張 林 李 瑾 林 雪 肖 軍

武漢大學(xué)中南醫(yī)院消化內(nèi)科/湖北省腸病醫(yī)學(xué)臨床研究中心 腸病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(430071)

Caveolin-1和緊密連接蛋白在小鼠血吸蟲性結(jié)腸炎中的表達(dá)及其意義*

張 林#李 瑾 林 雪 肖 軍△

武漢大學(xué)中南醫(yī)院消化內(nèi)科/湖北省腸病醫(yī)學(xué)臨床研究中心 腸病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(430071)

背景：血吸蟲腸病是一種血管內(nèi)寄生蟲病，結(jié)腸慢性炎癥是其基本的病理改變之一。目前有關(guān)caveolin-1和緊密連接蛋白參與血吸蟲腸病發(fā)病的機(jī)制仍不明確。目的：初步探討caveolin-1和緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-1在小鼠血吸蟲性結(jié)腸炎中的表達(dá)及其意義。方法：將40只BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組和感染組。小鼠腹部貼片感染約40條日本血吸蟲尾蚴建立血吸蟲性結(jié)腸炎模型。8周后處死小鼠，行HE染色，伊文思藍(lán)法檢測(cè)腸道血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，計(jì)數(shù)腹腔灌洗液中的白細(xì)胞，qPCR法檢測(cè)結(jié)腸組織中caveolin-1、occludin、claudin-1、eNOS mRNA表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化檢測(cè)caveolin-1和occludin蛋白表達(dá)。結(jié)果：感染組結(jié)腸黏膜下層可見大量蟲卵肉芽腫，并伴有腸壁廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與正常對(duì)照組相比，感染組腹腔灌洗液中伊文思藍(lán)含量和白細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著升高(P<0.05)，caveolin-1、occludin、claudin-1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)，caveolin-1、occludin蛋白表達(dá)和陽(yáng)性率均顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：Caveolin-1、occludin和claudin-1表達(dá)下調(diào)可能通過(guò)影響腸道血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，誘發(fā)白細(xì)胞聚集，從而參與血吸蟲性結(jié)腸炎的發(fā)病。

血吸蟲?。?結(jié)腸炎； 窖蛋白1； 緊密連接蛋白

血吸蟲腸病是我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)常見的寄生蟲病[1]。腸道血管內(nèi)皮細(xì)胞受損在血吸蟲腸病發(fā)病中起重要作用[2]，內(nèi)皮細(xì)胞受損可影響白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，改變血管通透性，加重腸道炎癥。緊密連接是腸道血管內(nèi)皮細(xì)胞中的重要物理屏障結(jié)構(gòu)，對(duì)維持微血管通透性具有重要意義。Caveolin-1是小窩蛋白家族成員之一，研究[3-5]表明，caveolin-1通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接而調(diào)控血管通透性。本研究通過(guò)建立血吸蟲性結(jié)腸炎小鼠模型，檢測(cè)caveolin-1和緊密連接蛋白表達(dá)，初步探討其與血管通透性改變進(jìn)而誘發(fā)白細(xì)胞聚集之間的聯(lián)系，旨在進(jìn)一步認(rèn)識(shí)血吸蟲腸病的發(fā)病機(jī)制，為患者的個(gè)體化治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和血吸蟲蟲種：選取健康2～4周齡SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠40只，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。感染用日本血吸蟲尾蚴陽(yáng)性釘螺購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心血吸蟲病防治研究所，實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)。

2. 主要試劑：伊文思藍(lán)(Sigma公司)，Trizol(北京艾德萊生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GeneCopoeia Inc.)，實(shí)時(shí)PCR試劑盒(TAKARA公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗caveolin-1(Abcam公司)，兔抗GAPDH和兔抗occludin(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；瑞氏染液(南京建成生物工程研究所)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 造模和分組：將小鼠隨機(jī)分為感染組和正常對(duì)照組，每組各20只。感染組常規(guī)腹部貼片感染約40條日本血吸蟲尾蚴，建立血吸蟲性結(jié)腸炎小鼠模型。正常對(duì)照組不接種尾蚴，常規(guī)喂養(yǎng)。感染后8周觀察實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的變化，同時(shí)解剖取結(jié)腸標(biāo)本。

2. 腸道血管通透性和白細(xì)胞穿透性的檢測(cè)[5]：小鼠尾靜脈注射1%的伊文思藍(lán)40 mg/kg，3 h后處死。處死前腹腔注射5 mL無(wú)菌PBS，充分灌洗小鼠腹腔，回收腹腔液體(>4 mL)，350×g離心10 min。取上清液200 μL，以分光光度計(jì)測(cè)定620 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，通過(guò)檢測(cè)灌洗液中伊文思藍(lán)含量反映血管通透性。同時(shí)將離心后的沉淀以1 mL PBS重懸，乙酸和結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)白細(xì)胞。

3. qPCR法檢測(cè)腸道組織mRNA表達(dá)：取小鼠結(jié)腸組織約100 mg，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行PCR反應(yīng)。Caveolin-1、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、occludin、claudin-1、GAPDH的引物序列見表1。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。目的基因的mRNA表達(dá)以2-△△Ct進(jìn)行計(jì)算，反應(yīng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

4. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)腸道組織蛋白表達(dá)：取約100 mg腸道組織，加入裂解液裂解，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取40 μg總蛋白行12%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入caveolin-1、occludin和GAPDH一抗(工作濃度分別為1∶20 000、1∶1 000、1∶1 000)孵育過(guò)夜。TBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗，孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑自顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集并分析，各蛋白的表達(dá)以目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值表示。

5. 免疫組化染色：小鼠結(jié)腸組織固定后常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚4 μm，行HE染色。連續(xù)切片后脫蠟，乙醇梯度水化，微波加熱修復(fù)抗原。加入caveolin-1和occludin(工作濃度分別為1∶100、1∶50)和二抗，DAB顯色，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。高倍鏡下隨機(jī)選取4～5個(gè)視野，采用半定量積分法，總分為陽(yáng)性細(xì)胞率和陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度之積。染色強(qiáng)度：無(wú)染色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽(yáng)性細(xì)胞率：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分?？偡?～1分為陰性，2～4分為陽(yáng)性，>5分為強(qiáng)陽(yáng)性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況和結(jié)腸病理改變

感染后8周處死小鼠，以眼科鑷挑取腸系膜血管中的成蟲(圖1)。大體觀察示正常對(duì)照組小鼠腸黏膜基本正常；感染組小鼠腸道變粗，腸黏膜充血水腫，可見糜爛壞死，病變以結(jié)腸為主。HE染色示感染組小鼠結(jié)腸黏膜下層可見大量蟲卵肉芽腫(圖2A)，并伴有腸壁廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分表淺上皮脫落壞死；正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完好，僅可見少量散在的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見到蟲卵肉芽腫(圖2B)。說(shuō)明血吸蟲性結(jié)腸炎造模成功。

圖1 鏡下血吸蟲成蟲(×200)

A：感染組；B：正常對(duì)照組

圖2 小鼠結(jié)腸組織HE染色(紅色箭頭所示處為蟲卵肉芽腫)(×200)

二、腸道血管通透性改變

感染組小鼠腹腔灌洗液中伊文思藍(lán)含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)(表2)，表明血吸蟲感染后腸道血管通透性增強(qiáng)。

三、腹腔灌洗液白細(xì)胞計(jì)數(shù)

感染組腹腔灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)(表2)，說(shuō)明血吸蟲感染可增強(qiáng)白細(xì)胞穿透腸道微血管的能力。

四、mRNA表達(dá)

與正常對(duì)照組相比，感染組caveolin-1、occludin、claudin-1 mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.01)，eNOS mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P=0.126)(圖3)。

五、蛋白表達(dá)

與正常對(duì)照組相比，感染組小鼠caveolin-1和occludin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)(圖4)。

表1 引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

組 別例數(shù)A620nm白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×106/L)正常對(duì)照組200．19±0．424．45±1．06感染組200．39±0．64?20．45±1．77??

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

*與正常對(duì)照組比較，P<0.01

六、免疫組化結(jié)果

正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜組織中caveolin-1和occludin蛋白陽(yáng)性著色主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色；感染組小鼠結(jié)腸黏膜組織中棕黃色信號(hào)明顯減弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，分布不均勻(圖5)。與正常對(duì)照組相比，感染組caveolin-1和occludin的陽(yáng)性率均顯著降低(χ2=6.144，P=0.013；χ2=11.905，P=0.001)(表3)。

*與正常對(duì)照組比較，P<0.01

圖4 兩組小鼠結(jié)腸組織caveolin-1和occludin蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

A：正常對(duì)照組caveolin-1；B；感染組caveolin-1；C：正常對(duì)照組occludin；D：感染組occludin

圖5 caveolin-1和occludin在小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)(免疫組化染色，×400)

表3 兩組小鼠caveolin-1和occludin的陽(yáng)性率比較 n (%)

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

血吸蟲在人接觸疫水后，主要寄生于門靜脈和腸系膜下靜脈，因此病變主要位于直腸、乙狀結(jié)腸和降結(jié)腸。蟲卵沉積在腸黏膜和黏膜下層可引起微血管阻塞，同時(shí)誘發(fā)白細(xì)胞聚集，進(jìn)而特異性地攻擊血吸蟲卵，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致糜爛、潰瘍等。隨著病程進(jìn)展炎癥刺激可致纖維組織增生，引起腸壁增厚，導(dǎo)致息肉和狹窄，嚴(yán)重時(shí)可形成腸梗阻。以往對(duì)血吸蟲病的研究多集中于血吸蟲肝纖維化領(lǐng)域，而對(duì)血吸蟲腸道病變的分子機(jī)制鮮有報(bào)道。血吸蟲腸病的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，易與炎癥性腸病(IBD)、腸結(jié)核等混淆，誤診、漏診率高，且與腫瘤發(fā)生有一定相關(guān)性。腸黏膜活檢是診斷血吸蟲腸病的金標(biāo)準(zhǔn)，但血吸蟲蟲卵的沉積部位可能較深，內(nèi)鏡活檢不一定可發(fā)現(xiàn)血吸蟲蟲卵，血吸蟲腸病內(nèi)鏡診斷率僅20.2%～35.7%[6]。因此加強(qiáng)對(duì)血吸蟲腸病分子機(jī)制的闡述，尋找特異性血液標(biāo)記物，對(duì)血吸蟲腸病患者具有重要意義。

本研究中，給予小鼠腹部貼片感染日本血吸蟲尾蚴后，黏膜和黏膜下層可見大量蟲卵肉芽腫，并伴有廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，證實(shí)血吸蟲性結(jié)腸炎造模成功。感染組腹腔灌洗液中伊文思藍(lán)含量和白細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于正常對(duì)照組。說(shuō)明血吸蟲感染后血管通透性增加，白細(xì)胞穿透血管的能力增強(qiáng)，進(jìn)而誘發(fā)白細(xì)胞聚集，可能共同參與了血吸蟲腸病的發(fā)病過(guò)程。

小窩蛋白基因家族成員目前包括caveolin-1、caveolin-2和caveolin-3[7]。Caveolin-1廣泛分布表達(dá)于脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，參與細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)(跨細(xì)胞和細(xì)胞旁途徑)、膽固醇運(yùn)輸、血管生成等多種生理過(guò)程，并與腫瘤生成、病原體感染關(guān)系密切[8]。Caveolin-1還可調(diào)控血管通透性，已有研究[5,9]表明，在血腦屏障中caveolin-1可通過(guò)調(diào)節(jié)緊密連接蛋白水平維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定性；Xu等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，caveolin-1表達(dá)降低可下調(diào)緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-4的表達(dá)，可能是導(dǎo)致肺上皮屏障受損，進(jìn)而引起肺支氣管發(fā)育不良的主要機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，感染組小鼠caveolin-1 mRNA和蛋白表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著降低。由此可見，血吸蟲感染通過(guò)調(diào)控caveolin-1表達(dá)影響腸道微血管的緊密連接，進(jìn)而調(diào)控血管滲透性，誘發(fā)白細(xì)胞聚集，這種長(zhǎng)期反復(fù)的慢性炎癥可導(dǎo)致腸黏膜增生，最終導(dǎo)致腸纖維化。

緊密連接主要存在于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間的連接復(fù)合體中，對(duì)維持血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定性和腸黏膜屏障具有重要作用[11]。在急性肺損傷模型中，炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的緊密連接蛋白下調(diào)，不僅導(dǎo)致肺泡上皮屏障受損，還可加重毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致肺水腫進(jìn)一步加重[12]。occludin和claudin-1是緊密連接的主要功能蛋白之一。本研究發(fā)現(xiàn)，感染組occludin和claudin-1 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低，claudin-1蛋白表達(dá)明顯降低。說(shuō)明血吸蟲性結(jié)腸炎中caveolin-1表達(dá)下調(diào)，可能直接或間接影響occludin、claudin-1表達(dá)，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性。未來(lái)可通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)或沉默caveolin-1的質(zhì)粒，進(jìn)一步證實(shí)其與緊密連接蛋白之間的關(guān)系。

緊密連接蛋白還是構(gòu)成腸上皮屏障的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其表達(dá)下調(diào)可影響腸屏障功能，導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌、抗原易位，加重黏膜免疫的異常反應(yīng)，為IBD的主要發(fā)病機(jī)制之一[11,13]。因此，血吸蟲性結(jié)腸炎中occludin和claudin-1表達(dá)下調(diào)可能通過(guò)影響腸屏障功能，導(dǎo)致毒素入血，激活炎癥因子，進(jìn)一步加重腸黏膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但該結(jié)論有待研究進(jìn)一步證實(shí)。此外，caveolin-1為eNOS的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，caveolin-1基因敲除的小鼠體內(nèi)血管通透性增高，可能與eNOS活性上調(diào)、NO產(chǎn)生增多有關(guān)[3-4]。本研究結(jié)果顯示感染組和正常對(duì)照組eNOS mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異。推測(cè)caveolin-1對(duì)eNOS僅起“活性開關(guān)”的作用，其下調(diào)會(huì)激活eNOS，但對(duì)于eNOS基因表達(dá)并無(wú)影響[4]。

綜上所述，血吸蟲性結(jié)腸炎小鼠中caveolin-1和緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-1表達(dá)均顯著下調(diào)，可能通過(guò)影響腸道血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，誘發(fā)白細(xì)胞聚集，從而參與血吸蟲腸病的發(fā)病。這種長(zhǎng)期反復(fù)的慢性炎癥刺激，可導(dǎo)致腸黏膜增生，最終導(dǎo)致腸纖維化的發(fā)生。但血吸蟲腸病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，并非僅受單一基因調(diào)控和單一因素影響。此外，caveolin-1與緊密連接蛋白之間的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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(2016-10-17收稿)

Expressions and Significances of Caveolin-1 and Tight Junction Proteins in Schistosomiasis Colitis in Mice

ZHANGLin,LIJin,LINXue,XIAOJun.

DepartmentofGastroenterology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,HubeiClinicalCenter&KeyLabofIntestinal&ColorectalDiseases,Wuhan(430071)

XIAO Jun, Email: xiaojunzhongnan@163.com

Schistosomiasis; Colitis; Caveolin 1; Tight Junction Proteins

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.03.005

湖北省自然科學(xué)基金科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015CKB742)

#Email: zhanglin19910528@163.com

△本文通信作者，Email: xiaojunzhongnan@163.com

Background: Intestinal schistosomiasis is a kind of intravascular parasitic diseases, and chronic inflammation of colon is one of the basic pathological changes of the sickness. However, the mechanism of caveolin-1 and tight junction proteins in the pathogenesis of intestinal schistosomiasis is still unclear. Aims: To study the expressions and significances of caveolin-1 and tight junction protein occludin, claudin-1 in schistosomiasis colitis in mice. Methods: Forty BALB/c male mice were randomly divided into control group and infection group. Schistosomiasis colitis model was established by placing 40SchistosomaJaponicumcercarieon the abdomen. Mice were sacrificed after 8 weeks. HE staining was performed. The permeability of intestinal vascular endothelium was detected by Evans blue method. The leukocyte counts in peritoneal lavage fluid were measured. qPCR was used to determine the mRNA expressions of caveolin-1, occludin, claudin-1 and eNOS in colon tissue. Western blotting and immunohistochemistry were used to detect the protein expressions of caveolin-1 and occludin. Results: Large number of egg granuloma was observed in colon submucosa and accompanied by extensive inflammatory cells infiltration in infection group. Compared with control group, content of Evans blue and leukocyte counts in peritoneal lavage fluid were significantly increased (P<0.05); mRNA expressions of caveolin-1, occludin, claudin-1 were significantly decreased (P<0.01); protein expressions and positivity rates of caveolin-1 and occludin were significantly decreased in infection group (P<0.05). Conclusions: Down-regulation of expressions of caveolin-1, occludin and claudin-1 can induce leukocyte accumulation via increasing the permeability of intestinal vascular endothelial cells, thereby involving in the development of schistosomiasis colitis.