其他2個BSL-2實驗室,而這2個實驗室并不具備處理活炭疽的條件[14]。BSL-2實驗室的工作人員也是在沒有穿戴適當(dāng)個體防護(hù)裝備的條件下處理這些認(rèn)為已經(jīng)滅活的炭疽樣本。6月13日,一名工作人員意識到這些炭疽芽胞可能未完全滅活后立即報告,CDC隨即開展相關(guān)調(diào)查,并終止了所有的實驗室活動。截止到6月20號,證實有86人接觸到致命炭疽桿菌。

2011年,美國芝加哥一名實驗室工作人員在實驗結(jié)束幾天后,皮膚表面出現(xiàn)由含有炭疽毒力大質(zhì)粒的蠟樣芽胞桿菌導(dǎo)致的嚴(yán)重感染。據(jù)查,實驗室未將這些危險菌種歸到管制劑范圍內(nèi),管理相對松散,最終導(dǎo)致了事故的發(fā)生[15]。

2012年3月,英國薩利郡動物衛(wèi)生和獸醫(yī)實驗室的研究人員打算將加熱滅活的炭疽樣本遞送至位于貝爾法斯特的分部,但是他們不小心混淆了炭疽樣本管,最后北愛爾蘭分部收到的樣本不是滅活的炭疽材料,而是有活性的甚至可能會致命的活炭疽樣本。幸運的是,貝爾法斯特實驗室的人員是在高等級生物安全實驗室操作的這些樣本,因此沒有造成暴露。而另一個動物衛(wèi)生和獸醫(yī)實驗室的2名工作人員則是在開放環(huán)境中處理了活炭疽樣本,幸運的是2人均事前接種了炭疽疫苗,也未因此感染[16]。

2015年5月,美國五角大樓公開承認(rèn)在過去的10年間,設(shè)于猶他州的達(dá)格威試驗場至少向韓國境內(nèi)外51個實驗室遞送了可能有活性的炭疽桿菌樣本。馬里蘭州的一個實驗室在2015年5月22日才發(fā)現(xiàn)收到的炭疽樣本仍有活性,而2006年時就有實驗室收到過這種可能仍有活性的樣本[17]。據(jù)調(diào)查,可能是實驗室監(jiān)管檢測及樣本的輸出環(huán)節(jié)出現(xiàn)了嚴(yán)重失誤。截至目前,沒有任何跡象表明這是一起人為故意事件[18]。

3.2 炭疽實驗室事故分析

上述前蘇聯(lián)大面積炭疽污染事故,是典型的管理體系出現(xiàn)的漏洞。首先,該實驗室沒有明確過濾器更換的操作規(guī)程,或者工作人員沒有按照操作規(guī)程執(zhí)行,而實驗室應(yīng)有機(jī)制確保過濾器恢復(fù)前禁止生產(chǎn);其次是工作交接環(huán)節(jié)上的問題,工作人員應(yīng)該通過工作日志交接而不是用一張紙條。細(xì)節(jié)上的失誤導(dǎo)致了重大事故的發(fā)生。

2002、2014、2015年美國發(fā)生的炭疽實驗室事故,均是由炭疽材料滅活不徹底造成的,這也是美國報道的炭疽實驗室事故最多的原因之一,不得不引起重視。接觸高致病性病原微生物樣本,人員的基礎(chǔ)防護(hù)必不可少,必要時還應(yīng)采取預(yù)防措施。這些事件充分表明了驗證并嚴(yán)格執(zhí)行生物安全實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,特別是消毒滅菌操作規(guī)程和個體防護(hù)操作規(guī)程的重要性。我國2004年的“非典”實驗室事故也是緣于使用了未經(jīng)驗證的病原微生物滅活程序。

除了管理體系和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程等環(huán)節(jié)上的問題,人員管理更是生物安全實驗室管理的重中之重。生物安全實驗室的安保-防止病原微生物的惡意使用,其最薄弱環(huán)節(jié)來自內(nèi)部人員,2001年的美國炭疽郵件事件就是由實驗室工作人員實施的。據(jù)分析,該實驗室的視頻監(jiān)控系統(tǒng)和報警系統(tǒng)并不完善,工作人員可以單獨在生物安全三級實驗室工作,而且管理層也未及時關(guān)注工作人員的心理活動、精神狀況等,最終釀成重大生物安全事故。此外,人員主觀因素也會給生物安全實驗室?guī)盹L(fēng)險,如上述事件中英國發(fā)生混淆活炭疽樣本事件以及美國軍方丟失樣本事件等。這些事件不僅揭露了實驗室樣本管理混亂的現(xiàn)象,同時表明了工作人員主觀上也不具備高度的責(zé)任意識和安全意識。

4 炭疽實驗室生物安全管理對策

以上炭疽實驗室事故表明,生物安全實驗室除了需要重視硬件建設(shè)以外,更要重視實驗室管理。結(jié)合我國生物安全實驗室管理現(xiàn)狀,提出以下實驗室生物安全管理對策,供從事炭疽研究的實驗室參考。

4.1 完善并嚴(yán)格執(zhí)行實驗室管理制度

從事高致病性病原微生物實驗活動,必須有法可依,有章可循。實驗室應(yīng)完善并嚴(yán)格執(zhí)行實驗室管理制度,禁止一切管理體系之外的行為。除此之外,加強(qiáng)人員培訓(xùn),保證實驗室工作人員理解并充分掌握所有的規(guī)章制度,不能出現(xiàn)因理解能力的參差不齊,造成巨大的生物安全隱患。

4.2 制定可靠的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程并嚴(yán)格過程控制

按照國家的管理要求,目前生物安全實驗室都應(yīng)該建立管理體系,制定操作規(guī)程。涉及病原微生物操作,特別是消毒滅菌的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程是否能夠有效地滅活病原微生物,除了應(yīng)對操作規(guī)程本身進(jìn)行驗證以證明其可靠以外,還應(yīng)嚴(yán)格過程控制。在驗證過程中,重點關(guān)注的是要充分考慮實際操作時的各種影響因素,以排除對操作規(guī)程有效實施的干擾,并達(dá)到最終目的;在實際操作過程中,則應(yīng)做好必要的記錄以及對識別出的關(guān)鍵參數(shù)的監(jiān)控,以確保操作規(guī)程的有效實施。只有事先充分驗證、過程嚴(yán)格控制的程序,才能充分保證實驗室生物安全。

4.3 確?;A(chǔ)的人員防護(hù)和醫(yī)療監(jiān)護(hù)

生物安全實驗室的風(fēng)險來自所操作的病原微生物,要確保安全,離不開基礎(chǔ)的人員防護(hù)和醫(yī)療監(jiān)護(hù)。人員防護(hù)的重點是有效隔離,基礎(chǔ)的人員防護(hù)必須做到佩戴手套和生物防護(hù)口罩,同時保證所有樣本操作均在生物安全柜等防護(hù)條件下進(jìn)行,這樣可以避免絕大多數(shù)意外的發(fā)生。對于從事高致病性病原微生物操作的工作人員,基礎(chǔ)的醫(yī)療監(jiān)護(hù)(體溫監(jiān)測等)、有條件時接種疫苗,都是防止、監(jiān)測實驗室暴露和感染,避免實驗室事故的有效手段。

4.4 加強(qiáng)實驗室工作人員安全責(zé)任意識

人員管理是生物安全管理的重中之重。凡是操作高致病性病原微生物的工作人員,除應(yīng)掌握相關(guān)專業(yè)知識和操作技能外,還須具備高度的責(zé)任意識及安全意識。保證實驗室生物安全是能力建設(shè),長期保證實驗室生物安全則是思想建設(shè)。在加強(qiáng)生物安全教育、培訓(xùn),實現(xiàn)生物安全的基礎(chǔ)上,保證生物安全意識不松懈,執(zhí)行生物安全管理不懈怠,同樣是實驗室生物安全管理的難題。實驗室可以通過定期進(jìn)行實驗室生物安全事故的警示教育、實驗室生物安全崗位培訓(xùn)及考試、實驗室生物安全研討或沙龍等多種方式,促進(jìn)工作人員持續(xù)保持高度的安全責(zé)任意識。

4.5 落實實驗室生物安保措施

實驗室生物安保措施是指一系列旨在防止病原微生物本身及其相關(guān)信息被濫用或惡意使用的預(yù)防性措施。實驗室生物安保的物理措施包括監(jiān)控攝像系統(tǒng)、報警入侵系統(tǒng)及嚴(yán)格的來訪人員控制系統(tǒng),這主要是針對外部入侵的。而內(nèi)部環(huán)節(jié)中的人員安保措施則包括嚴(yán)格審查一切能接觸到病原微生物材料的內(nèi)部人員的忠誠度,并實時跟蹤其心理活動及思想波動;內(nèi)部環(huán)節(jié)中生物樣本的安保則包括菌(毒)種的雙人雙鎖制度、高等級生物安全實驗室內(nèi)的雙人工作制度、樣本進(jìn)出實驗室的嚴(yán)格登記制度等。在生物安保方面,防止外部入侵技術(shù)要求高,出現(xiàn)問題往往也能及時發(fā)現(xiàn);而如何有效地防止內(nèi)部環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題,則需要借助于制度建設(shè)以及潤物細(xì)無聲的日常工作,任務(wù)更為艱巨。

從古至今,無論是自然發(fā)生還是在生物武器、生物恐怖以及實驗室生物安全等方面,炭疽都是一種“熱門”的生物劑,也對人類健康和經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重危害。但炭疽并不可怕,隨著人類對炭疽的深入了解,炭疽這一古老的疾病已在人類可控范圍內(nèi),而科學(xué)防控也將有助于我們避免炭疽造成的危害。

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[17]Sisk R.Carter Apologizes for Secret Anthrax Shipments to South Korea[EB/OL].http://www.military.com/ daily-news/2015/06/01/carter-apologizes-for-secret-anthrax-shipments-to-south-korea.htm l(Jun.01,2015).

[18]U.S.military sent live anthrax to labs by accident[EB/OL]. http://mashable.com/2015/05/28/live-anthraxshipped-usmilitary/#4sC2UpOJziqQ.

Laboratory Biosafety of Anthrax

XIE Shuang,JIN Xiao-Jun,LI Jing-Jing,CHENG Hong-Liang,LU Bing*

Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071,China

*Corresponding author,E-mail:13693506666@163.com

In recent years,the breakout of natural anthrax epidemic and occurrence of laboratory accidents made the biosafety of anthrax come into our view again.The characteristics of anthrax andBacillus anthracisas well as the advances in the treatment and preventive vaccination of anthrax were briefly introduced,followed by the analysis of the biosafety accidents and the experience of anthrax laboratories management at home and abroad. Finally,some strategies and suggestion were put forward as lab staff's reference to strengthen the management of laboratory biosafety of anthrax andB.anthracis.

anthrax;Bacillus anthracis;laboratory accidents;laboratory biosafety of anthrax

R378

A

1009-0002(2017)03-0347-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.021

2016-10-17

謝雙(1991-),女,碩士研究生,(E-mail)18766178741@163.com

陸兵,(E-mail)13693506666@163.com

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